DNA条形码及其在动物遗传多样性中的应用

DNA条形码技术是现今生物分类学中重要的分子技术之一,其利用线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(COⅠ)等基因可以快速准确地鉴定新种和隐存种。COⅠ基因存在于所有动物中,呈母系遗传、比较保守、无内含子、进化速率比较快(是核基因进化速率的2～10倍)、具有明显的碱基偏好性,而且其DNA序列很少存在插入和缺失。DNA条形码技术不仅是生物形态学研究的一个重要补充,而且为研究生物分类与进化开辟了新的途径。本文就DNA条形码技术的技术原理、操作步骤及其在动物分类学及遗传多样性中的应用作一概述,旨在通过对其技术原理了解的同时,掌握其在当代生物分类学中的独特作用、现实意义及局限性,为进一步开展生物分类及进化研究提供思路。     

DNA条形码与生物分类学研究

DNA条形码是一段特殊的、可用于物种鉴定的DNA序列.是近几年来国际上生物分类学研究的热点.该技术在动物分类学研究中已得到广泛的应用,所采用的DNA序列是线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ号基因(CO Ⅰ)的部分序列.在植物分类学研究中,DNA条形码的进展相对缓慢.目前尚处于对所提议的叶绿体DNA片段rpoB、rpoCl、matk、rbcL等进行比较和评价阶段.阐述了DNA条形码在生物分类学研究方面的应用现状、存在的问题及可能的发展趋势.     

DNA条形码在柞树主要鳞翅目害虫种类鉴定中的应用

鳞翅目昆虫是柞树的重要害虫类群。为了提高柞园鳞翅目害虫早期测报效率和准确度,建立了以线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)为标准基因的DNA条形码物种快速鉴定技术。应用该技术对从柞园采集的11种鳞翅目害虫的卵和蛹基因组DNA样品进行PCR及产物测序,得到了供试鳞翅目昆虫卵和蛹594~708 bp长的DNA条形码标准基因。同一种昆虫卵和蛹的DNA条形码序列存在0~2个碱基差异,序列一致度在99.7%~100%之间。供试鳞翅目昆虫DNA条形码序列碱基A、T、G和C的平均含量分别为30.7%、38.5%、14.9%和15.9%。获得的DNA条形码序列与Gen Bank数据库中同源序列相似度性最高物种的DNA条形码序列一致度在91.4%~100%之间,差异度在0~8.6%之间,其中有10种鳞翅目昆虫的卵和蛹的样品(编号1~20)与Gen Bank数据库中同源序列的一致度在99%~100%之间,差异度为0~1.0%,只有1种鳞翅目昆虫的卵和蛹样品(编号21、22)与Gen Bank数据库中同源序列的差异度较大,为8.6%。结果表明:应用建立的DNA条形码技术,可以根据天幕毛虫等鳞翅目害虫的卵和蛹基因组DNA快速、准确地对害虫进行种类鉴定。     

3个地方鸡种线粒体DNA COⅠ基因条形码遗传多样性研究

以大骨鸡、安义瓦灰鸡和金湖乌凤鸡3个地方鸡种为研究对象,利用DNA测序技术测定了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidaseⅠ COⅠ)基因序列,以揭示3个地方鸡种COⅠ基因的遗传多样性。结果表明,选择的这段COⅠ基因序列在3个地方鸡种中有3个突变位点,为4个单倍型。大骨鸡、瓦灰鸡和金湖乌凤鸡品种内平均多态性分别为0.15%,0.3072%,0.3073%。3个地方品种单倍型多样度范围为0.2222-0.5030,平均为0.3954。瓦灰鸡遗传多样性相对较丰富,大骨鸡相对较贫乏。3个鸡种群体间的Kimura双参数遗传距离范围为0.060~0.077;瓦灰鸡群体内的遗传距离最大,为0.089。3个品种的DNA分类和形态学分类基本一致,该基因可以探讨地方鸡种分类问题。     

