水稻EST中微卫星分析

[目的]分析水稻EST中微卫星序列。[方法]利用MISA(MIcroSAtellite)软件分析了微卫星在水稻EST中的分布频率与密度。[结果]在1 690 257条EST序列中,有907 071条序列含有微卫星,微卫星之间的距离约为0.51 kb。其中,六碱基重复丰度最大,占47.1%,而三碱基、单碱基、四碱基、二碱基和五碱基重复丰度分别为22.4%、18.5%、6.8%、3.1%和2.1%。表明三碱基重复丰度占到较高比例(22.4%),因此可从现有的ESTs数据中方便地获取有效的水稻微卫星标记。[结论]该研究结果可以为水稻种质资源鉴定和品种改良提供有用的基因信息资源。     

丹参EST序列中微卫星分布特征分析

为了开发丹参表达序列标签微卫星(EST-SSR)功能性分子标记,从公共数据库GenBank中下载获得丹参EST序列10288条,在剔除低质量和冗余的序列后,得到全长为292.561 kb的无冗余EST序列5073条.在这些序列中共发掘出628个SSR,分布在528条EST中,出现频率是10.4%,平均长度为14.47 bp,平均分布频率为每0.47 kb分布一个SSR位点,其中含SSR位点的EST长度主要分布于401～600 bp与601～800 bp之间.在检索出的SSRs中,二核苷酸是主要重复类型,占SSR总数的72.45%;其次是三核苷酸,占SSR总数的26.75%.二核苷酸类型(AG)n、(AT)n和(AC)n和三核苷酸类型(AAG)n、(AGC)n基元是SSR的主要重复类型.本研究为丹参EST-SSR标记的开发和进一步应用提供参考.     

小麦条锈病菌EST序列中微卫星的频率和分布

 研究利用已公布的7368条小麦条锈病菌表达序列标签（expressed sequence tags, EST）序列,对其EST序列中的微卫星（microsatellite）或简单重复序列（simple sequence repeats, SSRs）进行了系统分析。结果表明,在已公布的7368条小麦条锈病菌EST序列中,共有2642个SSR序列（长度大于15bp,匹配值大于80%）,相当于平均3条EST序列中分布有1个SSR序列。在这些SSR中,单碱基SSR最多,数量达2320个,占SSR总数的87.8%;其次为三碱基SSR,数量为137个,约占SSR总数的52%;五碱基重复的SSR数量最少,为34个。且有的SSR的重复数较多,这将有利于小麦条锈病菌SSR分子标记的开发与应用。     

短毛切梢小蠹微卫星富集文库的构建与分析

采用生物素-磁珠富集法,构建短毛切梢小蠹微卫星富集文库。在该文库中随机挑选100个克隆作测序分析,结果表明：具微卫星位点的克隆占91％;具有10次以上碱基重复次数的微卫星序列占36％,其中最高碱基重复次数为63次;在这些微卫星序列中,完美型占47．3％,非完美型占24．2％,混合型占16．5％。表明获得的微卫星文库是高质量的文库,完美型的比例高于不完美型和混合型,与真核生物微卫星序列特征相符。     

