大肠杆菌噬菌体分离及宿主谱研究

噬菌体具有特异性强、无残留、对人畜无感染性、容易筛选获得等独特优势,在无抗养殖趋势下潜力巨大。本研究从鸡场采集粪便样本,从中分离出大肠杆菌,再从粪便样本中分离、纯化出噬菌体,测定纯化后噬菌体的效价,并对噬菌体的噬菌谱进行研究。结果表明:噬菌体可以裂解大肠杆菌;分离到的噬菌体为宽宿主谱噬菌体,但有一定的局限性。     

致仔猪痢疾沙门氏菌特异性噬菌体的分离与纯化

【目的】筛选仔猪痢疾病原菌沙门氏菌特异性噬菌体,为噬菌体制剂的研制和仔猪痢疾的生物防治提供参考。【方法】从患痢疾仔猪粪便中分离致病菌沙门氏菌,鉴定后以其为宿主菌,从生活污水中筛选、纯化出特异性噬菌体,并以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为对照,检测该噬菌体的特异性。【结果】分离到了致病菌沙门氏菌,并得到了纯化的沙门氏菌噬菌体;经检测,该噬菌体只能裂解沙门氏菌,而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌没有作用。【结论】得到了纯化的可裂解沙门氏菌的特异性噬菌体。     

一株绒山羊源大肠杆菌噬菌体φPTK的分离鉴定及生物学特性分析

以从患羔羊痢疾的羔羊粪便中分离的1株大肠杆菌为宿主菌,从污水中分离纯化1株烈性大肠杆菌特异性噬菌体φPTK,并对其生物学特性进行研究,为研制一种替代抗生素的有效生物防治方法提供资源。双层琼脂平板培养后,噬菌斑呈现清晰透明、边缘光滑的圆形,直径2~3 mm。噬菌体φPTK生物学特性试验结果表明:φPTK对大肠杆菌的最佳感染复数为0.000 1;φPTK吸附和感染宿主菌的潜伏期为15 min,裂解期约195 min,裂解量93;噬菌体浓缩液经SDS-PAGE分析可以观察到至少6条蛋白质条带,相对分子质量为2.5×10~4~1.8×10~5,说明其蛋白质外壳至少含有6个结构蛋白;在30~90℃范围内φPTK的裂解活性均较强,30~40℃时活性最高,90℃处理90 min后仍然具有较强的活性;对酸碱的耐受力较强,p H值在5至9范围内均有较强的裂解活性,当p H值超过9后活性较低;对紫外线的耐受能力较强,经紫外线照射8 h后仍然具有较强的裂解能力。这株烈性大肠杆菌特异性噬菌体φPTK最佳感染复数较小,吸附和感染宿主菌的潜伏期短,裂解能力强,杀菌效果好,有较强的环境适应能力,具有研发成为有效防治羔羊大肠杆菌病的生物杀菌制剂的潜力。     

野猪源大肠杆菌的分离鉴定及肠毒素与耐药性分析

为探究1株从野猪粪便中分离的大肠杆菌致病类型及耐药表型,通过野猪粪便大肠杆菌分离纯化、培养特性分析、生化试验、16S rRNA基因分析、药敏试验,对野猪源大肠杆菌进行分离鉴定及耐药表型分析。并通过PCR扩增,对其携带的耐药基因和特定毒力基因进行检测。结果显示,在7份新鲜野猪粪便中分离出1株多重耐药大肠杆菌,该菌株对红霉素、四环素、头孢拉定、头孢他啶、林可霉素、氨苄西林和氨曲南等多类药物具有抗性。PCR扩增显示,该菌株携带有耐热肠毒素 STⅡ基因及mecA、blaOXA、blaIMP、carO、KPC-2、 ant(4′,4′)、 aph(3′)-Ⅱa、tetA和tetB等耐药基因。结果表明,该野猪粪便分离菌株为多重耐药产肠毒素大肠杆菌,研究结果为野猪源病源菌的致病性及耐药性研究奠定基础。     

大肠杆菌O157 Stx噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析

为研究大肠杆菌O157Stx噬菌体编码的裂解酶(内溶素)对肠出血性大肠杆菌的抗菌作用,克隆表达了大肠杆菌O157Stx噬菌体裂解酶,并检测其裂解作用和裂菌谱。利用PCR方法扩增大肠杆菌O157Min27株中Stx2噬菌体裂解酶基因(R基因),构建表达质粒pET28a(+)-lysEC1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。重组质粒在BL21中获得了高表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,经His-trapTM亲和层析柱纯化后,获得的重组LysEC1的纯度大于97%。体外裂解活性试验证实纯化的噬菌体裂解酶LysEC1对肠出血性大肠杆菌菌株具有很好的裂解作用,这为新型噬菌体抗菌生物制剂的研发提供了新的研发方向。     

