流行性出血病病毒血清分型RT-PCR方法的建立及应用

以决定流行性出血病病毒(EHDV)血清型的第二基因节段(Seg-2)为检测靶基因,设计7对特异性引物,建立用于鉴定EHDV血清型的RT-PCR检测方法,并通过对扩增产物的测序,进一步了解病毒Seg-2的遗传特性。特异性试验结果显示,该检测方法可准确鉴定不同血清型的EHDV毒株,与蓝舌病病毒、中山病病毒、阿卡斑病毒均无交叉反应;灵敏度试验结果显示,对不同血清型EHDV核酸的检测下限均可达10~2拷贝;对我国不同时间与不同地域分离的EHDV毒株进行血清型RT-PCR鉴定,结果显示分离的31株EHDV分属EHDV-1、-5、-6、-7与-10型等5种血清型,与血清中和试验的鉴定结果完全吻合。以上结果表明,该方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,可快速准确地鉴定EHDV毒株的血清型。     

传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒三重PCR检测方法的建立

【目的】建立可同时检测传染性脾肾坏死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）、鳜鱼蛙病毒（Siniperca chuatsi ranairidovirus,SCRIV）和鳜弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV）的三重PCR检测方法,为鳜鱼等养殖品种流行病学调查提供方法支撑。【方法】根据ISKNV MCP基因、SCRIV MCP基因和SCRV N基因设计3对特异性引物,对PCR扩增反应中的退火温度和引物用量进行优化,建立可同时检测 ISKNV、SCRIV和SCRV的三重PCR方法。为验证该方法的敏感性和特异性(备测病毒为IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV和SVCV),对22份疑似感染ISKNV、SCRIV和SCRV的样品分别进行单一和三重PCR检测。【结果】成功建立了三重PCR检测方法,利用该方法可同时检测ISKNV、SCRIV和SCRV,特异性较好,对IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV、SVCV等无扩增;该方法敏感性好,对3种病毒核酸的检测下限均为0.01 ng/μL;利用该方法和3种病毒单一PCR方法同时对22份临床样品进行检测,结果显示2种方法吻合率为100%,其中ISKNV阳性率为27%、SCRIV 阳性率为41%、SCRV阳性率为9%、ISKNV和SCRIV混合感染阳性率均为9%,无ISKNV、SCRIV和SCRV混合感染。【结论】建立的三重PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点,可对这3种病毒进行快速鉴别诊断。     

蓝舌病病毒 NS4 基因原核表达载体的构建与表达

蓝舌病病毒（Bluetounge virus，BTV）非结构蛋白4（Non-structural protein 4，NS4）拮抗干扰素的产生，在BTV逃避宿主天然免疫的过程中发挥重要作用。利用PCR扩增得到 NS4 基因，与空载体pET-32a双酶切后连接，构建pET-32a- NS4原核表达载体；将pET-32a- NS4转化至E.coli BL21感受态细胞，以IPTG诱导表达；利用SDS-PAGE确定IPTG的最佳诱导浓度、时间与重组蛋白的表达形式；利用Western blot分析重组蛋白的表达情况。结果表明，成功构建pET-32a- NS4原核表达载体；IPTG最佳诱导浓度为 0.8 mmol/L，时间为6 h，蛋白主要以包涵体形式表达；Western blot在27 ku处可见目的条带，与预期相符。本研究成功构建pET-32a- NS4原核表达载体，实现NS4蛋白的大量、高效表达，为进一步探究NS4蛋白在BTV拮抗宿主天然免疫中的作用机制提供材料。     

白狐源星状病毒RdRp基因的鉴定及遗传演化分析

目的 探究广州动物园一例死亡白狐Alopex lagopus肾脏中鉴定出的星状病毒的遗传变异情况。方法 对死亡白狐进行剖检,利用半巢式RT-PCR对内脏器官进行病原学检测,对扩增出的病毒株的RdRp基因序列进行相似性分析。结果 死亡白狐的肾脏苍白肿大,被膜难以剥离,肾脏中检测出的星状病毒RdRp基因呈阳性。RdRp基因与9株参考毒株的核苷酸相似性为67.5%～96.2%,其中与香港猫源星状病毒1637F的核苷酸相似性(96.2%)最高。结论 本研究为星状病毒在野生哺乳动物间的跨种传播及肠外器官中的感染提供了依据。     

