兰州地区绵羊肺腺瘤病的诊断及病理学研究

通过临床、病理学及PCR诊断技术,对兰州某羊场疑似绵羊肺腺瘤病的4例病羊进行了检测诊断和病理学分析.结果表明:病羊表现为临诊咳嗽,呼吸困难."手推车试验"时,有大量稀薄鼻液从鼻腔流出.病理变化主要表现为肺表面散布在大小不等的灰白色结节,肺切面有大量泡沫状液体流出,Ⅱ型肺泡上皮细胞大量增生使肺泡呈不规则腺泡状,并有增生的突起突入肺泡腔;病变区附近肺泡腔中有大量巨噬细胞充塞;特异性PCR检测扩增出531bp的特异性片段,与已知绵羊肺腺瘤病特异性片段大小一致;4例病羊确诊为绵羊肺腺瘤病.     

GPx5基因在绵羊附睾上的时空表达特性

【目的】研究谷胱甘肽过氧化酶5(GPx5)基因在绵羊附睾及附睾不同发育时期的表达特性。【方法】采用荧光定量PCR技术、免疫印迹技术及免疫荧光等方法,分别检测GPx5基因在绵羊附睾不同发育时期、不同部位上mRNA和蛋白的表达及分布情况。【结果】荧光定量PCR结果表明,青年羊附睾GPx5基因在头部的mRNA表达量显著高于体部和尾部(P0.05);青年羊附睾头部GPx5基因mRNA表达量显著高于羔羊和老年羊附睾头部(P0.05)。免疫印迹结果表明,羔羊附睾无GPx5蛋白表达;青年羊附睾各部位均有表达,而老年羊附睾头部和体部有表达、尾部无表达。灰度分析结果表明,青年羊附睾头部GPx5相对表达量显著高于其他部位(P0.05),且青年羊附睾头部GPx5蛋白相对表达量显著高于老年羊附睾头部(P0.05)。免疫荧光结果表明,在羔羊附睾未检测到GPx5蛋白表达信号;青年羊附睾各部位均有荧光信号表达,且附睾头部和体部荧光强度明显高于尾部,并在附睾管液体中也发现有荧光信号;老年羊附睾头部和体部有荧光信号,荧光遍布于附睾管假复层上皮细胞的细胞核及细胞质中。【结论】GPx5基因mRNA在绵羊附睾不同发育时期均有表达,但在不同部位具有表达差异性;GPx5蛋白于附睾管假复层上皮细胞表达,且在性成熟前羔羊附睾及老年羊附睾尾部未表达,因此推测GPx5蛋白的表达与绵羊性发育时期有密切关联。     

绵羊繁殖轴相关组织TPH1和TPH2基因表达分析及TPH2基因多态性与产羔数的关系

为探讨TPH1和TPH2基因在绵羊不同繁殖状态下的表达差异及TPH2基因多态性与小尾寒羊产羔数的关系,利用实时荧光定量PCR技术检测该2个基因在不同繁殖状态下成年苏尼特羊(短光照3只,长光照3只)和小尾寒羊(卵泡期3只,黄体期3只)的大脑、小脑、下丘脑、松果体、垂体、卵巢、输卵管、子宫、肾脏和肾上腺等10种组织中的相对表达量;同时采用Sequenom MassARRAY?SNP技术检测TPH2基因单核苷酸多态位点SNP在常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊)和季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)的多态性,并将基因多态性与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:该2个基因在2个绵羊品种各组织广泛表达,TPH1基因在苏尼特羊下丘脑和松果体中短光照表达量极显著高于长光照(P0.01),在苏尼特羊垂体中短光照表达量显著高于长光照(P0.05),在小尾寒羊垂体和卵巢中卵泡期显著低于黄体期(P0.05);TPH2基因在苏尼特羊卵巢组织长光照下的表达量显著高于短光照(P0.05),TPH2基因在小尾寒羊下丘脑组织中卵泡期的表达量极显著高于黄体期(P0.01)。小尾寒羊中TPH2基因g.107854166CT和g.1078541669CT 2个SNP位点关联分析表明,该2个位点与季节性发情性状和小尾寒羊第1、2以及第3胎产羔数均无显著关联(P0.05)。综上,TPH1和TPH2基因在苏尼特羊绵羊下丘脑和松果体中呈季节性光照节律差异表达,暗示其可能参与季节性发情上游基因的调控,而TPH2基因可能参与调控小尾寒羊下丘脑中激素分泌和卵巢发育,但g.107854166CT和g.1078541669CT不是调控季节性发情和小尾寒羊产羔数的关键位点。     