活禽市场鸡源大肠杆菌的分离与鉴定

从山东聊城地区活禽市场鸡粪便中通过无菌操作分离、纯化得到纯种菌种34株,并进行革兰氏染色、镜检、生化鉴定试验。结果表明,34株菌均符合大肠杆菌(Escherichia coli)的培养特性。     

大肠杆菌噬菌体的研究进展

大肠杆菌病为畜牧养殖业常见疾病之一,目前临床上主要依赖于抗生素进行控制。随着大肠杆菌耐药性增强以及人们对食品安全意识的提高,急需寻找安全、高效的抗生素替代品。噬菌体是能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称,具有巨大的潜在应用价值。对近几年国内外有关大肠杆菌噬菌体的分布、分离纯化方法、保存方法、形态、p H值稳定性、温度稳定性、分子生物学以及应用方面作了简要概述,并对以后的科研和应用进行了思考和展望。     

猪、牛和兔粪中致病性大肠杆菌LEE毒力岛的检测分析

畜禽粪便中含有大量微生物,在发生传染性疾病时,粪便常常会成为重要的传染源.通过从种猪场、奶牛场和种兔场粪便中分离鉴定致病性大肠杆菌,并对分离到的大肠杆菌进行LEE毒力岛上eaeA基因的PCR检测,鉴定出含有LEE毒力岛大肠杆菌,调查携带LEE毒力岛的大肠杆菌在猪、牛和兔粪便中的存在情况.实验结果表明,猪、牛、兔粪便样品中携带LEE毒力岛的大肠杆菌检出率分别为12.9％、14.0％、22.5％.eaeA阳性的大肠杆菌应是导致仔猪、10日龄以内的初生犊牛和兔场断奶后幼兔发生腹泻症的主要细菌性病原.LEE毒力岛的检测能够作为大肠杆菌的诊断和流行分子病学调查的主要手段.     

1株鸡白痢沙门菌噬菌体的分离鉴定

以鸡白痢沙门菌C79-13为宿主菌,从粪便样品中分离到1株裂解性噬菌体SP17,并对获得的噬菌体进行纯化鉴定及生物学特性研究。结果表明:SP17噬菌斑清晰透亮,空斑直径达到5mm;最佳感染复数为0.01;该长尾噬菌体由正多面体头部(直径约60nm)和无收缩性尾巴(长约110nm)组成,对肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、德尔卑沙门菌及部分鼠伤寒沙门菌具有良好的裂解能力;生长曲线表明噬菌体SP17的潜伏期为10min,爆发期约为80min,爆发量为80PFU/cell;在温度30～60℃、pH值4～12条件下具有良好的稳定性。这一研究提示噬菌体SP17具有应用于沙门菌防控的前景。     

黄芩、黄连等对猪致病性大肠杆菌的体外抑菌试验

无菌采集发病仔猪的粪便和肠内容物,经细菌分离纯化培养、形态学观察、动物致病性试验,结果表明分离所得大肠杆菌为强致病性大肠杆菌。将黄芩、黄连、石榴皮、甘草、大黄、鱼腥草、苦参、地榆8种单味中药经水煮处理制成浓度为1g/mL的受试溶液,对所得的大肠杆菌进行体外抑菌试验。试验结果表明,不同的中草药对分离所得到的大肠杆菌具有不同的抑制作用。     

不同类型土壤中分枝杆菌噬菌体分离率的比较

为了解分枝杆菌噬菌体在自然界的生存环境,深入研究噬菌体在微生态环境中的作用奠定基础。以含柠檬酸和磷酸氢二钠的溶液为提取剂,从50份不同性质土壤中分离、纯化分枝杆菌噬菌体,电镜观察初步确定其分类;统计分析土壤类型、酸碱度、含水量、阳离子交换量、有机碳含量对噬菌体分离率的影响。共分离纯化到13株尾病毒目肌尾病毒科的分枝杆菌噬菌体。3种类型土壤的分枝杆菌噬菌体分离率分别为暗棕壤(41.2%)>黄棕壤(25.0%)>褐土(16.7%);土壤pH值、含水量、阳离子交换量对分离率影响呈规律性:pH值和含水量分别在7.45-7.95和13.7%-21.7%时分离率最高;当阳离子交换量为20.8-28.6 cmol/kg时,分离率随之升高而升高;未见有机碳含量对分离率的影响有明显规律。     