猪萨佩罗病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立快速、特异、灵敏的猪萨佩罗病毒（porcine sapelovirus,PSV）TaqMan实时荧光定量（RT-qPCR）检测方法,为临床快速检测PSV提供新方法。【方法】参照GenBank中PSV的全基因序列,针对PSV 5′端保守区设计1对特异性引物,PCR扩增目的片段,将目的片段克隆至pMD 18T载体,构建阳性重组质粒,并以阳性质粒标准品为模板,建立标准曲线。在此基础上,设计特异性引物与探针,进行反应体系和反应条件优化,建立PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性和重复性进行验证。应用建立的方法对2018-2019年在河南不同地区猪场收集的83份样品（粪便样品39份,肠道样品44份）进行检测。【结果】建立了PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法的灵敏度为3.88×10¹拷贝/μL;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,特异性良好;批内与批间变异系数均小于1.0%,重复性较好。临床样品检测结果表明,TaqMan RT-qPCR检测PSV呈阳性的样品有31份（22份粪便样品,9份肠道样品）检出率为37.3%（31/83）,显著高于普通PCR检测结果（检出率12.0%（10/83））。【结论】建立了TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法灵敏度高,特异性好。     

猪圆环病毒3型和4型TaqMan双重实时荧光定量 PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测猪圆环病毒3型（PCV3）和 4 型（PCV4）的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法，根据 GenBank 已登录的 PCV3 和 PCV4 基因保守序列设计特异性引物和 TaqMan 探针，经优化各反应条件，构建标准曲线，分析其敏感性、特异性和重复性，并利用建立的荧光定量 PCR 方法对采自安徽省的临床样品进行检测，与普通 PCR 方法进行一致性评价。结果显示，PCV3的标准曲线为Y=-3.534 6 logX+41.11（R²=1.00），PCV4的标准曲线为Y=-3.382 5 logX+40.67（R²=1.00）。PCV3 和PCV4 的检测限分别为49.5 和27.1 copies·μL ^-1。对猪圆环病毒1型（PCV1）和 2 型（PCV2）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病毒（PRV）及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）无特异性扩增，组内和组间变异系数均＜1%。临床样品检测结果显示， PCV3阳性检出率为 40.8%，PCV4 阳性检出率为 20.4%，混合感染率为 19.0%。建立了灵敏、特异，可同时快速、准确鉴别PCV3和PCV4的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法，为PCV3和PCV4的检测和监测提供技术支撑。     

云南和广东省流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6)的分离与遗传特性

【目的】分离流行于我国南方地区的流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6),掌握分离毒株的遗传特征。【方法】对设立于我国云南和广东省的哨兵动物定期采血,进行EHDV感染情况监测与病毒分离培养。通过血清中和试验确定分离EHDV的血清型,采用一步法RT-PCR对分离的EHDV-6毒株基因节段2、3、6(Seg-2、-3、-6)进行扩增与序列分析。【结果】2012—2016年,从云南省和广东省的哨兵动物中分离出25株EHDV毒株,其中,11株为EHDV-6型。中国EHDV-6型毒株的Seg-2、-3与-6均属Eastern型,核酸序列相似性分别为99.1%、98.9%和98.8%,在系统发生树上分别聚为1个独立的中国支系。在日本引起疫病暴发的EHDV-6型毒株与中国EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系。日本EHDV-6型毒株在系统发生树上处于中国支系内部,Seg-2、Seg-3与中国毒株的核酸序列相似性分别为98.5%和93.9%。【结论】云南和广东省流行的EHDV-6型毒株核酸与氨基酸序列高度相似;日本和中国的EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系,提示中日之间可能存在EHDV的流动。研究结果为进一步开展我国EHDV-6型毒株流行病学分析、致病性、病原学诊断与疫苗制备等研究提供了基础。     

水稻条纹病毒安徽分离物NS3基因的克隆 及其RNA沉默抑制子功能的初步鉴定

采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒（RSV）安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。     

