一种适合PCR反应的简便的DNA提取方法

Polymerase Chain Reacting(PCR)聚合酶链反应是一种选择性扩增长达2Kb或更长的DNA或RNA片段的方法。在靶序列的两侧加上合成的寡核苷酸引物,而后在相反重叠的方向上重复进行聚合酶催化的引物延伸,以合成特异性DNA,特异片段的末端是由两个引物的5′端限定的。 随着转基因植物的不断出现,PCR反应已成为检测植物体外源DNA存在的有效方     

利用简化的SDS法提取杨树基因组DNA

以杨树组培苗幼嫩叶片为材料,在室温下采用简化的SDS法快速制备其基因组DNA,并对制备DNA过程中的影响因子进行了初步研究。结果表明,采用此方法制备的基因组DNA在数量和纯度上可以满足聚合酶链式反应(PCR)的要求。另外,DNA提取缓冲液中添加一定浓度的PVP、β-巯基乙醇,有利于DNA提取。     

昆虫分子生物学分类技术及在植保上的应用前景

介绍了目前在昆虫分类鉴定中常用的分子生物学技术,包括分子杂交技术、PCR技术、RFLP技术、RAPD技术,SSCP和DSCP技术、DNA条形码。结合自身工作,对分子生物学昆虫鉴定方法在植保中的应用前景进行了阐述。     

聚合酶链式反应（PCR）技术在植物病害研究中的应用

聚合酶链式反应（PCR）是20世纪末出现的新兴生物技术。当前，该技术广泛应用于生物学、医学，以及植物病理学等诸多领域。本文介绍了PCR反应的原理、操作方法，综述了PCR技术在植物病害研究中的应用现状及前景。     

松材线虫分子生物学检测技术研究进展

概述松材线虫分子生物学检测技术的基础，介绍了DNA探针技术、基于PCR的检测技术和卫星DNA技术等分子生物学检测方法，并对PCR-RAPD、PCR-RFLP和PCR-SSCP技术进行了比较。     

降香黄檀DNA提取及其rDNA-ITS序列分子系统发育分析

以核糖体转录间隔区(rDNA-ITS)序列为分子标记,结合GenBank数据库中已有序列,阐明黄檀属内不同物种之间的分子系统发育关系。通过改良十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)提取降香黄檀总DNA,利用引物对rDNA-ITS序列进行聚合酶链式反应(PCR扩增)和序列测定。结果表明,基于rDNA-ITS序列测定、位点分析和系统发育树构建方法,可利用ITS序列进行黄檀属树种准确的分子鉴定,为其种类鉴定和种间分类地位提供分子生物学依据。     

桉树SRAP标记体系的优化及遗传多样性分析

为确立按树SRAP-PCR反应体系,并对桉树品种进行遗传多样性分析,以巨尾桉GL -9号嫩叶提取的DNA为模板,进行Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4个因素3个水平L9(34)正交试验,并比较了不同浓度模板DNA对PCR扩增效果的影响.结果显示:桉树的SRAP-PCR最佳反应体系为Mg2+2.5 mmol/L、dNTP 0.20mmol/L、引物0.4μ mol/L、Taq DNA聚合酶1.5U,DNA模板最佳浓度为10ng.利用最佳反应体系对桉树品种进行引物组合多态性筛选,从40个引物组合中筛选出多态性引物组合17个.挑选12个多态较高的引物组合对11个按树品种进行遗传多样性分析,通过PCR扩增,得到109个谱带.其中多态性条带95条,平均每个引物组合产生7.92个多态性条带,显示了相对较高的多态性.表明SRAP标记可应用于按树分子生物学研究.     

南方红豆杉叶绿体非编码序列PCR体系优化及引物筛选

PCR技术广泛用于分子标记、基因工程等领域,是植物系统发育及种群遗传结构等研究的基础。通过对影响PCR体系扩增的主要因子进行单因素试验,得出南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)叶绿体DNA(cpDNA)最优体系(30μL)为3μL 10×PCR buffer,1μLDNA模板(60 ng),4.2μL MgCl_2(3.5 m M),8.4μLdNTPs(0.7 m M),0.9μL引物(0.3μM),0.8μL Taq DNA聚合酶(2 U),10.8μL去离子水。利用该体系筛选出叶绿体DNA非编码区通用引物4对,分别为atp I-atp H、psb J-pet A、trn H-psb A和trn L-trn F。     