一种对mcr-1阳性大肠杆菌具有裂解作用的噬菌体生物学特性

本研究以携带多黏菌素耐药基因mcr-1的大肠杆菌SQ-P-E32为宿主菌,分析其对应的裂解性噬菌体的生物学特性。利用双层平板法,从江苏宿迁某猪场污水中分离对该菌具有裂解性的噬菌体,通过透射电镜和基因组酶切分析对噬菌体进行鉴定并命名为v B-Eco P-32,同时测定了该噬菌体的最佳感染复数、一步生长曲线、酸碱和温度耐受性、杀菌效力和裂解谱。结果表明,该噬菌体为短尾噬菌体科,其噬菌斑呈透明的圆形,外周无晕环;该噬菌体的最佳感染复数为100;潜伏期约为5 min,爆发期为55 min,裂解量为32;可耐受温度范围为30~60℃;当pH值为5~10时其效价稳定;当MOI=100.00时,其对大肠杆菌SQ-P-E32的裂解效果最好;v B-Eco P-32裂解谱较广,对猪源大肠杆菌(包括mcr-1阳性菌株)具有较好的杀灭作用。表明,噬菌体v B-Eco P-32在控制mcr-1阳性大肠杆菌感染方面具有较好的应用前景。     

生物制品公司周边环境中2株大肠杆菌噬菌体的分离鉴定

为了检测生物制品公司周边环境中噬菌体的种类及含量,以大肠杆菌(CMCC44102)为宿主菌,对生物制品公司污水处理厂污水样本中的噬菌体进行了分离纯化,并对纯化样本的一般生物学特性进行了鉴定。实验分离获得了2株噬菌体ΦL和ΦS,ΦL噬菌斑直径为1~2mm,ΦS噬菌斑直径为0.1~0.3mm。2株噬菌体在电镜下形态极为相似,均可见明显头部和尾部结构,头部呈正多面体,直径约为33nm;尾部较短,长约21nm,可见爪刺样结构。ΦL与ΦS的一般生物学特性大多相似,前者效价为2.129×10~(10) PFU/mL,后者为2.5645×10~(10) PFU/mL;2株噬菌体的最佳感染复数均为10;在37℃及以下温度均具有良好的稳定性;且均对宿主菌,即大肠杆菌(CMCC44102)具有高度属特异性。一步生长曲线结果表明,ΦL的潜伏期和爆发期均显著短于ΦS,说明ΦL生长能力强于ΦS。上述结果表明,生物制品公司周边环境中存在大量噬菌体,并对一些重要工程菌具有高度特异性,应高度关注并防止其对生物产品质量产生影响。     

一种大肠杆菌噬菌体新裂解酶的表达与活性检测

前期分离得到1株具有较强裂解能力的大肠杆菌噬菌体v B_Eco M-ep3。测序后发现,噬菌体v B_Eco M-ep3的裂解酶基因在大肠杆菌噬菌体中尚未报道,能够编码一种新的裂解酶,并与绿脓杆菌噬菌体裂解酶具有很高同源性。为了探讨该裂解酶对大肠杆菌和绿脓杆菌的裂解活性,克隆了v B_Eco M-ep3的裂解酶基因,经原核表达和纯化,体外评价了Lysep3裂解活性。结果表明:克隆裂解酶基因Lysep3长为492 bp;表达蛋白分子质量为17.7 ku;裂解酶单独作用时,对大肠杆菌和绿脓杆菌均不能裂解,但是能够显著抑制生长;与柠檬酸配合使用(0.5 mg/m L终浓度的Lysep3和0.5 mmol/L终浓度的柠檬酸),对大肠杆菌和绿脓杆菌均表现出较好的裂解能力,作用从2~24 h持续有效,细菌数量分别下降7.2倍和17.3倍。该结果表明,v B_Eco Mep3的裂解酶不但在基因序列上与绿脓杆菌存在进化关系,在功能上也具有相关性。该研究为解析裂解酶结构与功能的关系提供了一个良好的例证,同时有助于裂解酶的广谱性改造。     

致犊牛腹泻埃希氏菌eaeA基因克隆和序列分析

旨在确定新疆地区致犊牛腹泻病中埃希氏大肠杆菌的基因型。从采自阿克苏周边的3个奶牛场30份患腹泻的犊牛粪便中分离、纯化、鉴定出34株埃希氏大肠杆菌。根据GenBank公布的大肠杆菌的eaeA基因序列,用Oligo 6.0软件分别设计2对特异性引物,利用聚合酶链式反应，对所分离大肠杆菌eaeA基因进行PCR扩增。结果表明，有4株PCR 产物为918 bp的目的片段,阳性率为11.8%(4/34)。将阳性样品进行序列分析，结果与已发表的序列同源率为100%。所测序列呈递GenBank数据库，得到序列登陆号为JQ350701、JQ350702、JQ350703和JQ350704。     