2013—2019年我国流行性出血病病毒血清1型毒株的分离与遗传特征分析

【目的】掌握流行性出血病病毒（Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV）血清1型毒株（EHDV-1）在我国南方地区的流行情况及其遗传特征,为开展EHDV-1血清型特异性诊断、流行病学调查和致病性研究提供科学依据。【方法】2013—2019年通过在我国云南、广东和广西设立牛羊虫媒病毒监控点和哨兵牛,定期采集哨兵牛血液样本进行虫媒病毒分离;通过微量中和试验确定EHDV分离株的血清型,然后对EHDV分离株的部分基因节段（Seg-2、Seg-3和Seg-6）进行RT-PCR扩增、双向测序及序列分析,并利用BioEdit计算EHDV基因组各节段核苷酸序列及其推导氨基酸序列的相似性。【结果】2013—2019年从云南、广东及广西的虫媒病毒监控点共分离获得33株EHDV,其中7株为EHDV-1型毒株。分离获得的7株EHDV-1型毒株Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列高度同源,其平均相似性分别为（97.65±1.51）%、（94.87±4.72）%和（97.61±1.41）%,对应的推导氨基酸序列相似性平均为（97.69±1.36）%、（99.49±0.32）%和（97.51±2.47）%。基于Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树均显示,不同EHDV-1型毒株可划分为东方（Eastern）和西方（Western）2种地域型,东方地域型毒株分离自中国、日本及澳大利亚,西方地域型毒株主要来源于美洲和非洲。在基于Seg-2核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株归属于西方地域型,且聚类形成一个相对独立的进化分支;在基于Seg-3核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株分属2种地域亚型（Eastern-1和Eastern-2）,分别与日本EHDV-1型和EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系;在基于Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株属于东方地域型,与日本EHDV-1型毒株具有较近的亲缘关系。【结论】EHDV-1型毒株已在我国南方地区广泛流行,其Seg-2和Seg-6序列分别具有最近的共有祖先病毒,而Seg-3序列来自不同的祖先病毒。西方地域型毒株Seg-2序列在我国流行EHDV-1型毒株中的出现,说明西方地域型毒株在侵入我国后可能与本土流行的毒株发生重配,即我国流行EHDV-1型毒株为西方地域型与东方地域型的重配型毒株,为防范强致病性西方地域型毒株传入我国而造成畜牧业重大经济损失提供了警示。     

甘蔗杂交种子传播甘蔗花叶病毒、高粱花叶病及黄叶病的检测

[目的]探究甘蔗杂交种子对甘蔗花叶病毒、高粱花叶病及黄叶病的传播性,为甘蔗抗病育种提供参考.[方法]采集父本或母本感染花叶病或黄叶病的甘蔗杂交种子样品10份,分别以SCMV、SrMV和SCYLV特异性引物进行一步法RT-PCR扩增、克隆和测序分析.对田间实生苗进行生物学观察,并采用RT-PCR检测其叶片SCMV、SrMV和SCYLV携带性.[结果]经特异性引物检测,10份杂交种子中仅有样品H4显示SrMV阳性,扩增的特异片段大小为828 bp,其核苷酸序列与GenBank中已报道的SrMV基因序列同源性达99％.聚类分析结果表明,样品H4的SrMV和GenBank中SrMV外壳蛋白序列的自举水平达100％,证实H4样本感染的病毒为SrMV.田间连续45 d观察均未发现出现病毒症的甘蔗幼苗;经RT-PCR检测,均未在10个样品实生苗叶片中发现此3种病毒.[结论]甘蔗种子可携带高粱花叶病(SrMV),但未能通过种子传播至实生苗.     

黑龙江省分蘖洋葱病毒病原的初步鉴定

黑龙江省分蘖洋葱病毒病发生普遍 ,阿城、宾县、五常的发病率均为 10 0 % ,病情指数分别为6 2 .13% ,71.0 7%和 4 9.87%。典型症状为黄化条纹花叶 ,叶片扭曲畸形、叶尖干枯 ,植株矮缩 ,鳞茎退化变小 ,产量和品质大幅度下降。被分蘖洋葱病毒系统感染的有洋葱、大葱、大蒜和蚕豆 ,局部感染的有千日红、苋色藜。电镜观察表明 ,病体细胞中含有大量线状病毒粒体 ,长度在 30 0～ 14 5 0 nm。通过叶片超薄切片 ,在叶肉细胞质中观察到大量的风轮状、束状、涡轮状和环状内含体 ,叶绿体被破坏。体外抗性测定结果表明 ,致死温度为 5 5～ 6 5℃ ,稀释限点为 10 - 4,体外保毒期为 3d。酶联免疫测试和洋葱黄矮病毒抗血清、韭葱黄条纹病毒抗血清、大蒜复合病毒抗血清呈阳性反应。以上特征证明 ,黑龙江省分蘖洋葱病毒病为几种病毒复合侵染 ,初步鉴定为洋葱黄矮病毒和韭葱黄条纹病毒。     

黑龙江省大蒜病毒病原鉴定及病毒病发生情况调查

黑龙江省大蒜病毒病的田间症状复杂,研究通过生物学技术、电子显微镜技术和血清学方法相结合对大蒜病毒病原进行鉴定,并对黑龙江省大蒜病毒病的发生情况进行了调查。结果表明,表现花叶症状的大蒜样品中含有韭葱黄条病毒(Leek yellow strape virus,LYSV)和大蒜潜隐病毒(Garlic latent virus,GarLV);表现黄化症状的大蒜样品中含有洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)和大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latentvirus,GCLV);表现卷叶症状的大蒜样品中含有GCLV、LYSV和OYDV。黑龙江省大蒜病毒病的发生相当严重,且多数为复合侵染,其中LYSV、GCLV和GarLV的检出率较高。     

网络病毒及其防御技术

随着信息社会的发展,通过计算机网络获取信息的方武也越来越普及,而且在各行各业发挥着至关重要的作用.因此,网络病毒的防治正成为计算机防毒领域的研究重点.本文首先指出网络病毒的概念,提出了目前常用的几种网络防病毒的重要技术和方法.     

