云南马铃薯青枯病菌的PCR检测

利用针对马铃薯青枯病菌 hrp 基因族DNA序列设计合成特异性寡核苷酸引物(引物1:5'GAAGAGGAACGACGGAAAGC-3'和引物2:5'CGAACAGCCCACAGACAAGA-3'),进行马铃薯青枯病菌PCR特异性扩增试验.该试验合成的引物能从马铃薯青枯病菌总基因组DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增青枯病菌 hrp 基因区段1993 bp 的分子片段.该试验结果为马铃薯青枯病菌的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术和方法.     

云南马铃薯青枯病菌的PCR检测

利用针对马铃薯青枯病菌hrp基因族DNA序列设计合成特异性寡核苷酸引物（引物1：5‘GAAGAGGAACGACGGAAAGC-3‘和引物2：5‘CGAACAGCCCACAGACAAGA-3‘）,进行马铃薯青枯病菌PCR特异性扩增试验。该试验合成的引物能从马铃薯青枯病菌总基因组的DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增青枯病菌hrp基因区段1993bp的分子片段。该试验结果为马铃薯青枯病菌的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术的方法。     

马铃薯蛋白酶抑制子StPI基因的克隆及表达分析

 【目的】克隆马铃薯蛋白酶抑制子基因StPI的全长cDNA。【方法】以马铃薯高抗青枯病二倍体基因型ED13为材料，采用RACE方法进行StPI基因全长cDNA的克隆，利用半定量RT-PCR方法进行该基因的诱导表达分析。【结果】获得了StPI基因的全长cDNA，序列分析表明：该基因具有完整的开放阅读框架，编码116个氨基酸，与马铃薯蛋白酶抑制子 I 前体具有较高的同源性（核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89%和74%）。该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节，在6～12 h内即达到最高表达水平，但二者又有明显不同。相对而言，StPI基因受青枯病菌的诱导较弱，而受茉莉酸（JA）的诱导较为强烈，在JA处理3 h表达量即明显升高，6～12 h迅速升至最高。【结论】本研究从马铃薯抗青枯病基因型ED13中获得了StPI基因的全长cDNA。该基因可能参与了马铃薯的抗青枯病反应，且病菌处理对该基因的诱导可能与JA刺激具有相似或相同的信号途径。     

鲜切马铃薯实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

[目的]选择鲜切马铃薯实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析中合适的内参基因。[方法]以受到高温、光照等胁迫的鲜切马铃薯为材料,应用qRT-PCR技术,分析18S rRNA、GAPDH、Actin和EF1a 4个常用内参基因的表达情况。[结果]经GeNorm软件分析发现,当利用qRT-PCR分析比较鲜切马铃薯中的基因表达差异时,可选择Actin作为校正内参基因。[结论]该研究为进一步开展鲜切马铃薯分子生物学研究奠定了方法学基础。     

马铃薯PGA1基因的克隆及序列分析

糖苷生物碱是马铃薯块茎中普遍存在的一种有苦味的毒性甾类生物碱,其毒性可使人、动物变畸形或死亡,PGA1基因是催化糖苷生物碱合成的关键酶基因。通过同源克隆的方法,采用RT-PCR技术对马铃薯大西洋品种的PGA1基因进行克隆,获得了PGA1基因的c DNA序列;并对马铃薯PGA1基因进行生物信息学分析。结果表明,PGA1基因的CDS全长为1 497 bp,编码498个氨基酸,所编码蛋白的分子质量为57.087 ku,理论等电点为9.29,为不稳定蛋白;该蛋白的二级结构包括α螺旋(52.41%)、β转角(6.02%)、延伸链(12.85%)和无规则卷曲(28.71%),其中,α螺旋和无规则卷曲为主要元件,与预测的蛋白质三级结构一致。研究结果可为进一步深入了解PGA1基因的功能和调控机制,利用基因工程技术调控马铃薯中糖苷生物碱含量提供理论依据。     

