2013—2019年我国流行性出血病病毒血清1型毒株的分离与遗传特征分析

【目的】掌握流行性出血病病毒（Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV）血清1型毒株（EHDV-1）在我国南方地区的流行情况及其遗传特征,为开展EHDV-1血清型特异性诊断、流行病学调查和致病性研究提供科学依据。【方法】2013—2019年通过在我国云南、广东和广西设立牛羊虫媒病毒监控点和哨兵牛,定期采集哨兵牛血液样本进行虫媒病毒分离;通过微量中和试验确定EHDV分离株的血清型,然后对EHDV分离株的部分基因节段（Seg-2、Seg-3和Seg-6）进行RT-PCR扩增、双向测序及序列分析,并利用BioEdit计算EHDV基因组各节段核苷酸序列及其推导氨基酸序列的相似性。【结果】2013—2019年从云南、广东及广西的虫媒病毒监控点共分离获得33株EHDV,其中7株为EHDV-1型毒株。分离获得的7株EHDV-1型毒株Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列高度同源,其平均相似性分别为（97.65±1.51）%、（94.87±4.72）%和（97.61±1.41）%,对应的推导氨基酸序列相似性平均为（97.69±1.36）%、（99.49±0.32）%和（97.51±2.47）%。基于Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树均显示,不同EHDV-1型毒株可划分为东方（Eastern）和西方（Western）2种地域型,东方地域型毒株分离自中国、日本及澳大利亚,西方地域型毒株主要来源于美洲和非洲。在基于Seg-2核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株归属于西方地域型,且聚类形成一个相对独立的进化分支;在基于Seg-3核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株分属2种地域亚型（Eastern-1和Eastern-2）,分别与日本EHDV-1型和EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系;在基于Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株属于东方地域型,与日本EHDV-1型毒株具有较近的亲缘关系。【结论】EHDV-1型毒株已在我国南方地区广泛流行,其Seg-2和Seg-6序列分别具有最近的共有祖先病毒,而Seg-3序列来自不同的祖先病毒。西方地域型毒株Seg-2序列在我国流行EHDV-1型毒株中的出现,说明西方地域型毒株在侵入我国后可能与本土流行的毒株发生重配,即我国流行EHDV-1型毒株为西方地域型与东方地域型的重配型毒株,为防范强致病性西方地域型毒株传入我国而造成畜牧业重大经济损失提供了警示。     

中国蓝舌病病毒血清15型毒株的全基因组测序与进化分析

【目的】获取中国蓝舌病病毒血清15型(BTV-15)毒株的全基因组序列并分析其遗传特征。【方法】通过全长c DNA扩增与高通量测序技术获取中国1996年分离的BTV-15型毒株B105/YN/1996的全基因组序列,进行序列比对并构建系统发生树。【结果】序列分析结果显示:B105/YN/1996毒株基因组全长19 154 bp,各基因节段长度在822 bp (Seg-10)～3 944 bp (Seg-1)之间,编码蛋白大小在216 (NS3a蛋白)～1 302 (VP1蛋白)个氨基酸残基之间。B105/YN/1996毒株的Seg-1、-2、-3、-4、-6与澳大利亚2012年分离BTV-15型毒株的对应基因节段之间具有最近的亲缘关系,Seg-7、-8、-9、-10则与中国BTV-15型V447毒株、BTV-4型YTS4毒株和BTV-1型Y863毒株的序列相似度最高;Seg-5与印度BTV-1型毒株IND1992/02具有最近的亲缘关系。在构建的系统发生树上,B105/YN/1996毒株的Seg-2与Seg-6归属于东方型,Seg-3与Seg-4则构成独立远东型;Seg-7、-10分别构成独立东方-1与东方-2型。【结论】中国BTV-15型毒株B105/YN/1996的不同基因节段在遗传进化上呈现高度多样性的特点,提示该毒株为基因重配毒株;该毒株的Seg-3、-4、-7、-10形成了独特的地域型,提示中国BTV-15型毒株在进化上的特殊性。     