纵坑切梢小蠹分子生物学研究进展

纵坑切梢小蠹是欧亚大陆的主要森林害虫之一。文章系统综述了目前国内外分子生物学技术。包括PCR扩增后电泳分析、PCR-RAPD、PCR—RFLP分析和DNA序列分析等技术在纵坑切梢小蠹研究中所取得的一些重大成果，重点介绍了纵坑切梢小蠹起源及与近缘种的遗传学关系等最新研究进展。     

大肠杆菌表达重组Taq DNA聚合酶的分离和纯化

以插入Taq DNA聚合酶基因的pET-24a表达质粒转化E．coli菌株,表达Taq DNA聚合酶,用反复冻融的方法裂解菌体．表达产物为可溶性蛋白,采用Duo-Flow系统(Bio-Rad)及S柱,Tris缓冲液pH为7．5．以0-1 mol／L盐梯度洗脱方式,收集洗脱峰．透析去盐可得到高纯度的产品．经PCR反应与商品Taq酶的一个活性单位相比较,重组的Taq酶活性有1个单位．用该方法可以从1 L培养液中分离得到5．51 mg产品．     

分子生物学技术在水环境微生物研究中的应用

简述了核酸杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）扩增技术、分子指纹技术和克隆基因文库技术4种分子生物学技术,综述了4种技术在海洋、湖泊、河流和其它水生态系统中微生物多样性的研究进展,研究内容大致可分为三个方向：一是人类活动对水环境微生物多样性的影响;二是种群结构和污染之间的规律;三是菌株的筛选和利用,使人们可以在水环境保护、治理过程中变得更加高效、有的放矢。     

伯乐树ISSR分子标记体系的建立

从浙江省庆元县等地采集23份野生伯乐树单株叶片为试验材料,采用单因素对比试验和正交优化试验研究了模板DNA、Taq DNA聚合酶的用量,以及Mg~(2+)、dNTP、引物浓度和退火温度对PCR扩增的影响,建立伯乐树适宜的ISSR-PCR扩增体系,即20μL体系中含90ng模板DNA,1×PCR buffer,1.0mmol/L Mg~(2+),0.15mmol/LdNTP,0.5μmol/L引物,0.75U Taq DNA聚合酶,退火温度为50℃。     

桑天牛线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因的PCR反应体系优化

建立一整套适用于研究桑天牛线粒体细胞色素氧化酶I(mtDNA CO I)基因的PCR反应体系,研究不同地理分布的桑天牛遗传多样性。通过L_(16)(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验对缓冲液(Mg~(2+))、dNTP、随机引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA的浓度和退火温度、循环次数等影响PCR扩增的重要因素进行优化。试验结果表明,50μL反应体系及反应程序中各因素优化组合为:缓冲液(含Mg~(2+))0.9mmol/L,dNTP 0.15mmol/L,随机引物0.44μnol/L,TaqDNA聚合酶3.0U,模板DNA75ng;退火温度47℃,循环次数35次。     

海南木莲基因组DNA提取及ISSR反应体系的优化

通过对不同提取方法获得的海南木莲DNA质量进行分析,发现采用预先去杂CTAB法提取的海南木莲DNA比其它方法简便、高效,DNA杂质少,得率高;然后通过单因素实验设计对海南木莲ISSR—PCR反应体系进行优化,确立了适于海南木莲的ISSR反应体系,即20μL反应体系中含40 ng模板DNA、0.15 mmol.L-1dNTPs、0.40μmol.L-1引物、2.5 mmol.L-1Mg2+和1.5 UTaqDNA聚合酶;最后用16个海南木莲样品对优化体系进行检验,结果表明该体系扩增效果稳定,特异性高,可以用于海南木莲分子生物学的进一步研究。     

药用半枫荷基因组总DNA提取及ISSR-PCR反应体系优化

利用正交试验设计方法,对影响ISSR-PCR反应的Mg2＋、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶等因素进行优化的结果表明：在20μL PCR反应体系中含10×PCR Buffer,0.018μmol/L引物,4.0 mmol/L Mg2＋,15 ng/μL模板DNA,1.5 U Taq DNA聚合酶,4种dNTPs各0.15 mmol/L为半枫荷ISSR-PCR最适反应体系。     