山东省肉鸡养殖场大肠杆菌的分离鉴定及抗药性监测

近年来,由于抗菌药物广泛应用于动物和人类疾病的治疗和预防,导致各种细菌对抗生素的抗性急剧增加,尤其是大肠杆菌的多重耐药性。为了解山东省肉鸡养殖场大肠杆菌的抗药性情况,本研究于2018—2019年从山东省3个规模化养鸡场采集123份新鲜粪便样品,对其进行大肠杆菌的分离和鉴定,并利用微量肉汤稀释法对大肠杆菌分离株进行药敏试验。结果显示,从123份新鲜粪便样品中共分离到123株大肠杆菌;全部分离株对多西环素耐药,对美罗培南敏感。大肠杆菌多重耐药率为99.2%,对9种抗生素耐药的菌株多达34株。本研究结果可为养鸡场中抗生素的规范使用提供理论依据。     

患腹泻症状食蟹猴寄生虫和致病菌鉴定与诊断

[目的]了解广西食蟹猴出现消瘦、腹泻、血便等症状的病因。[方法]采集20份食蟹猴粪便样本，进行寄生虫检测、分子生物学检测和细菌分离鉴定，并对分离菌进行动物致病性和药敏试验。[结果]20份粪便样本均检测出大肠杆菌，12份粪便样本检测出肺炎克雷伯氏菌，10份粪便样本检测出结肠小袋纤毛虫。10份粪便样本为三重感染，2份粪便样本为细菌二重感染。大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌均可导致小鼠死亡，且2种分离菌对阿米卡星、头孢他啶、头孢西丁、头孢噻呋钠均高敏。[结论]结肠小袋纤毛虫、大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染是引起食蟹猴消瘦、腹泻、血便的主要原因。     

食菌蛭弧菌的分离鉴定初报

从鸡场三批鸡粪便的污水中，以鸡大肠杆菌Ｏ５０、新分离的鸡大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌作为被捕食菌，分离出二株食菌蛭弧菌，这些蛭弧菌在３０℃中培养３￣５ｄ出现蚀斑，以后蚀班面积逐渐扩大。     

NDM-5阳性大肠杆菌裂解性噬菌体的生物学特性

NDM-5基因是在动物源细菌尤其是鸡源大肠杆菌中主要流行的碳青霉烯类耐药基因,携带该基因的菌株呈现多重耐药性,传播能力强,被称为"超级细菌"。本研究以携带NDM-5基因的鸡源大肠杆菌SQ-C-E5为宿主菌,从污水中分离了对该细菌具有裂解作用的噬菌体,命名为vB_EcoM_Bp5。通过透射电镜观察,最佳感染复数测定,一步生长曲线绘制,杀菌试验,热稳定性及酸碱稳定性测定等试验分析该噬菌体的生物学特性。结果表明,该噬菌体为肌尾病毒科,其噬菌斑透亮,无晕圈,最佳感染复数为10,潜伏期为5 min,爆发期为65 min,该噬菌体在温度为30~60℃和pH为5~10时较稳定,并且噬菌体vB_EcoM_Bp5的裂解谱较广,对多株NDM-5阳性和阴性大肠杆菌都具有裂解作用。因此,噬菌体vB_EcoM_Bp5在防治携带NDM-5基因的大肠杆菌方面具有潜在应用价值。     

一株可裂解耐黏菌素大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及全基因组分析

为研究耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗方法,本研究以耐黏菌素大肠杆菌为宿主菌,采用双层琼脂平板法从山东烟台某养鸡场污水样中分离纯化得到裂解性噬菌体SDYTW1-F1-2-2。通过透射电镜观察,最佳感染复数,一步生长曲线,温度稳定性,酸碱度稳定性等生物学特性测定,并对其进行全基因组测序分析。结果表明：1）噬菌体SDYTW1-F1-2-2噬菌斑呈现透亮,外周无晕圈,形态学观察显示其具有可伸缩性尾鞘。2）生物学特性分析表明,噬菌体最佳感染复数为0.1,潜伏期为50 min,爆发期为40 min,爆发量为（331±9）PFU/cell。在温度4～40℃,pH为4～12的环境下,噬菌体活性较为稳定。3）通过噬菌体全基因组测序及核酸类型鉴定显示,该噬菌体基因组全长为74 752 bp,双链DNA,GC含量42.1%。在噬菌体基因组中共鉴定出121个编码蛋白（CDS）,包括结构组成、DNA代谢与复制和包装以及细菌裂解相关的功能基因,发现一个tRNA基因,且未检测到如stx-1等致病性基因和mcr-1等耐药基因相关的基因。综上,噬菌体SDYTW1-F1-2-2裂解谱较宽,具有良好的酸碱性、热稳定性以及安全...