流行性出血病病毒血清分型RT-PCR方法的建立及应用

以决定流行性出血病病毒(EHDV)血清型的第二基因节段(Seg-2)为检测靶基因,设计7对特异性引物,建立用于鉴定EHDV血清型的RT-PCR检测方法,并通过对扩增产物的测序,进一步了解病毒Seg-2的遗传特性。特异性试验结果显示,该检测方法可准确鉴定不同血清型的EHDV毒株,与蓝舌病病毒、中山病病毒、阿卡斑病毒均无交叉反应;灵敏度试验结果显示,对不同血清型EHDV核酸的检测下限均可达10~2拷贝;对我国不同时间与不同地域分离的EHDV毒株进行血清型RT-PCR鉴定,结果显示分离的31株EHDV分属EHDV-1、-5、-6、-7与-10型等5种血清型,与血清中和试验的鉴定结果完全吻合。以上结果表明,该方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,可快速准确地鉴定EHDV毒株的血清型。     

云南省边境地区哨兵牛芒市病毒的分离与鉴定

目的 掌握云南省边境地区动物虫媒病毒的多样性分布和传播风险。方法 在云南省景洪市设立哨兵牛3头,每周1次采血进行虫媒病毒的监测与分离。通过电镜观察、基因组琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR与克隆测序对分离病毒进行鉴定,采用实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。结果 2019年,在监测期第13周,从1头哨兵牛的血液中分离出1株致C6/36细胞病变的病毒(V301/YNJH/2019),电镜观察可见直径约70 nm、呈二十面体对称结构的病毒粒子,琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组为双链RNA,RT-PCR鉴定分离毒株为芒市病毒(MSV)。测序显示,分离毒株的基因节段Seg-4和Seg-7长度为2 055和1 122 bp,编码病毒的外层衣壳蛋白VP4(628 aa) 和VP7(298 aa),基因节段Seg-2和Seg-9长度为3 055和1 076 bp,编码病毒的内层衣壳蛋白VP2(956 aa) 和VP9(283 aa);分离毒株与云南省芒市分离的MSV/DH13M041毒株具有最近的亲缘关系,核酸序列相似度在97.4% (Seg-9)~98.5% (Seg-2)之间,氨基酸序列相似度在96.4%(VP9)~98.4%(VP2)之间。病毒感染的回溯分析显示,监测期的第11周,牛血液中病毒核酸检测呈阳性,病毒核酸含量在第13周达到高峰,随后快速降低,在第18周转为阴性;感染哨兵牛在监测期的第13周已产生特异性中和抗体(1∶14),在第16~18周处于高峰(1∶226),至监测结束的第24周降低为1∶57。结论 本文从牛体中分离到了MSV,表明牛是MSV的易感动物之一,病毒在感染牛上呈“一过性感染”的特征。研究结果为进一步开展MSV的检测诊断、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。     

珠三角地区鸭坦布苏病毒的全基因序列测定与分析

【目的】了解2010年以来分离于珠三角地区鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu virus,DTMUV)GDNS2010.1、GDNS2010.2、GDZQ2012、GDPY2013株的分子特征.【方法】参考Gen Bank收藏的DTMUV JS804株,共设计合成11对特异性引物,扩增了4株病毒的全基因序列片段.【结果和结论】4株病毒全长约为10 990 bp,无Ploy(A)尾结构,仅含有1个大的ORF,共编码3 426个氨基酸,5'非编码区(5'UTR)各含有94 bp.在3'非编码区(3'UTR),GDNS2010.1、GDNS2010.2毒株在103 395~103 411 bp处缺失10个碱基.联合前期试验已测定的2株病毒序列(GDHZ2012.1、GDHZ2012.2),用DNAstar和MEGA6.0序列分析软件将6株病毒同Gen Bank收藏的国内的其他坦布苏病毒株比对,发现核酸序列相似性在98%以上,与Ntaya病毒和Sitiawan病毒相似性较大,相似性都在73%左右;与西尼罗河病毒、日本乙型脑炎病毒、黄热病毒等相似性皆低于63%.6株病毒囊膜蛋白E核酸序列相似性为97.5%~99.9%,推导氨基酸序列相似性在97%以上,其中同一地区分离的毒株相似性最高,达99.9%;在囊膜蛋白E154位存在一潜在的糖基化位点Asn-Try-Ser,在E蛋白结构域Ⅱ第E289位,极性带正电荷的Lys变为极性带负电荷的Glu,推测这一位点可能为病毒的毒力位点.     