杠柳ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

为建立适用于杠柳ISSR分子标记研究的扩增体系,进一步利用ISSR标记研究杠柳遗传多样性,探讨了杠柳ISSR分子标记中的各影响因素,分别对河北11个不同地区杠柳基因组DNA进行PCR扩增,在Taq MasterMix(康为世纪)基础上对影响ISSR-PCR扩增结果的模板DNA浓度、循环次数、引物退火温度进行梯度筛选。结果表明:在100条通用引物中共筛选出34条扩增条带清晰、整齐的ISSR引物;确立了适合杠柳ISSR分子标记的反应体系:总反应体积25μL,其中Taq MasterMix(含DNA聚合酶、MgCl_2、dNTPs、反应缓冲液以及稳定剂)12.5μL,模板DNA 1μL(70ng/μL),正向引物和反向引物各1μL(10μmol/L)。该体系的确立为今后利用ISSR技术对杠柳种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

云南金花茶SSR-PCR反应体系的建立与优化

以云南金花茶为试验材料,利用试剂盒法、SDS法及CTAB法3种方法提取其DNA,并对3种方法的提取结果进行比较;经初筛合成云南金花茶EST-SSR引物,并对影响SSR-PCR体系的Mg~(2+)、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物及模板DNA这5个因素进行L_(16)(45~)正交实验,以期建立较为稳定的云南金花茶SSR-PCR体系。试验结果表明:试剂盒法提取得到的云南金花茶DNA质量最好且符合SSR分子标记试验。各因素对PCR扩增效果的影响程度为:Mg2+引物 Taq DNA聚合酶 dNTP模板DNA。试验最终确定的金花茶SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为:2.0μL Taq Buffer、1.5μL Mg2+(25 mmol/L)、0.3μL dNTP(10 mmol/L)、0.2μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、前后引物各0.4μL(10μmol/L)、0.5μL模板DNA(50 ng/μL)、14.7μL ddH_2O。建立和优化云南金花茶SSR反应体系,可为云南金花茶不同种群的遗传变异研究提供基础。     

天师栗叶片DNA提取方法的建立

提取高质量的基因组DNA是开展分子生物学研究的重要前提之一。天师栗由于叶片含有较多的多糖、多酚类物质,常常导致DNA 的提取质量不高,严重影响了后续的分子生物学操作。本研究以树龄分别为600年、50年和4年的天师栗植株的成熟叶片为材料,建立了适合于天师栗叶片DNA 的提取方法(M1),并将其与3种常见植物DNA提取方法(M2～M4)进行了比较。结果表明:M1提取DNA的浓度范围介于207.19~488.98 ng·μL -1之间,平均值为308.42 ng·μL -1;纯度A260/A280比值介于1.90~1.98,平均值为1.93;A260/A230比值介于1.72~1.95,平均值为1.86;DNA电泳条带清晰,亮度适中,点样孔干净无污染;ISSR-PCR能扩增出条带清晰、稳定性好、多态性高的PCR产物。M1提取出的DNA在浓度、纯度、DNA条带、ISSR-PCR扩增产物方面均明显优于其它3种方法(M2～M4),适合用于天师栗叶片DNA 的提取。     

基于ITS序列的南岭黄檀分子鉴定

以南岭黄檀(Dalbergia balansae)为研究对象,采用改良CTAB法对南岭黄檀边材进行总DNA提取,利用引物对r DNA-ITS序列进行PCR扩增和序列测定,用MEGA软件进行系统发育分析,构建南岭黄檀及其近缘树种的分子系统发育树。结果表明:用改良CTAB法可以成功提取南岭黄檀边材总DNA,并在模板稀释倍数为1×10-2~1×10-3倍时可成功PCR扩增出r DNA-ITS序列,并基于r DNA-ITS序列测定和系统发育树构建的分子生物学方法,利用ITS序列对南岭黄檀进行分子鉴定,为南岭黄檀的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学根据。     

金樱子SRAP-PCR反应体系的建立与优化

以广西南宁产的金樱子叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化。结果表明:适用于金樱子SRAP-PCR的最佳反应体系为:反应总体积10μL,包含2.0 mmol/L Mg2+、0.4 mmol/L dNTPs、0.5 UTaqDNA聚合酶、3μmol/L引物、25ng DNA及10×PCR Buffer;各因素对PCR反应影响由大到小依次为:Mg2+、DNA、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶。用7份不同来源的金樱子材料对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定可靠。