柑橘全爪螨微卫星位点鉴定与信息分析

【目的】通过磁珠富集法构建柑橘全爪螨（Panonychus citri）微卫星富集文库,发掘柑橘全爪螨基因组微卫星（gSSR）序列。同时,利用柑橘全爪螨转录组数据库,筛选其功能微卫星（EST-SSR）分子标记,设计柑橘全爪螨微卫星（SSR）引物并验证其适用性。【方法】在提取柑橘全爪螨高质量基因组DNA的基础上,使用链霉亲和素偶联的磁珠与生物素标记的微卫星探针结合,亲和性捕捉由限制性内切酶酶切产生的含SSR的单链基因组DNA目的序列,经PCR扩增为双链后,克隆并构建SSR富集文库,测序筛选SSR序列。另一方面,基于柑橘全爪螨转录组数据,利用msatcommander软件发掘其功能微卫星标记。采用Primer Premier 5软件设计SSR引物,并进行验证。【结果】构建了柑橘全爪螨AC、TC和ATG共3个SSR富集文库,阳性克隆率分别约为30%、28%和25%。对文库的测序结果表明,AC文库的冗余率最高,TC文库次之,而ATG文库未发现相同微卫星位点的克隆。同时,在AC文库中,大部分AC重复类型的SSR为多拷贝微卫星位点,其中有相当一部分SSR的一侧侧翼序列完全相同或高度相似。从3个SSR富集文库中获得了可用于设计引物的gSSR单一序列44条（GenBank登录号为JF776418-JF776461）,共合成了20对SSR引物,其中能够稳定扩增的引物有11对。柑橘全爪螨gSSR中完美型SSR占54.5%,非完美型和复合型SSR分别占27.3%和18.2%。在完美型的gSSR中,两碱基重复SSR的核心重复次数（13-42次）大于三碱基重复SSR（5-9次）。从柑橘全爪螨转录组数据库中共获得8 023个EST-SSR位点,其中2 540个SSR可用于引物设计,共合成了35对引物（GenBank登录号为KT261306-KT261340）,其中能够稳定扩增的引物有8对。柑橘全爪螨EST-SSR的平均分布频率为1/3.55 kb。其中,三碱基为优势核心重复类型,占总数的53.86%;其次为两碱基核心重复类型,占总数的43.36%;而四、五、六碱基重复类型以及复合型的SSR数量均较少,且数量差异不大,共占EST-SSR总数的2.78%。柑橘全爪螨EST-SSR核心重复次数主要集中在5-10次。【结论】采用磁珠富集法,并将酶切、接头连接一步化,可提高个体微小的螨类及微小昆虫SSR的富集效率。柑橘全爪螨gSSR核心重复次数要远多于从转录组数据库获得的EST-SSR。总体而言,gSSR和EST-SSR中的三碱基重复SSR具有更好的优化率。此外,柑橘全爪螨gSSR具有微卫星家族现象。     

蒺藜苜蓿叶绿体微卫星分布规律的研究

利用已公布的蒺藜苜蓿(Medicao truntula)叶绿体DNA(cpDNA)全序列测序结果,应用生物信息学软件对蒺藜苜蓿微卫星位点的分布情况进行了统计分析,结果表明:在已公布的124 033 bp的蒺藜苜蓿叶绿体基因组序列中,共有341个SSR序列,SSR的碱基总数达3 987 bp,约占整个基因组的3.2%;在所有SSR序列中,数量最多的是单碱基SSR,数量达到297个,占总数的87.1%,其次是二碱基重复序列,占12.6%,三碱基微卫星序列最少,仅有1个,大于三碱基的微卫星数为0;在单碱基重复中又以A和T重复为主,占单碱基重复总数的84.5%,二碱基重复也以AT和TA为主,占95.5%,单碱基中的纯粹重复类型占总数的65.3%。研究结果为该物种的分子标记的筛选提供了基础信息。     

草莓EST中SSR位点分析

[目的]从现有的草莓EST数据中获取有效的微卫星标记。[方法]利用MISA（Microsate llite）软件分析简单重复序列（Simple se-quence repeat,SSR）在草莓EST中的分布频率与密度,用CAP3软件进行冗余分析。[结果]在17565条EST序列中,共获得10129条SSR序列,SSR之间的距离约为0.90kb。其中,六碱基重复丰度最大,占61.0%,而三碱基、单碱基、二碱基、四碱基和五碱基重复丰度分别为14.3%、13.1%、6.2%、4.3%和1.1%。在单碱基、二碱基、三碱基和四碱基重复模体中,丰度最大的分别是A/T、AG、AAG和AAAG,而CG在编码区内没有。在这6种类型的重复模体中,冗余与非冗余的草莓EST之间没有显著差异。[结论]从现有的草莓EST数据中可以方便地获取有效的微卫星标记。     