Ⅰ群禽腺病毒血清4型广东株的分离鉴定及分子特性

【目的】对广东地区疑似心包积液–肝炎综合征患病鸡进行腺病毒分离鉴定并研究其分子特征。【方法】采集的病料样品,通过鸡胚有限稀释法经SPF鸡胚传代分离纯化病毒,进行致病性试验,并对病毒的hexon、fiber-2、ORF19和ORF29基因进行PCR扩增,分析其分子特征。【结果】hexon基因序列分析显示此次分离的毒株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型(命名为WM-XC株),SPF鸡接种分离毒株后,致死率达90%,死亡鸡只出现明显的心包积液、肝炎等变化,肝脏病理切片可观察到明显的嗜酸性包涵体,显示分离毒株具有致病性。fiber-2基因序列同经典毒株ON1和KR5相应序列的相似性达96.1%和97.0%,与2015年以来国内分离的毒株序列相似性则达到100%;ORF29序列与2013年国内分离到的毒株JSJ13和JN13的相应序列相比存在33个碱基的缺失;WM-XC分离株与2015年以来国内分离毒株序列相同,但相比经典株ON1和KR-5,缺失ORF19序列。【结论】此次从广东地区分离到的血清4型Ⅰ群腺病毒,和近年国内其他地区分离的流行毒株一样,其fiber-2、ORF19和ORF29基因序列与经典毒株差异明显。     

鸡新城疫病毒分离株F基因的分子特性分析

【目的】对新城疫病毒(NDV)分离毒株进行分子特征分析,了解免疫鸡群发生新城疫的原因。【方法】用非免疫鸡胚从病鸡肺脏中分离新城疫病毒;参考GenBank上发表的NDV的F基因序列设计引物,应用RT-PCR方法对新城疫病毒分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行F基因核苷酸及推导氨基酸序列分析。【结果】从发病鸡群中分离到6株NDV,分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%;分离毒株与参考毒株的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%;分离毒株F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;6个分离株均属NDV基因Ⅶ型。【结论】NDV分离株的F基因已经发生明显变异,与La Sota、Clone-30、V4等常用疫苗株在遗传进化上的亲缘关系较远,这可能是免疫鸡群发生新城疫的重要原因之一。     

基于cytb基因探讨家绵羊和多角绵羊的系统发育

 【目的】研究中国家绵羊起源进化以及多角绵羊和普通家绵羊的亲缘关系。【方法】测定8个省区42个绵羊个体的细胞色素b基因全序列。【结果】本试验的绵羊个体可定义为40个单倍型,单倍型多样度为0.997±0.006,核苷酸多样度为0.793%。中国绵羊群体可分为4个支系(A、B、C 和D),其中支系D首次在中国绵羊群体中被检测到;支系B与支系C的差异最大,分化时间大约为595±150万年。多角绵羊与家绵羊聚在一起,而与野绵羊亲缘关系较远,分属于支系A、B和D。【结论】系统发育分析表明,中国绵羊有多个母系起源或经过多次驯化,未发现盘羊、东方盘羊和亚洲摩佛伦羊与绵羊母系祖先形成相关的分子证据。     

H6N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及其序列分析

设计特异引物,采用RT-PCR技术,成功从本实验室分离、保存的H6N2禽流感病毒毒株(HB 2002)中克隆到血凝素基因(HA)序列,该克隆基因全长1 714 bp,提交GenBank,获得登录号DQ 285546.同部分H6,H5,H7,H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析表明,该基因核酸、氨基酸序列与A/duck/Hainan/4/2004(H6N2),A/duck/Hong Kong/3600/99(H6N2)毒株有99%的相似性;分子进化分析结果显示,该基因与此2毒株亲缘关系最近.由该克隆核酸序列推导的HA蛋白共566个氨基酸,该蛋白同其他H6亚型AIV的HA蛋白有相同裂解位点序列即PQIETR↓ G,无高致病性毒株典型的裂解位点特征,因此,初步判定毒株HB 2002为低致病性禽流感病毒.     