绵羊肺腺瘤病实验室诊断报告

以乌兰察布市某种羊场的疑似病羊为研究对象,采用临床诊断、镜检观察及PCR法检测患病羊是否患有绵羊肺腺瘤病。结果显示:①“小推车试验“时有鼻液流出;②剖检时可见肺实变,体积明显增大,表面出现大量形态不规则的灰白色结节,切开肺脏时可见大量泡沫状液体从切面渗出;③显微镜下观察,疑似患病羊的肺脏有大小不一的腺瘤灶,且肺泡上皮细胞呈乳头状增生,肺泡腔内充满巨噬细胞,病灶中央的细胞核溶解,胞浆中有空泡,呈坏死状;④根据GenBank中已发表的外源性绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列,设计合成3对特异性引物,对病料样品进行PCR扩增并将其产物测序,结果表明扩增出的片段为178bp、226bp、301bp,同源性分析表明这3段序列与引起该病的病原即绵羊肺腺瘤病毒基因组序列同源性最高分别为97.2%、96.5%、94.4%,与相对应的内源性病毒序列最高分别为73%、69.5%、85.4%,以上4方面诊断该病例为绵羊肺腺瘤病。其中所建立的PCR诊断方法具有快速、特异、敏感等特点,为绵羊肺腺瘤病的快速诊断提供了新的手段。     

中国和美国绵羊的肺腺瘤病

绵羊肺腺瘤病(Sheep pulmonary adenoomatosis,SPA)是一种地方流行性、或许是由病毒引起的绵羊肺癌。除了两个岛国澳大利亚和新西兰之外,大多数养羊国家都报道了此病。1951年中国在甘肃省兰州的屠宰羊中首次诊断出了SPA[朱宜人,西北畜牧兽医学院病理系尸检报告]。在1958年出版的报道中,来自新疆维吾尔自治区焉耆和乌鲁木齐县的屠宰绵羊中,首次描述了11头病例。此后,SPA在内蒙古自治区和青海省都得到了确诊[余世福,个人联系,青海畜牧兽医学院]。大多数感染羊为成年羊,但少数周岁     

绵羊DIO2基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析

[目的]本试验旨在探明Ⅱ型脱碘酶(DIO2)基因在常年发情的小尾寒羊和季节性发情的草地型藏羊中的表达模式,并探讨其多态性与绵羊季节性繁殖和产羔数之间的关系。[方法]通过荧光定量PCR(qPCR)检测DIO2基因在不同品种绵羊的10种组织中的表达,同时利用SNP技术对3个常年发情绵羊品种(小尾寒羊、策勒黑羊和湖羊)和3个季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草地型藏羊)的DIO2基因2个SNP位点多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。[结果]qPCR结果显示,DIO2基因在小尾寒羊和草地型藏羊各组织中广泛表达,其中草地型藏羊下丘脑、垂体、卵巢、子宫和输卵管组织中的表达量显著高于小尾寒羊(P0.05)。基因分型结果表明,绵羊DIO2基因g.88484603GC位点基因型频率和等位基因频率在季节性发情和常年发情绵羊品种间差异均达到极显著水平(P0.01)。群体遗传学分析表明,绵羊DIO2基因g.88484594TC位点在滩羊和策勒黑羊中表现为中度多态(0.25PIC0.5),在其他4个群体中均表现为低度多态(PIC0.25);g.88484603GC位点在这6个绵羊群体中均表现为中度多态(0.25PIC0.5)。卡方适合性检验结果表明,g.88484594TC位点在这6个群体中均处于哈代温伯格不平衡状态(P0.05),g.88484603GC位点在这6个绵羊品种中均处于哈代温伯格平衡状态(P0.05)。生物信息学分析表明,g.88484603GC位点突变前、后的mRNA二级结构发生了改变,而且其最小结构自由能降低,结构稳定性增强,蛋白质二级结构没有发生变化,但三级结构有一些变化。关联分析表明,这2个SNP位点与小尾寒羊前3胎产羔数均无显著关联(P0.05)。[结论]DIO2基因与绵羊的季节性繁殖密切相关,其g.88484603GC位点对绵羊季节性繁殖性状有一定的调控作用。     