杨树锈菌表达序列微卫星分析及EST-SSR标记开发

通过对64 498条杨树锈菌EST进行拼接,得到1 998个拼接片段(contigs),发现了604个SSR位点。在拼接片段中SSR平均密度为每736.6 bp含有1个SSR。在SSR中,三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占总数的44.70%。在二碱基重复中,最主要的优势重复单元是AC和AT,三碱基中AGT和AAG为优势重复单元,四碱基、五碱基重复类型中,(AAAN)n和(AAAAN)n为对应的优势重复单元,这些优势重复单元中富含碱基A和T,研究还发现杨树锈菌表达序列中微卫星丰度很高。杨树锈菌突变频率很高,由试验结果推测杨树锈菌基因中含有的微卫星序列是杨树锈菌基因变异的一个重要驱动力。杨树锈菌EST序列中高度变异的微卫星(长度大于20 bp)约占15.07%。针对检测到的微卫星位点,共设计了455对引物,并选取了30个SSR引物对对杨树锈菌基因组DNA进行PCR扩增,其中有27个引物对扩增成功,占90.0%。扩增产物电泳结果显示,有21个引物对扩增出的谱带在预期片段大小范围之内,有8个引物对在杨树锈菌DNA中检测到了多态性,多态性引物对占26.7%。     

菊花EST-SSR分析及标记开发

为了开发菊花的分子标记,对7 087条菊花EST进行拼接,得到275个contigs,发现50个SSR位点;在拼接的contigs中SSR平均密度为每2 854.3 bp含有1个SSR。三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占总数的50.00%;在二碱基重复中,最主要的优势重复基元是AC和AG;三碱基中CAT和CCA为优势重复基元;四碱基、五碱基重复类型中,(TTTN)n和(ATTTN)n重复基元为对应优势基元;这些优势重复基元中富含碱基A和T,菊花EST序列中高度变异的微卫星(长度>20 bp)约占2.00%。根据得到的菊花EST-SSR,共设计出428对引物,并选取了28对SSR引物对黄山贡菊基因组DNA进行PCR扩增,其中有27对引物扩增成功。     

云南松基因组微卫星序列特征分析

为了更好地了解云南松基因组特征,分析了云南松基因组中微卫星序列的分布特征,采用FLAF-seq测序技术,共获得1 970条微卫星重复序列,利用MISA通过对Unigene序列的分析,鉴定出7种类型的SSR。7种微卫星序列中主要以单碱基重复类型为主,共1 104个,约占重复序列总数的56.04%,其次是双碱基和三碱基重复类型,分别占总数的27.66%和11.68%,四碱基重复类型数量30个,占重复序列总数的1.52%,五碱基、六碱基重复类型在总重复序列中占比最少,均为0.2%,混合微卫星占2.7%。在单碱基重复类型中占优势的重复单元是A/T碱基,双碱基重复类型中占优势的重复单元是(AT)_n/(TA)_n碱基,三、四、五碱基重复类型中,占优势的重复单元不明显,但几种碱基重复类型中,都包含着丰富的A和T。所得到的微卫星重复序列中以长度20bp序列的微卫星数量最多,微卫星长度≥20bp的只占总数的10.81%。可为后续云南松遗传多样性的研究及SSR引物筛选等提供一定的理论依据。     

苦荞转录组EST-SSR发掘及多态性分析

利用Misa软件对苦荞种子转录组高通量测序获得的45 699条EST序列进行了SSR位点扫描,共得到2 700个SSR位点,分布于2 624条EST序列中,SSR位点平均距离为1/1.73 kb。随着EST序列长度的增加,含SSR位点序列的比例也随之升高,800 bp以上EST序列含SSR的比例明显高于800 bp以下序列。单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复是苦荞EST-SSR主导类型,分别占总SSR的52.11%、13.33%和30.63%,其中(A)n、(AG)n和(AAG)n是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的优势重复基序,分别占总SSR的51.85%、7.11%和8.93%。设计合成了150对 EST-SSR 引物,其中91对引物（60.67%）在40份苦荞种质中获得有效扩增,30对引物（32.97%）具有多态性。平均每对引物能检测到3.53个等位变异;多态信息含量（PIC）在 0.10~0.71之间,平均达0.40。以上结果说明,从苦荞转录组EST序列中大规模开发SSR标记是一条简便而可行的途径。     