一种驴和马及狐狸源性成分快速检测方法的研究

实验旨在建立快速检测驴、马和狐狸源性成分的方法。以驴、马和狐狸的线粒体保守序列16S r RNA基因为靶基因,设计通用引物和以不同荧光素标记的特异Taq Man探针,构建与通用引物共用的阳性扩增内标(Internal Amplification Control,IAC)作为PCR监控反应体系。通过优化PCR反应体系和条件,建立能同时检测驴、马和狐狸源性成分的四重实时荧光PCR方法。结果表明:利用驴、马、狐狸、牛、猪、羊、水貂、狗、鸡、鸭、大豆、小麦、玉米等物种检测没有交叉反应,证明该方法特异性高,准确性好。该方法模板DNA检测灵敏度为0.01 ng。本研究建立的驴、马和狐狸源性四重荧光实时PCR检测体系灵敏度高、特异性强,能有效鉴别动物产品中驴、马和狐狸的源性成分,也可用作相关动物皮张真伪的鉴别方法。     

3个地方鸡种线粒体D A COⅠ基因条形码遗传多样性研究

以大骨鸡、安义瓦灰鸡和金湖鸟凤鸡3个地方鸡种为研究对象,利用DNA测序技术测定了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytoclarome c oxidase Ⅰ C0 Ⅰ)基因序列,以揭示3个地方鸡种CO Ⅰ基因的遗传多样性.结果表明,选择的这段CO Ⅰ基因序列在3个地方鸡种中有3个突变位点,为4个单倍型.大骨鸡、瓦灰鸡和金湖鸟凤鸡品种内平均多态性分别为0.15%,0.3072%,0.3073%.3个地方品种单倍型多样度范围为0.2222-0.5030,平均为0.3954.瓦灰鸡遗传多样性相对较丰富,大骨鸡相对较贫乏.3个鸡种群体间的Kimura双参数遗传距离范围为0.060～0.077;瓦灰鸡群体内的遗传距离最大,为0.089.3个品种的DNA分类和形态学分类基本一致,该基因可以探讨地方鸡种分类问题.     

橡实象虫等25种昆虫线粒体COⅠ基因的遗传多样性及系统进化分析

橡实象虫(Curculio arakawai)是象甲科中危害柞树种子和嫩芽的重要害虫。为探讨利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的特定区段作为DNA条形码快速准确识别橡实象虫的可行性,克隆了3个橡实象虫线粒体COⅠ基因5'端长度约556 bp的片段(GenBank登录号:JN258957,JN258958,JN258959),并与鞘翅目、鳞翅目、双翅目共24种昆虫的同源片段进行碱基组成多样性和系统进化分析。序列分析结果显示:橡实象虫与其它24种昆虫的COⅠ基因序列呈现丰富的遗传多样性,碱基位点的变异率为48.2%,序列平均差异为19.7%;COⅠ基因序列的AT含量(69.9%)明显高于GC含量(30.1%),存在显著的AT使用倾向性;碱基替换模式颠换大于转换,碱基替换数与物种两两遗传距离呈明显的线性关系;COⅠ基因序列的碱基变异速率较快的位点主要集中在序列中间区域的210～390 bp。基于COⅠ基因序列构建的NJ、ME和MP系统进化树均显示橡实象虫与鞘翅目象甲科(Curculionidae)昆虫的进化关系最近,聚在一起形成一个分支,鳞翅目等其它昆虫聚在一起形成另外一个分支;橡实象虫与鞘翅目象甲科Kyklioacalles属昆虫间遗传距离最小,与鳞翅目丝角蝶科Macrosoma sp.属昆虫间的遗传距离最大。根据COⅠ基因序列的多样性,能将橡实象虫明显地与其它昆虫区分开。     