马铃薯块茎淀粉合成相关基因在脱落酸和蔗糖诱导下的表达分析

【目的】在马铃薯块茎中确定能够促进淀粉合成基因表达的脱落酸(abscisic acid,ABA)和蔗糖处理体系。【方法】利用不同的溶液和条件,对马铃薯幼嫩块茎进行ABA、蔗糖和ABA+蔗糖处理;采用实时荧光定量PCR检测处理块茎中直链淀粉合成关键酶(granule-bound starch synthaseⅠ,GBSSⅠ)基因、支链淀粉合成关键酶(starch branching enzymeⅢ,SBE3)基因和淀粉合成限速酶大亚基(ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit 3,APL3)基因的表达,确定处理体系能否诱导基因表达;确定处理体系后,进一步检测其他9个淀粉合成基因的表达。【结果】实时荧光定量PCR检测表明：当处理溶液中包含氯化钙、琥珀酸钠和氯霉素等试剂,且马铃薯块茎置于处理溶液中28℃黑暗处理36 h时,与对照相比,ABA或蔗糖处理可明显升高GBSSⅠ和APL3的表达。对其他9个淀粉合成相关基因表达的检测结果显示：大部分合成基因正向响应ABA或蔗糖处理。【结论】本研究利用马铃薯块茎确定了能够促进淀粉合成基因表达的ABA和蔗糖处理...     

马铃薯卷叶病毒基因组的结构与功能综述

马铃薯卷叶病毒是影响马铃薯产量和品质的重要病害之一,对近年来国内外马铃薯卷叶病毒基因组、亚基因组及其功能基因研究的主要成果进行综述,为深入阐明该病毒的致病机理和抗病基因工程育种提供参考.     

马铃薯StASR基因的生物信息学分析及基因克隆

将拟南芥AtASR基因核苷酸序列作为查询序列,在NCBI数据库中进行BLAST比对,得到马铃薯StASR基因（GenBank登录号：XM＿006359742）的序列。通过生物信息学分析发现,该基因位于4号染色体上,基因长度为654 bp,编码108个氨基酸残基,其编码的蛋白质具有典型的ABA/WDS保守结构域。启动子区域分析后发现,马铃薯StASR基因含有水分响应元件MYCATERD1、冷胁迫响应元件DRECRTCOREAT和盐胁迫响应元件GT1GMSCAM4等多种与非生物胁迫响应相关元件以及马铃薯生长发育相关顺式作用元件,对其进行蛋白质互作网络的分析发现与低温、水分胁迫等基因互作。用PCR技术成功的克隆到马铃薯StASR基因,其结果可以为深入研究马铃薯StASR基因的功能提供基础。     

三重 PCR 快速检测 H7N9 亚型流感病毒方法的建立

为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法,根椐GenBank中H7亚型流感病毒的HA基因、N9亚型流感病毒的NA基因和所有亚型流感病毒M基因的保守序列,分别设计了3对特异性引物,优化反应条件,并通过特异性试验、敏感性试验,建立了H7N9亚型流感病毒三重PCR检测方法。利用该法对H7N9亚型流感病毒进行扩增,可得到3条特异性条带(HA基因304bp,NA基因160bp,M基因458bp),其他亚型流感病毒只出现1条特异性条带,大小为458bp,对其他病原体的检测均无扩增条带。敏感性试验结果表明,该法最低能检测到0.6pgH7N9亚型流感病毒。用该法对470个样品进行检测,未发现H7N9亚型流感病毒。该法具有快速、敏感和特异等优点,可为临床检测和疾控防控提供技术支持。     