宁强矮马线粒体DNA D-loop区的遗传多样性

【目的】研究宁强矮马线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）D-loop区的遗传多样性及其母系起源进化,为其遗传资源保护提供理论数据。【方法】采用PCR和测序技术分析12匹宁强矮马mtDNA D-loop区的600 bp核酸序列,并基于mtDNA D-loop区序列将宁强矮马和NCBI公布的其它马种进行系统树构建。【结果】宁强矮马群体存在9种单倍型,检测到34处SNP位点,占所分析位点总数的5.67%,各单倍型间的遗传距离为0.002—0.035,单倍型多样性为0.978±0.054,核苷酸多性为0.01988±0.00818。聚类分析表明宁强矮马分布在4个支系中,与胡克尔马、设特兰马、德保马、蒙古马和车巨马亲缘关系较近,与纯血马、云南马和韩国济州岛本土马的亲缘关系较远。【结论】宁强矮马具有比较丰富的遗传多样性,在进化的历史过程中受到其它马种的影响较大。     

南方根结线虫寄生真菌的分离和鉴定

 1992年和1993年,在广东和广西采集南方根结线虫样品44个,分离129个菌株,它们分属9属18种.     

土壤中棒束孢菌的生物多样性及对黄曲条跳甲的活性

目的 调查国内部分地区不同土壤中棒束孢属Isaria真菌的多样性分布,测定其对黄曲条跳甲Phyllotreta striolata的生物活性,促进棒束孢菌对黄曲条跳甲的生防应用。方法 从福建、广东、广西、云南、贵州、湖南、湖北、河南、河北等地的不同生境中采集土壤样品,通过选择培养基分离纯化棒束孢菌株,根据形态学和分子标记鉴定菌种,采用多样性指数与优势度指数评价生物多样性;采用浸虫法测定棒束孢菌株对黄曲条跳甲成虫的生物活性。结果 从200余份土壤样品中分离得到棒束孢属真菌41株,优势菌种是爪哇棒束孢Isaria javanica,有34株,优势度指数为0.829;玫烟色棒束孢I. fumosorosea有5株,粉棒束孢I. farinosa和环链棒束孢I. cateniannulate各1株。林地物种丰富度最高,多样性指数为1.121,休耕地、果园、耕地和草地的多样性指数范围为0~0.349;林地种间分配最均匀,优势度指数为0.468,休耕地、果园、耕地和草地的优势度指数范围为0~0.159。生测结果表明,大部分供试的棒束孢菌株对黄曲条跳甲都有一定活性,玫烟色棒束孢IfH6102菌株对黄曲条跳甲的活性最高,在处理黄曲条跳甲成虫11 d后,其校正死亡率达60.89%。结论 棒束孢菌在我国土壤中分布广泛,林地生境中的物种多样性最丰富,棒束孢菌具有防治黄曲条跳甲的应用潜力。     

中国蛾类两新记录种(鳞翅目:枯叶蛾科,尺蛾科)

报道了采自广东及云南的枯叶蛾科和尺蛾科2个中国新记录种，即冥枯叶蛾Cerberolebeda styz Zolotuhin,1995和橙蝶尺蛾Thinoperyx citrina Warren,1894。     

云南省镰刀菌属(Fusarium) 种类鉴定

 本文报导了云南省镰刀菌属的一些种类,包括11组、19个种。4个变种和7个专化型,并列出它们的寄主和基质。标本采自云南省的59个县、7个市郊和川、黔、桂、粤的个别地方。所有菌种都经过实验室分离(钅监)定,部分菌种作了温室接种实验,少数菌株做过生理特性的研究。     