基于线粒体COⅠ基因的2个新发现鸡种资源DNA编码研究

以中国2个新发现鸡种资源金湖乌凤鸡、安义瓦灰鸡及地方鸡种狼山鸡为研究对象,利用DNA测序技术测定了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase Ⅰ,COⅠ）基因序列,揭示2个新发现资源COⅠ基因的遗传多样性及其与地方鸡种的遗传关系。结果显示,选择的这段COⅠ基因序列在2个新发现资源和狼山鸡中有10个突变位点,为7个单倍型,其中有3个为特异性突变位点,5个特异性单倍型。金湖乌凤鸡、安义瓦灰鸡和狼山鸡群体内平均核苷酸多样度（Pi）分别为0.068%;0.051%和0.0369%,单倍型多样度（H）分别为0.4167、0.3030和0.9000。狼山鸡的遗传多样性大于2个新发现资源。3个地方鸡群体间的Kimura双参数遗传距离范围为－0.002～0.236;种间遗传距离小于种内遗传距离。结果表明,利用COⅠ这一特定基因的特定区段来做DNA条形编码的基础,进行不同鸡品种鉴定具有方便、快捷、经济、准确等优点,是可行和有效的。     

3个地方鸡种线粒体DNA COⅠ基因条形码遗传多样性研究

以大骨鸡、安义瓦灰鸡和金湖乌凤鸡3个地方鸡种为研究对象,利用DNA测序技术测定了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidaseⅠCOⅠ）基因序列,以揭示3个地方鸡种COⅠ基因的遗传多样性。结果表明,选择的这段COⅠ基因序列在3个地方鸡种中有3个突变位点,为4个单倍型。大骨鸡、瓦灰鸡和金湖鸟凤鸡品种内平均多态性分别为0．15％,0．3072％,0．3073％。3个地方品种单倍型多样度范围为0．2222—0．5030,平均为0．3954。瓦灰鸡遗传多样性相对较丰富,大骨鸡相对较贫乏。3个鸡种群体间的Kimura双参数遗传距离范围为0．060～0．077;瓦灰鸡群体内的遗传距离最大,为0．089。3个品种的DNA分类和形态学分类基本一致,该基因可以探讨地方鸡种分类问题。     

饲料中马、驴源性成分的分子生物学检测技术

根据马、驴线粒体DNA中的保守区段设计了一对引物，通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）可以专一地检测扩增出马、驴源性成分的DNA片段，再经限制性内切酶Sau 3A和Alu Ⅰ的酶切鉴定可以区分马源性成分和驴源性成分．PCR扩增产物的测序结果验证了酶切鉴定结果的正确性。引物灵敏度测试培果表明该方法的检测低限均达0．3％．该对引物可以成为检测马、驴源性成分高效准确的检测工具。     

蒙古家马和蒙古野马线粒体细胞色素b基因遗传多样性及系统进化分析

通过对马的线粒体细胞色素b（Cytb）基因序列的遗传变异分析,来探讨蒙古家马、蒙古野马和驴之间的亲缘关系和遗传多样性。对各类马和驴样本 mtDNA Cytb 基因进行PCR扩增和测序,运用现代分子生物学软件进行数据处理。结果共检测到15个单倍型,90个突变位点,单倍型多样性（Hd）为0.9356,核苷酸多样性（Pi）为0.01022,平均核苷酸差异数（K）为8.966,各群体间的遗传多样性相差不大。系统发育树和NETwork图中每一分支都至少包含2个群体的信息。4个类型蒙古家马总体上具有较高的遗传多态性,蒙古家马与蒙古野马之间的亲缘关系较近, 且出现数个分支,蒙古家马分布在各独立的进化支中,说明蒙古家马母系来源非常广泛或经过多次驯化。     