3个新疆绵羊品种中BMPR-IB基因的RFLP分析及比较

通过比较研究哈萨克羊、吐鲁番黑羊和策勒黑羊3个新疆绵羊群体中BMPR-IB基因的多态性,为后期分子育种提供理论依据。利用PCR-RFLP技术检测BMPR-IB基因在3个新疆绵羊群体中的多态性,并利用生物信息学软件分析其与绵羊产羔数的关联性,筛选与新疆绵羊高繁殖力性状相关的分子标记。结果显示:吐鲁番黑羊只存在1种基因型,没有多态性。哈萨克羊和策勒黑羊群体中的BMPR-IB基因具有多态,存在3种基因型:++、B+和BB,其中BB基因型个体的产羔数显著高于++基因型个体产羔数(P0.05)。所得结论为:BMPR-IB基因可能是影响哈萨克羊和策勒黑羊繁殖性状的主效基因,BMPR-IB基因是否是影响吐鲁番黑羊繁殖性状的主效基因,有待深入研究。     

绵羊血小板糖蛋白4基因(CD36)的克隆及在不同生长时期卵泡中的表达

【目的】血小板糖蛋白4基因(CD36)在模式动物中发挥着各种生物学功能,通过转录组数据分析,可能在绵羊卵泡发育中发挥重要作用。本研究获得了CD36基因及探究其在不同组织中表达情况,从而预测其在绵羊生长过程中可能发挥的生物学功能。【方法】实验采用PCR扩增方法获得阿勒泰羊TSP-1基因的CDS区全长,运用软件分析CD36基因的蛋白质序列及其功能区域,同时利用荧光定量PCR的方法检测5头1周岁阿勒泰羊7个组织及不同直径卵泡中的表达情况。【结果】CD36基因序列全长为1419 bp,共编码472个氨基酸,与预测序列相比完全一致。系统进化树分析表明绵羊与牛的遗传距离较近。CD36蛋白为脂溶性亲水蛋白,具有1个跨膜螺旋结构,在氨基酸1~20位存在以信号肽,存在8个N-糖基化和41个潜在的磷酸化位点,包括19个Ser,15个Thr和7个Tyr。检测不同组织和不同直径卵泡中CD36基因发现:CD36基因在绵羊7个组织中都有表达,心与肺和小卵泡中CD36表达量差异显著(P0.05),在不同直径卵泡中总体表达量较低。【结论】CD36基因可能在绵羊卵泡发育中发挥重要作用。     

新疆南部部分绵羊品种血液遗传标记特征及聚类分析

利用血液蛋白多态性标记新疆南部三种绵羊遗传结构 ,证实了它们相互间的遗传差异。结果表明 :Tf位点 ,多浪羊和卡拉库尔羊具有A、B、C等显性基因控制 ,巴音布鲁克羊还检测出D基因。Hb位点 ,多浪羊和卡拉库尔羊具有A、B等显性基因控制 ,巴音布鲁克羊还检测出C基因。以上两个位点各种显性基因频率因品种而有差异。按照Nei’s遗传距离法 ,计算了三品种间的遗传距离 ,证明新疆南部三种绵羊品种的遗传距离以多浪羊和卡拉库尔羊为最小 ,多浪羊与巴音布鲁克羊的遗传距离为最大。用类聚法分析表明 :多浪羊与卡拉库尔羊首先相聚 ,然后再与巴音布鲁克羊相聚。     

绵羊肝脏生长激素受体基因表达的发育性变化研究

[目的]研究哈萨克羊和新疆细毛羊肝脏生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)基因在发育早期的表达,为绵羊早期生长发育的研究提供资料。[方法]采用实时定量PCR检测2个品种羊在2、30、60、90和120日龄时肝脏GHRmRNA的水平,并用SPSS软件进行统计分析。[结果]绵羊肝脏GHR基因的表达量在2日龄时较高,30日龄时降到最低点,然后持续上升;30日龄后的变化趋势与绵羊的累积生长曲线呈正相关(P<0.05);哈萨克羊的GHR表达量在2~90日龄期间均低于新疆细毛羊,但仅在2和90日龄时差异极显著(P<0.01)。[结论]雄性哈萨克羊和新疆细毛羊肝脏GHRmRNA表达的发育性变化模式基本相似,品种间差异较小;肝脏GHR基因在绵羊生长发育的调控中可能起着重要作用。     

南疆三种绵羊品种血液蛋白遗传标记特征及聚类分析

利用血液蛋白多态性标记新疆南部三种绵羊遗传结构，证实了它们相互间的遗传差异。结果表明：Tf位点，多浪羊和卡拉库尔羊具有A，B，C等显性基因控制，巴音布鲁克羊还检测出D基因。Hb位点，多浪羊和卡拉库尔羊具有A，B等显性基因控制，巴音布鲁克羊还检测出C基因。以上两个位点各种等显性基因频率因品种而有差异。按照Nei‘s遗传距离法（1987），计算了三品种间的遗传距离，证明新疆南部三种绵羊品种的遗传距离以多浪羊和卡拉库尔羊为最小，多浪羊与巴音布鲁克羊的遗传距离为最大。用类聚类法分析表明：多浪羊与卡拉库尔羊首先相聚，然后再与巴音鲁克羊相聚。     