CSFV和PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立及其应用

为建立一种能够同时快速诊断猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)2种传染病的方法,根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核苷酸序列,分别设计并合成2对能特异性扩增CSFV、PRRSV的引物,经过条件优化后,建立了检测CSFV、PRRSV的双重RT-PCR方法,扩增2种病毒的片段,大小分别为508bp和432bp.试验证明,该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,简便、快速、高效,为CSFV与PRRSV的快速诊断及进一步的CSFV与PRRSV的流行病学研究提供了重要的技术支持.     

整合猪瘟病毒囊膜蛋白的假型鼠白血病病毒感染性的研究

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪瘟病毒(CSFV)的E0、E2和E012基因并进行了克隆与鉴定。构建了真核表达载体pcDNA-E0、pcDNA-E2和pcDNA-E012,通过与鼠白血病病毒(MuLV)假型病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111瞬时共转染人胚肾细胞(293T),48h后收集假型病毒上清液,将假型病毒上清液超速离心后用抗CSFV的多抗进行Western-blot检测。结果证明E012蛋白能够在假型病毒颗粒表面表达,说明E012能够整合到此病毒粒子表面;用其感染多种宿主细胞,48h后检测发现在猪肾细胞(SK6,PK15)和猪睾丸细胞(ST)上,标记基因LacZ能有效表达,证实构建的CSFV假型病毒具有感染性。     

香蕉束顶病毒复制酶和黄瓜花叶病毒衣壳蛋白融合基因植物表达载体的构建

利用重组PCR技术将香蕉束顶病毒的复制酶基因和黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白基因融合重组,并与植物表达载体pBI121连接,构建了抗香蕉束顶病和香蕉花叶病的双价植物表达载体,通过冻融法转化载体人根癌农杆菌LBA4404,获得了工程农杆菌pBI121．FBC,从而为培育抗病转基因香蕉品种奠定了基础．     

陕西辣椒病毒病的毒原鉴定及化学防治药剂筛选

分别从陕西咸阳、兴平、杨凌、柔谷、眉县、岐山、凤翔等地采集辣椒病毒病标样126份,在室内通过单斑分离及回接验证得到5种分离物,采用鉴别寄主的生物学反应和DA S-EL ISA法鉴定,结果表明,引起陕西辣椒病毒病的毒原有黄瓜花叶病毒(CM V)、烟草花叶病毒(TM V)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病毒(PVY)和蚕豆萎蔫病毒(BBW V),其中CM V和TM V是优势毒原种群,分别占检测样品的60.31%和30.94%。在室内分别以CM V和TM V的枯斑寄主苋色藜和心叶烟为测试寄主,采用半叶法对接种叶片分别于接种前和接种后涂施病毒抑制剂,测试了7种病毒抑制剂的抑制效果。结果表明,接种前后涂施3.85%病毒必克水乳剂500倍液,均对黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒有很好的防治效果,且接种前涂施的防治效果较接种后涂施的防治效果好。     

豇豆花叶病毒和黑眼豇豆花叶病毒RT-Realtime PCR及IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

建立了豇豆两种种传病毒豇豆花叶病毒(CPMV)和黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)RT-Realtime PCR检测方法以及双重RT-Realtime PCR检测方法。在此基础上,根据免疫学抗原抗体特异性吸附的特点,建立了CPMV和BlCMV免疫捕获反转录荧光定量(IC-RT-Realtime)PCR检测方法以及双重IC-RT-Realtime PCR检测方法。该单重及双重IC-RT-Real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点,适用于豆类种苗中对CPMV和BlCMV的检测。     

百合致病病毒及脱毒技术的研究进展

百合病毒病是当前制约百合产业发展的主要瓶颈之一,深入了解百合病毒的种类和致病的作用机制,可为百合感病种球的早发现、快速检测以及百合无毒种球筛选提供支持。本文介绍了常见的百合致病病毒种类、病毒检测技术以及脱毒技术等方面的研究进展,并根据研究结果对开发无毒百合种球的新型筛选和检测技术进行展望,以期为促进百合产业健康快速发展提供参考。