家养山鸡线粒体基因组全序列测定及其结构分析

采用PCR方法测定家养山鸡线粒体基因组全序列并进行数据分析。结果显示,家养山鸡线粒体基因组序列全长16 694 bp,共有13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和1个D-Loop区。基因组的组成、顺序、编码链的选择、tRNA的结构都与绝大多数鸟类相同或相近。家养山鸡线粒体基因组碱基组成分别为A 30.62%、T 25.27%、C 30.87%、G 13.24%,总(A+T)含量为55.89%。除COⅠ基因的起始密码子是GTG,其余12个蛋白质编码基因的起始密码子都是ATG。tRNA基因核苷酸长度为65~78 nt,12 S rRNA和16 S rRNA基因分别为966 nt和1 621 nt。     

橡实象虫及其近缘种基于线粒体DNA COⅡ基因的分子系统学研究

橡实象虫(Curculio arakawai)是危害柞树果实(橡实)和嫩芽的主要害虫。基于探索害虫的系统发育和遗传进化机制的目的,以线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)编码的细胞色素氧化酶Ⅱ(cytochrome oxidaseⅡ,COⅡ)基因作为分子标记,对橡实象虫及10个近缘种昆虫进行分子系统学研究。序列分析表明:橡实象虫及10个近缘种的mtDNA COⅡ基因序列全长687bp(不同橡实象虫样本获得的目的基因在GenBank的登录号包括GU945544、GU945545、GU945546),共编码228个氨基酸;mtDNA COⅡ基因表现出明显的A+T含量偏向性,密码子不同位点碱基的使用也存在明显的A+T含量偏向性,mtD-NA COⅡ基因的碱基颠换数总体上高于转换数,颠换主要发生在A←→T间,转换主要发生在T←→C间。遗传变异分析表明,橡实象虫及10个近缘种的核苷酸多态性位点百分率为39.7%,氨基酸突变率为30.3%。分别采用UPGMA法、NJ法和MP法构建橡实象虫及10个近缘种间的COⅡ基因系统进化树,各物种间的拓扑关系虽然稍有差异,但系统进化关系却完全一致,即物种间分别以所在的属聚在一起,形成Curculio、Ceutorhynchus和Peritelus3个属群,其中Curculio属和Ceutorhynchus属的系统进化关系较近,二者聚在一起形成一大支,而Peritelus属单独形成一支。     

DNA条形码技术在草地天敌昆虫分类鉴定中的应用

利用DNA条形码技术对收集到的8种草地螟寄生性天敌昆虫线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA COⅠ)的部分序列进行测定,通过比对分析,以邻接法(NJ)和最大简约法(MP)构建天敌昆虫系统发育树,以Kimura双参数模型计算天敌昆虫种内及种间的遗传距离。结果发现:与Genbank中寄生蝇及寄生蜂序列进行对比、剪切,共得到584bp的寄生蝇条形码基因序列49条、625bp的寄生蜂条形码基因序列45条。其中,49条寄生蝇的平均碱基含量中AT含量为71.1%,大于GC含量;45条寄生蜂的平均碱基含量中AT含量为74.0%,大于GC含量;均表现出AT偏向性。4种寄生蝇种内平均遗传距离为0.0015,种间平均遗传距离为0.1137;4种寄生蜂种内平均遗传距离为0.0015,种间平均遗传距离为0.3010,两类天敌昆虫的种间遗传距离均远大于种内遗传距离;聚类分析显示每一种天敌对应一个分支。说明基于COⅠ基因的条形码技术可以用于草地螟寄生性天敌昆虫的鉴别。     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗S2基因在体内变异分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)驴白细胞弱毒疫苗EIAVDLV121的S2基因在马体内的变异规律,本研究选用4匹成年马,其中2匹(#1、#2)接种EIAVDLV121,另外2匹作为对照.免疫后监测马体温、血小板含量以及病毒载量结果显示,免疫马未出现马传染性贫血体征.通过RT-PCR方法检测病毒S2基因在感染马体内不同时期的基因序列,结果显示,免疫马体内EIAVDLV121 S2蛋白的突变主要发生在氨基酸第17位、22位、39位、41位、51位和55位.另外,#1马免疫后70 d以及#2马免疫后第14 d和第28 d检测疫苗毒S2蛋白序列与EIAVDLV121亲缘关系较近,而#1马免疫后第42 d、第112 d和第140 d的疫苗毒S2蛋白序列与EIAVDLV121的致病性亲本强毒株EIAVDN40亲缘关系最近.本研究结果有助于对EIAV及EIAV疫苗株在马体内感染进程的研究.     