自然感绵羊慢性病毒对新疆卡拉库尔羊品种敏感性研究

【目的】用绵羊进行性肺炎病毒((OPPV)实验感染新疆卡拉库尔羊,为证实新疆卡拉库尔羊对OvLV美国株(OPPV)的敏感性很低,且呈现亚临床性感染。【方法】琼扩试验(AGID)检查血清OvLV抗体和进行病理组织学检查,以确定是否有特征性病变的靶器官。【结果】只有33%的受试羊在首次检查时出现内线和外线,乳腺是最敏感的靶器官,其次是肺。【结论】通过对自然感染绵羊慢性病毒新疆株的新疆卡拉库尔羊的研究,证实了新疆卡拉库尔羊是对OvLV的低敏感性品种。     

NF-κB家族亚基在不同品种绵羊背部皮肤中基因水平表达差异的分析

羊毛是养羊业的主要产品之一,其是由皮肤内的附属器官毛囊发育而来,其中弯曲度是衡量其质量的重要指标之一。为了解NF-κB家族各亚基(NFκB1、NFκB2、RELA、RELB和REL)在不同品种绵羊背部皮肤中基因水平的表达差异,分析其在不同品种绵羊背部皮肤中与形成毛发性状差异相关的关键性基因,选取美利奴羊和晋中绵羊2个不同品种的绵羊作为研究对象,利用实时荧光定量PCR方法检测不同品种绵羊背部皮肤中NF-κB各亚基的表达水平。结果显示,NF-κB各亚基在美利奴羊和晋中绵羊背部皮肤中的相对表达量均有差异,除RELA外,其余各亚基mRNA的相对表达量美利奴羊均高于晋中绵羊;美利奴羊皮肤中,NFκB2 mRNA相对表达量最高,RELA mRNA次之;晋中绵羊皮肤中,RELA mRNA相对表达量最高,NFκB2 mRNA次之。结果揭示,NFκB2可能对于羊毛弯曲性状的形成具有促进作用,而RELA可能对于羊毛弯曲性状的形成具有抑制作用;NFκB2与RELA适当的相对表达水平可能对于毛发弯曲性状的形成起重要的调控作用。     

4个绵羊品种PTGS2基因部分片段的多态性分析

设计2对引物,采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术检测前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)基因在小尾寒羊、湖羊、多赛特羊、萨福克羊4个绵羊品种304个个体中的单核苷酸多态性.结果表明,PTGS2基因引物1扩增片段在4个绵羊品种中不存在PCR-SSCP多态性.引物2扩增片段存在PCR-RFLP多态性,在4个绵羊品种中都检测到2种基因型(AA、AB),都没有检测到BB基因型.A等位基因频率明显高于B等位基因频率.小尾寒羊与多赛特羊、萨福克羊、湖羊之间PTGS2基因型分布差异显著(P＜0.05),其余品种之间PTGS2基因型分布差异都不显著(P＞0.05).     

绵羊肌肉IGF-I基因表达的发育性变化研究

[目的]研究哈萨克羊和新疆细毛羊肌肉中胰岛素样生长因子Ⅰ(Insulin-like growth factorⅠ,IGF-I)基因在发育早期的表达,为绵羊早期生长发育的研究提供资料。[方法]采用实时定量PCR检测2个品种羊在2、30、60、90和120日龄时肌肉中IGF-ImRNA的水平,并用SPSS软件进行统计分析。[结果]绵羊肌肉IGF-ImRNA的表达量随着日龄的增加呈现出先升后降的趋势,哈萨克羊肌肉IGF-ImRNA的峰值出现于30日龄,新疆细毛羊出现于60日龄;哈萨克羊的表达量在2日龄和90日龄时与新疆细毛羊差异不显著(P>0.05),在30~60日龄期间极显著低于新疆细毛羊(P<0.01)。[结论]雄性哈萨克羊和新疆细毛羊肌肉IGF-I mRNA表达具有相似发育性变化模式,但是表达量存在品种间差异。     