荔枝EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

 【目的】明确荔枝EST序列中SSR的总体特点,开发荔枝EST-SSR引物,为利用EST-SSR分子标记进行荔枝种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础。【方法】应用SSRIT软件,按照设定标准从自行构建的一个荔枝果皮发育关键期的cDNA文库中的1 331条Unigene（惟一序列）中搜索SSR位点。利用软件Primer primer5.0设计EST-SSR引物。选用16份表型差异较大的荔枝种质资源检测引物的有效性及多态性,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行片段分离。【结果】荔枝的1 331条EST序列中共搜索出220个SSR位点,分布于189条EST中,出现频率是16.53%。这些EST-SSR的平均长度为18.43 bp,平均分布频率1/4.42 kb。在1—6 bp的重复基元中,二核苷酸和三核苷酸重复类型占主导地位,共占总SSR的69.09%,二者出现的频率分别为37.27%和31.82%。共观察到72种重复基元,出现频率最高的是GA/TC（16.82%）;其次是AG/CT、A/T、AT/TA及GAA/TTC,频率分别为14.55%、11.82%、5.00%和3.64%。不同核苷酸数目的重复基元的重复次数差异很大。设计、合成150对EST-SSR引物,122对（81.33%）引物在荔枝中获得有效扩增,100对引物具有多态性。【结论】荔枝EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR 标记开发效率较高。本研究为利用EST-SSR标记开展荔枝遗传研究提供了100 对EST-SSR引物,并为进一步开发荔枝EST-SSR标记提供了含SSR位点的候选序列。     

茶树EST SSRs特点及应用

利用NCBI公共数据库下载获得的3 306条茶树EST,去除其中低质量和冗余的序列,得到全长为635.46 kb的1 335条无冗余EST,在这些序列中共发现216个SSR,分布于185个EST中,出现的频率为16.18%,平均每2.94 kb的表达序列中有1个SSR。茶树的EST-SSR类型丰富,其中二核苷酸重复出现的频率最高,占主导地位。利用Primer 5.0软件从185条含有SSR的EST中设计引物100对,从中随机选取60对引物检测EST-SSR在云南茶树资源中的多态性。结果表明,有30对引物在供试的63份茶树资源中得到有效扩增,并具有多态性;共检测到等位基因数71个,每对引物检测出的等位基因数2~8个,平均4.9个;多态信息量(PIC)变幅为0~0.731,平均为0.499;观察杂合度变幅为0~0.970,平均0.392。EST-SSR标记分析表明云南茶树资源具有较高的遗传多样性。     

鹰嘴豆EST资源中SSR的信息分析

从NCBI公共数据库下载获得27 904条鹰嘴豆表达序列标签EST,去除其中低质量的和冗余序列后得到全长为6 198 092 bp的11 224 条无冗余EST.利用SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)软件共在这些序列中发掘出982个SSR,它们分布于865条EST中,出现频率为8.69%,平均长度为15.58 bp,平均距离为6.31 kb.在鹰嘴豆EST-SSR中,二核苷酸重复是最主要的重复类型(66.90%),其次是三核苷酸重复类型(30.75%),出现最多的重复基元类型是TA/AT(24.95%).     

胡桃EST-SSR标记的筛选及引物设计

[目的]筛选胡桃的EST-SSR分子标记并对其进行引物设计。[方法]利用生物信息学方法对NCBI网上公开的5213条胡桃（Juglans regia Linn.）ESTs序列进行EST-SSR特征分析,利用利用Primer3.0软件对筛选出的EST序列设计引物。[结果]在ESTs序列中共检索出207个SSR,其中无冗余序列188,检出率为3.97%,平均分布距离为21.12kb,包括92种重复基元,其中以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主,分别占总数目的31.40%和35.27%;对随机筛选出的50条SSR引物进行PCR扩增验证,初步筛选出30对引物。[结论]通过对胡桃EST序列中SSR位点的发掘分析,有针对性地设计EST-SSR引物,将为胡桃科EST-SSR分子标记的开发奠定基础。     