山西省马铃薯Y病毒cp基因的克隆

[目的]对山西省马铃薯Y病毒cp基因进行克隆与序列特征分析。[方法]依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了一对引物PVYP1和PVYP2,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,对RT-PCR扩增得到的基因片段进行序列测定。[结果]该DNA片段1～798bp为马铃薯Y病毒印基因,799～1064bp为3’非编码区序列,可编码265个氨基酸。将RT—PCR产物与载体连接后转入大肠杆菌提取阳性克隆的质粒DNA,酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,重组质粒已转入大肠杆菌。BLAST软件分析表明,山西省马铃薯Y病毒分离物CP氨基酸序列与已公布的PVY CP氨基酸序列相似性最高可达100％,说明所得DNA片段确为PVY cp基因片段。[结论]该研究为对山西省马铃薯Y病毒的防治提供理论依据。     

梨CBL基因家族全基因组序列的鉴定及非生物胁迫下的表达分析

【目的】最近在植物中发现了一类Ca²⁺传感蛋白--类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL（calcineurin B-like proteins）,CBL及其靶蛋白CIPK（CBL-interacting protein kinase）构成CBL/CIPK信号网络系统,在植物干旱、盐渍、低温等逆境胁迫应答中起重要作用。鉴定梨基因组中CBL家族基因成员,对其基因进化、结构与表达特征进行分析,为植物CBL基因功能分析与利用提供依据。【方法】通过生物信息学手段,结合梨基因组注释信息,鉴定梨CBL家族成员序列信息;利用MEGA6.0程序进行多序列比对、分类并构建系统进化树;利用per1程序、GSDS工具以及Clustal X软件进行基因结构与保守性分析;通过qRT-PCR技术进行多种非生物胁迫处理下PbCBLs表达分析。【结果】成功鉴定出7个CBL家族成员,基因结构预测表明PbCBL9含5个内含子,其余PbCBLs均含有7-8个内含子;预测的PbCBLs均含4个EF-hand功能域,且相邻EF-hand功能域之间氨基酸数目非常保守;通过系统发育树分析,将7个PbCBLs分为2类;qRT-PCR技术进行不同胁迫处理下杜梨叶片PbCBLs的表达分析,结果表明,在NaCl胁迫下,PbCBL1表达量6 h降至最低,24 h则明显升高;与之相反,PbCBL2和PbCBL3的表达量在6 h达最高,24 h最低;PbCBL4和PbCBL8表达量在3 h明显增加,随后表达量下降;PbCBL9表现明显的上调趋势,24 h达到最大;PbCBL10则在6 h表达量最高。10%（w/v）PEG6000胁迫处理下,PbCBL2、PbCBL4和PbCBL8表达量上调,PbCBL1表达量下调;PbCBL3、PbCBL9和PbCBL10表达量均在6 h最低,12 h和24 h较6 h明显升高,PbCBL3和PbCBL10于24 h表达量达到最高,而PbCBL9在12 h表达量最高。4℃低温处理下,PbCBL2、PbCBL4、PbCBL8表达量上调;而PbCBL1和PbCBL3表达量下调;PbCBL9和PbCBL10表达量表现上下波动的变化趋势,均在3 h有明显增加,随后显著降低。42℃高温胁迫处理下,PbCBL1、PbCBL3和PbCBL4表达量下调;PbCBL2表达量整体上调,6 h达到最高;PbCBL8、PbCBL9和PbCBL10总体呈现相同的变化趋势,在3 h表达量达到最高,随后明显下降。ABA处理下,PbCBL3和PbCBL10表达量下调,PbCBL2与PbCBL8表达量上调;PbCBL1在6 h表达量最高;PbCBL4和PbCBL9表达量呈现相似的变化趋势,3 h明显升高,随后下降,24 h时最低。【结论】成功鉴定的7个候选PbCBLs中,2个基因（PbCBL8和PbCBL9）受盐胁迫诱导表达,3个基因（PbCBL2、PbCBL4和PbCBL8）分别受干旱、低温与ABA诱导表达。PbCBL2在高温胁迫下被强烈诱导可能意味着其在高温应答中发挥重要作用。     