黑熊四川亚种线粒体DNA cytb基因的克隆及全序列分析

采用PCR克隆技术对黑熊四川亚种线粒体DNA cytb基因进行克隆、测序。黑熊四川亚种线粒体DNA cytb基因的全序列为1140 bp,CG含量为46.23％。与AB020910和U23558两个黑熊cytb序列的变异共有61处.其中T-C转换共有36处.A—G转换共有23处。仅有2处发生T-A颠抉,碱基突变率为5.35％.其中转换率96.72％,颠换率为3.28％。密码子第3个碱基发生变异的有48个。     

家蚕蛹线粒体DNA EcoRⅠ 1.9kb片段的克隆及序列分析

克隆了二化性家蚕蛹体的线粒体DNAEcoRⅠ酶解 1 .9kb片段 ,并进行了序列测定。结果表明 :克隆片段中包含完整的线粒体赖氨酸转移RNA(tRNA Lys)基因、天冬氨酸转移RNA(tRNA Asp)基因、ATP合酶亚基Ⅷ基因和细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ、ATP合酶亚基Ⅵ基因的部分序列。并与果蝇线粒体DNA的同源性和参照果蝇线粒体DNA密码子翻译的氨基酸顺序进行了比较 ,由tRNA的一级结构推断出可能的二级结构模型     

7个地方鸡种的分子评估

成熟的基因扩增及测序技术,结合比较发达的网络与信息技术,给我们提供了以DNA为基础的系统分类方法.一种新的DNA分类方法--DNA条形编码(DNA Barcoding)技术应运而生.本研究以线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase Ⅰ,CD Ⅰ)基因的特定序列作为DNA条形码,对我国7个地方鸡种进行分子评估.研究结果表明:选择的这段CO Ⅰ基因序列有22个突变位点,为13个单倍型,其中11个单倍型为各品种所特有;6个鸡种有其特异位点,这些特异单倍型和特异位点作为DNA条形码可以对其进行分子评估,并可以作为辅助各品种鉴定的依据.7个品种间Kimura双参数遗传距离为0.017～0.389.7个品种的DNA分类和形态学分类基本一致,该基因可以探讨地方鸡种分类问题.     

mtDNA分析在羊进化多样性及种属鉴别中的应用

线粒体DNA( mitochondrial DNA,mtDNA)是动物体内唯一存在的核外遗传信息载体,为双链的闭合环状分子,双链中一条为重链(H链),另一条为轻链(L链).大多数脊椎动物的mtDNA大小为16 kb左右,基因中没有内含子,37个基因紧密排列(细胞色素C氧化酶的3个亚基CO Ⅰ、COⅡ、COⅢ的基因,细胞色素b(Cytb)的基因,两个编码ATP合成酶亚基ATPase6和ATPase8的基因,NADH脱氢酶的7个亚基的基因以及2个rRNA基因和22个tRNA基因),另外还有一段和复制转录有关的控制区D-loop.     

中国西南马mtDNA ND4基因遗传多样性研究

本研究旨在分析mtDNA ND4基因在中国西南马的遗传多样性.对中国西南马6个品种(类群)142个个体的线粒体DNA ND4基因部分序列进行PCR-SSCP和序列分析.结果表明,拼接后的西南马mtDNA ND4基因序列大小为679 bp,A+T含量(55.7%)高于G+C含量(44.3%).共检测到11个核苷酸变异位点,这些变异位点可归纳为6种单倍型.核苷酸平均多样度为0.638%,表明受试西南马mtDNA遗传多样性并不十分丰富.对各单倍型进行聚类分析,结果提示中国西南马起源于2个母系祖先.