不同植胶环境下胶园单位面积存株类型调查与初步分析

在海南、云南、广东不同植胶环境下,分别调查了热研7-33-97、PR107和RRIM600、GT1、东方93-114、INA873等橡胶树品种不同割龄胶园单位面积存株情况,结果表明,各胶园单位面积存株类型所占比重依次为：有效割胶株（69.5%）>割线干涸及产量挖潜株株（16.8%）>缺株（6.4%）>风害停割株（3.5%）>寒害停割株（2.0%）>林下株（1.8%）。对不同植胶环境下胶园单位面积有效割株的影响因素以及相应的栽培管理改进措施进行了分析探讨。     

不同地区香蕉枯萎病菌4号生理小种生物学特性及ITS序列分析

香蕉枯萎病菌4号生理小种的传入给我国香蕉产业带来严重威胁。利用核糖体基因(rDNA)及其内转录间隔区(ITS)序列分析对采自广东省和云南省不同地理环境的香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株进行系统发育研究。结果表明,广东和云南两省菌株的遗传距离为0.002,两省菌株的同源性高达99.8%,以NJ法建立系统树分析表明,云南和广东两省菌株的亲缘关系很近,但仍存在一定差异。广东、云南不同地区菌株的生物学基本特性比较研究表明,两地区菌株在生长速率、菌落直径和产孢量等方面差异较大。与采自广东的菌株相比,采自云南的菌株接种香蕉后发病较早、产孢量高。此外,采自广东的菌株略嗜酸性,云南地区的菌株略嗜碱性。     

不同营养因子对土壤细菌可培养物种多样性的影响

通过在改良的VL55培养基中添加6种不同的营养因子,利用大量稀释法对采自河北、青海和云南的3份土壤样品进行细菌分离,并对所分离菌株进行16S r RNA基因序列系统发育分析,比较利用不同营养因子分离的可培养细菌物种多样性。结果表明,添加营养因子分离得到的细菌物种多样性明显高于对照;土样1对照分离得到5个属,添加6种营养因子的处理共分离得到22个属;土样2对照分离得到2个属,添加6种营养因子的处理共分离得到17个属;土样3对照分离得到6个属,添加6种营养因子的处理分离得到15个属。添加不同营养因子的培养基组合分离得到各自独特的细菌类群。其中,从青海土样中分离得到的菌株HBUM200206与运动东菌(Dongia mobilis)LM22T的亲缘关系最近,序列相似性为94.58%,可能是红螺菌科(Rhodospirillaceae)的一个潜在新属。此外,有12株菌与亲缘关系最近的模式菌株的16S r RNA基因序列相似性均小于98.65%,可能为潜在的新种。     

中国山龙眼科植物分类与分布

通过野外观测、标本采集、室内综合研究,对中国山龙眼科植物的分类进行了整理。最终得出,中国山龙眼科植物共8属45种3变种。其中原产2属21种3变种,分布于云南、西藏、江西、贵州、广东、湖南、广西、福建、台湾、海南10省区;引进已广泛栽培2属3种,栽培于南方各省;引进处于栽培试验阶段4属21种。     

我国部分地区鸡致病性大肠杆菌的耐药性检测与分析

用氟苯尼考、氧氟沙星等12种抗菌药物对从东北、河北、山东、华东等地部分鸡场分离的21株鸡致病性大肠杆菌进行药物敏感性测定。结果表明,分离菌对阿莫西林的耐药性最高,为100%,余下依次为四环素95.24%、诺氟沙星85.71%、多西环素66.67%、氧氟沙星61.9%、硫酸链霉素61.9%、环丙沙星57.14%、氟苯尼考57.14%、红霉素38.1%、硫酸庆大霉素23.89%、新霉素19.05%、阿米卡星19.05%。分离菌表现出多重耐药性,7重耐药菌株最多,达6株(28.57%),4重、5重、6重耐药各3株(14.29%),8重、11重耐药的各2株(9.52%),9重、10重耐药的各1株(4.76%)。