香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1的克隆及序列分析

[目的]为香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1调控机理的研究奠定基础。[方法]根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的一个CBL基因片段,采用PCR方法克隆了MaCBL1基因全长cDNA序列并对其进行了初步的生物信息学分析。[结果]MaCBL1基因cDNA序列全长1 078 bp,编码213个氨基酸残基。多重序列比对结果显示,MaCBL1推导的氨基酸序列与其他植物来源的CBL基因的氨基酸序列同源性较高。遗传进化分析表明MaCBL1与其他植物如杨树、甘蓝、沙冬青、棉花和水稻的CBL基因的亲缘关系较近,并在同一个进化枝上。[结论]该研究为进一步研究香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白对香蕉生长发育、果实的成熟调控及对各种逆境反应的调控提供了依据。     

水稻类钙调磷酸酶亚基B蛋白质在逆境胁迫下的表达

【目的】了解水稻CBL蛋白质在逆境胁迫下的表达模式进而探讨水稻耐逆的分子机理。【方法】采用基于抗体的蛋白质组学策略,以超级杂交稻父本9311为材料,采用免疫印迹（western blotting,WB）技术调查了CBL家族主要成员在冷、热、旱、淹和盐胁迫等5种逆境中的表达特征。【结果】发现CBL1、CBL5和CBL6在冷胁迫中表达下调,CBL1和CBL2在热胁迫中表达下调,CBL1和CBL5在旱胁迫中表现下调,而CBL6、CBL8和CBL10在旱胁迫中表现上调,CBL1、CBL5、CBL6、CBL8和CBL10在淹涝胁迫中表达上调,而CBL2表现下调。【结论】鉴定了水稻在重要逆境胁迫下发生丰度变化的6个CBL蛋白质。     

两个甘蓝CBL基因的基因组解析

利用比较基因组学的方法从甘蓝基因组中鉴定出两个CBL基因,并对其结构、遗传进化、顺式元件进行了分析,以期为进一步研究这两个基因的功能和利用它们进行甘蓝抗逆分子育种提供有益借鉴。     

大白菜CBL家族基因的鉴定和遗传进化分析

利用拟南芥中的CBLs基因序列在GenBank中搜索比对大白菜的基因组序列和EST序列,鉴定出13个大白菜的CBL基因,分别命名为BrCBL1至BrCBL13,并对这些基因预测编码的蛋白序列进行特征分析和遗传进化比较分析,为进一步研究它们在大白菜逆境响应过程中的功能和利用它们进行大白菜抗逆分子育种奠定了基础。     

CBL/CIPK信号系统在植物细胞中的研究进展

从CBL蛋白家族,CBL蛋白下游靶蛋白CIPK以及CBL/CIPK在逆境胁迫中的表达模式等多个方面,介绍了CBL/CIPK信号系统在植物细胞中的一些研究进展。     

三个新的大白菜CBL基因的鉴定和特征分析

利用大白菜已知CBL基因序列,在公共核酸数据库中重新搜索比对大白菜的基因组序列,鉴定出3个新的大白菜CBL基因,并对这3个基因的结构、遗传进化和顺式元件进行了分析,为进一步克隆和研究这些基因的功能提供了有益借鉴。     

高粱CBL家族基因的鉴定和初步分析

植物CBL家族基因在逆境响应过程中具有重要功能。本文利用生物信息学的方法,从高粱的基因组中鉴定出8个CBL基因,并对这些基因的染色体分布、序列特征、遗传进化和蛋白基序进行了系统分析。结果表明,高粱的CBL基因分为3个不同的进化类群,它们在基因组中的分布是不均匀的。高粱CBL基因预测编码的蛋白大多含有3个EF一手型结构,而且它们被预测定位在不同的细胞组分中。这些结果说明高粱CBL存在结构上的分化,可能它们的功能有所不同,这为进一步研究高粱CBL基因的功能以及利用它们进行高粱的分子育种改良奠定了基础。     