绵羊TLR4基因的遗传多态性分析

为了研究永昌羊、小尾寒羊、白萨福克羊和特克塞尔羊4个品种的舍饲绵羊TLR4基因的遗传多态性及变异特征,采用PCR-SSCP方法,检测这4种绵羊(共404只)TLR4基因第3外显子部分基因片段的多态性以及产生变异的各等位基因序列。结果显示,4种绵羊中共发现6种等位基因控制的7种基因型,永昌羊、白萨福克羊和特克塞尔羊均未检测到E和F等位基因,小尾寒羊未检测到D等位基因;与GenBank中羊TLR4基因序列比对发现,扩增片段中有19个核苷酸多态位点,编码的氨基酸序列中有9个氨基酸多态位点;经χ2适应性检验,4个绵羊品种均位于Hardy-Weinberg平衡(P0.05),其中白萨福克羊、特克塞尔羊和小尾寒羊处于高度多态(PIC0.50),而永昌羊处于中度多态(0.25PIC0.50)。     

藏系绵羊BMP4基因克隆及组织表达分析

本试验旨在获得藏系绵羊BMP4基因序列,并分析其生物学特征,同时阐明该基因在不同组织中的表达情况。利用RT-PCR技术克隆藏系绵羊BMP4基因序列,利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测其在藏系绵羊各个组织中的表达丰度。结果表明,获得藏系绵羊BMP4基因CDS序列1230bp,共编码409个氨基酸,为不稳定亲水碱性蛋白;与绵羊、牛、山羊、小鼠和人的氨基酸序列具有98%以上的相似性;潜在的磷酸化位点共33个。qPCR结果显示BMP4基因在藏系绵羊的各个组织中均存在广泛表达,且在肺组织中表达水平最高,极显著高于其他组织(P0.01)。本研究为进一步阐明BMP4基因在藏系绵羊脂质代谢中的功能奠定了基础。     

免疫组化检测绵羊肺腺瘤中醛缩酶A的表达

本研究应用免疫组织化学方法检测了绵羊肺腺瘤和正常肺组织中醛缩酶A的表达情况。通过采用Image-Pro Plus图像分析软件对醛缩酶A表达的光密度和阳性单位(PU)进行定量测试。结果显示,醛缩酶A在正常肺组织的支气管上皮细胞、个别肺泡上皮细胞和肺腺瘤的肿瘤细胞的细胞质中均有明显表达,醛缩酶A在绵羊肺腺瘤组的平均光密度值明显高于正常绵羊肺组织组(P0.05),醛缩酶A在OPA组的PU值(阳性单位)极显著高于正常绵羊肺组织组(P0.01)。表明醛缩酶A在OPA中过表达。     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙株env基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank中绵羊肺腺瘤病毒(AF105220)env基因序列设计合成了1对引物.提取自然感染绵羊肺腺瘤病的羊肺组织总RNA,应用RT-PCR技术对env基因进行了扩增,将其回收后克隆入PMD19-T载体中并进行了序列测定.应用生物信息学分析技术并对env基因所编码的蛋白进行了结构预测.结果表明,env基因全长1 848bp,共编码615个氨基酸.在基因编码的TM区发现外源性exJSRV特异性的"YXXM"基序.测定序列与美国代表株(AF105220)的env基因序列比较核苷酸同源性为98.8%,推导出的氨基酸同源性为99.8%.通过protparam工具统计分析可知env基因所编码的蛋白为亲水蛋白.     

缺氧诱导因子和促红细胞生成素及其受体基因在绵羊各组织中表达量

【目的】研究缺氧诱导因子(HIF)及其下游靶基因促红细胞生成素(EPO)及其受体(EPOR)在绵羊正常生理状况下各组织的表达,为靶向调控或缓解绵羊缺氧应激的研究提供组织学依据。【方法】采用实时荧光定量PCR方法,检测4只新疆细毛羊14种组织中HIF、EPO和EPOR基因的相对表达量。【结果】HIF-1α和HIF-2α基因均在绵羊肺组织的相对表达量最高,且极显著高于其它组织(P<0.01);在肺脏HIF-2α基因的表达量约为HIF-1α表达量的5.2倍。EPO基因在绵羊肾脏的相对表达量最高且显著高于垂体、结肠、脾脏、盲肠、肝脏、肾上腺、瘤胃、下丘脑以及心脏(P<0.05)。EPOR基因在肺脏的表达量最高,肺脏和睾丸的相对表达量显著高于脾脏、下丘脑、肾脏、心脏等组织(P<0.05)。【结论】HIF-1α、HIF-2α和EPO及其受体基因在绵羊的肺部或肾脏的高表达,可能是绵羊缺氧应激感受及其调控的重要器官。