胡桃EST-SSR标记的筛选及引物设计

[目的]筛选胡桃的EST—SSR分子标记并对其进行引物设计。[方法]利用生物信息学方法对NCBI网上公开的5213条胡桃（Jug—lans regia Linn．）ESTs序列进行EST—SSR特征分析,利用Primer3．0软件对筛选出的EST序列设计引物。[结果]在ESTs序列中共检索出207个SSR,其中无冗余序列188,检出率为3．97％,平均分布距离为21．12kb,包括92种重复基元,其中以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主,分别占总数目的31．40％和35．27％;对随机筛选出的50条SSR引物进行PCR扩增验证,初步筛选出30对引物。[结论]通过对胡桃EST序列中SSR位点的发掘分析,有针对性地设计EST．SSR引物,将为胡桃科EST—SSR分子标记的开发奠定基础。     

辣椒疫霉EST-SSRs标记的发掘

通过对GenBank上发布的55 848条辣椒疫霉EST的鉴定,在328条EST中发现331个SSR.在筛选的EST序列中SSR平均密度为每23.7 kb含有1个SSR.在鉴定的SSR中,三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占鉴定总数的59.5%;其次为二核苷酸乖复基元的SSR类型,为39.3%;四核苷酸重复基元的SSR类型最少,为1.2%.设计40对SSR引物对5个辣椒疫霉菌株基因组DNA进行PCR扩增,有27对引物扩增出SSR特征条带,其中有18对引物在5个辣椒疫霉菌株间扩增出多态性条带25条.基于SSR标记进行聚类分析,可将5个检测大豆疫霉菌菌株划分为3类.该研究是辣椒疫霉的SSR标记开发的首次报道,为辣椒疫霉的遗传变异和分子作图等分析提供了一种有效的分子标记系统.     

苹果EST-SSRs标记开发及其应用于苹果品种遗传多样性分析

该研究旨在分析苹果EST中SSR位点分布规律,开发苹果EST-SSR引物,探究基于EST-SSR的苹果品种遗传差异。从NCBI公共数据库中下载63 708条苹果表达序列标签(Expressed sequence tag,EST),首先利用MI-SA软件进行SSR位点查找,筛选出符合条件的SSR位点,利用Primer 5.0 Plus软件设计49对引物,用非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)研究这些SSR引物的PCR扩增产物,总结其特点,并回收部分产物测序,以验证其真实性。结果显示63 708条苹果的EST序列中有5 423条含有总计6 153个SSR位点。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占总SSR的50.38%、14.85%和15.47%。电泳结果显示有33对引物能在22个苹果品种中扩增出理想的PCR产物,其中25对引物能扩增出多态性条带,测序结果显示引物能扩增出目标片段。ES7-SSR分子标记体系的聚类结果与富士系苹果家族关系基本吻合。     

蝴蝶兰EST资源的SSR信息分析

对5 472条蝴蝶兰无冗余EST序列进行了SSR搜索,共检索出 376条EST含有419个SSR位点,平均每7.4 kb EST序列出现1个SSR.共有60种SSR的重复基元.其中二核苷酸和三核苷酸重复基元占丰导地位,分别占SSR总数的67.1%和30.3%:AG/CT在SSR基元中出现频率最高(46.1%).AT/A...     

牙鲆EST资源的SSR信息分析

应用生物信息学方法,对牙鲆EST-SSRs的分布频率及碱基重复特点进行了归纳与分析。结果表明,5 927条牙鲆非冗余EST序列通过在线搜索共检索出471个SSRs,分布于390条EST中,出现频率为7.95%,平均分布距离为7.9 kb。包括了112种重复基元,其中二核苷酸重复基元占主导地位,占总SSR的59.02%。AC是二核苷酸中的优势基元,占二核苷酸重复类型的16.91%。三核苷酸重复基元、四核苷酸重复基元和六核苷酸重复基元分布比较分散,三核苷酸重复基元中GAG数量最多,但仅占三核苷酸重复类型的7.26%。研究结果为牙鲆EST-SSR标记的开发及应用奠定了理论基础。