小麦锌指转录因子TaDi19A对低温的响应及其互作蛋白的筛选

【目的】锌指类转录因子在植物逆境信号转导和非生物胁迫响应中发挥重要的作用。通过对小麦锌指转录因子基因Ta Di19A的耐冷性能进行鉴定,利用酵母双杂交技术筛选并获得与Ta Di19A互作的候选蛋白,以解析Ta Di19A介导的抗逆调控机制。【方法】通过对低温处理的小麦转录组测序结果进行分析,获得一个锌指类转录因子Ta Di19A。利用生物信息学的方法分析Ta Di19A的分子特性,用SMART在线工具进行蛋白结构分析;用GSDS和PHYRE2在线工具分别对Ta Di19A结构和蛋白三级结构进行分析;用Net Phos 2.0 Server数据库预测Ta Di19A蛋白磷酸化位点。以低温处理的小麦c DNA作为模板,通过SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR,检测Ta Di19A在低温处理不同时间段的表达模式。构建植物表达载体p BI121-Ta Di19A,通过花序侵染法转化拟南芥,用T3代拟南芥进行耐冷性鉴定,分析低温处理对转基因拟南芥的根长、鲜重和存活率的影响。检测转Ta Di19A拟南芥中抗逆相关基因表达变化,分析Ta Di19A调控植物耐冷性的作用机制。构建诱饵载体p GBKT7-Ta Di19A,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,将诱饵载体p GBKT7-Ta Di19A和小麦c DNA文库共转化酵母AH109感受态细胞,通过SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-α-gal显蓝反应筛选得到阳性克隆,测序和BLAST分析获得候选蛋白。【结果】小麦Ta Di19A编码区全长747 bp,编码248个氨基酸,分子量为28.03 k D,等电点为4.74,基因含4个外显子,3个内含子。Ta Di19A蛋白靠近N-端包含锌指结合结构域,C端为Di19结构域,预测的Ta Di19A蛋白三级结构包含2个α螺旋结构。磷酸化位点分析结果显示Ta Di19A蛋白含有12个丝氨酸、9个苏氨酸和3个酪氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR结果显示,Ta Di19A受低温胁迫诱导表达。正常生长条件下,转基因和野生型拟南芥没有明显差异,低温处理下,转基因拟南芥的根长明显大于野生型拟南芥,并且耐冷性强于野生型拟南芥。下游基因检测结果表明,低温处理后,CBL1、CBL2和KIN1等冷胁迫响应相关基因在野生型和转基因植株中表达量都升高,在转基因植株中的表达量显著高于野生型,表明Ta Di19A可能通过调节下游冷胁迫响应相关基因的表达提高转基因植物的耐冷性。通过对酵母双杂交系统筛选到的候选互作蛋白进行初步分析表明,这些候选互作蛋白主要参与植物体的信号转导和非生物胁迫响应过程,表明Ta Di19A在植物的逆境信号转导及非生物胁迫响应过程中发挥着重要作用。【结论】小麦Ta Di19A受低温诱导表达,过表达能够提高转基因拟南芥的耐冷性;而Ta Di19A功能的发挥可能需要其他蛋白的参与。     

植物CBL/CIPK网络系统逆境应答研究进展

大多数信号转导过程都伴随着细胞内钙离子浓度变化,CBL/CIPK信号系统是近几年在高等植物中发现的一类依赖于钙离子的信号系统,包括感知钙离子浓度变化的CBL蛋白(calcineurin B-like proteins)和与之互作的CIPK蛋白(CBL-interacting protein kinase)。研究表明CBL/CIPK信号系统在植物对逆境应答过程中起重要作用。在介绍CBL和CIPK的结构和特征基础上对不同植物CBL/CIPK信号系统在逆境应答中的研究现状况进行了综述,以期为基因工程改良作物抗逆育种提供新的思路和种质资源。