我国部分地区传染性羊痒病基因型的分布情况调查

引起羊痒病的病原朊蛋白是一种正常的唾液酸糖蛋白(PrPc)在三级结构发生改变后形成的异常蛋白(PrPsc)。该病的发生与绵羊朊蛋白编码基因PRNP遗传多样性密切相关,主要表现在PRNP第136、154和171位密码子组成的PRNP基因型与绵羊对痒病的抗病性的联系。根据已建立的一种利用荧光定量PCR扩增反应对羊痒病抗性基因进行筛选的方法,对我国部分地区的无角多赛特绵羊羊痒病基因分布情况进行调查,从而从品种选育水平上杜绝羊痒病的发生。     

朊蛋白在宁夏滩羊不同组织中表达的免疫组化研究

作者运用免疫组织化学技术,首次对我国一类保护物种宁夏滩羊各组织中朊蛋白(PrP)的分布进行定性、定位研究。结果显示,PrP在滩羊的大脑、脑干、小脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏及淋巴结均有表达,尤其在脾脏、肾脏、脑干、淋巴结中的表达量丰富,而肺脏检测结果为阴性。此研究确定了朊蛋白在滩羊各组织中的表达与分布状况,并优化了朊蛋白检测的技术条件,为羊痒病的诊断与检测提供技术支持。     

羊痒病研究进展

痒病是一类引起绵羊和山羊的神经退行性脑病,是目前世界上研究的热点问题之一。引起该病的病原是一种朊蛋白,它与宿主自身的正常朊蛋白在一级结构上是相同的,只是二级结构的构象有所不同。论文针对目前人们研究中发现羊痒病的病毒存在不同的毒株型,以及不同毒株型的分子特性做一综述。     

PrP106-126诱导的N2a细胞神经毒性中神经营养因子受体p75NTR的表达变化研究

神经元死亡是朊病毒病的主要病理学特征。朊蛋白多肽PrP106-126能够对神经细胞表现神经毒性,引起细胞凋亡。细胞表面蛋白神经营养因子受体p75^NTR的胞外区域可以与PrP106-126结合并产生促凋亡作用。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术,以及DNA Ladder和AnnexinV-FITC/PI双重染色流式细胞凋亡检测技术对p75^NTR介导的PrP106-126神经毒性分子机制进行了研究。结果发现在PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡过程中,p75^NTR的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高,以p75^NTR多克隆抗体sc-6189阻断PrP 106-126与p75^NTR的相互作用后,减弱了PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡效果。该研究揭示了PrP106-126诱导的N2a细胞毒性中p75^NTR受体的表达变化,为解释朊病毒病的发病机制提供了重要数据。     

用于免疫治疗朊病毒病的抗体片段的研究进展

朊病毒是一种感染性蛋白质,能引起一系列的被称为传染性海绵状脑病(TSEs)或朊病毒病的致命性神经变性型疾病.在哺乳动物中,朊病毒通过招募普通的细胞蛋白(PrPc)并诱导其转化为具有致病性的PrPsc而实现自我复制.最近的研究结果表明,抗朊病毒的抗体能永久性地治愈被朊病毒感染的细胞.但是,全长的抗体和蛋白质不能通过血脑屏障(BBB),这妨碍了将其用于TSEs的体内治疗.采用另一种方式,即通过腺联病毒(AAV)转导将有朊病毒特异性的scFv传递到大脑内,尽管这不能完全保护其不受感染,但能延迟受感染小鼠的发病时间.通过直接向细胞培养物中加入羊痒病病毒或使用慢病毒和腺联病毒双转导载体使其感染,作者研究了重组的抗PrP(D18)单链可变片段(scFv)抗朊病毒的效果.结果表明,在感染细胞中重组的抗PrP scFv能够减少蛋白酶K的含量.另外,证实了与AAV相比,慢病毒能更有效的使抗PrP scFv基因转染并减少感染的神经元细胞中PrPsc的含量.最后,作者使用生物信息学的方法构建了D18scFv-PrP复合物的结构模型.有趣的是,根据反馈的结果,在D18scFv将PrPc锚定到抗体凹槽过程中,ArgPrP151(朊蛋白的第151位氨基酸)是一个关键的氨基酸残基.以上结果表明,将靶向PrP的被动和主动的免疫方法相结合,可能是治疗干预朊病毒病的一个可行策略.     

羊痒病概述

羊痒病(scrapie)是传染性海绵状脑病(TSE)的原型,目前在世界许多地方流行.该病是绵羊的一种缓慢发展的致死性中枢神经系统变性疾病,能引起绵羊和山羊中枢神经系统发生退化变性,病羊具有中枢神经系统变性、空泡化、星形胶质细胞增生等特点,病羊表现为共济失调、痉挛、麻痹、衰弱和严重的皮肤瘙痒,病畜死亡率达100%.该病是由正常的朊蛋白(FrPc)发生错误折叠而变成异常的蛋白形式(PrPsc)引起的.     

苔藓生物有望成为朊病毒的克星

可传播海绵状脑病是一类由朊病毒引起的神经性病变的总称,主要危害人类及其他多种动物,包括山羊、绵羊、牛、水貂、猫、狐猴等。目前发现有16种朊病毒病,其中人类朊病毒病有9种,动物朊病毒病有7种。引起该病的主要原因是细胞表达的正常朊蛋白发生空间结构变异并在神经中枢积聚后引起神经系统的病变,如疯牛病、痒病、     

朊蛋白生理功能的研究进展

朊蛋白（prion protein,PrPC）作为朊病的主要相关致病因子而受到广泛关注,虽然PrPC在疾病过程中的作用已有很多了解,但关于PrPC的正常生理功能还不是很清楚。就目前的研究而言,PrPC存在细胞核亚型和细胞质亚型两种形式,可与相应的配体及铜离子作用,并且通过细胞内吞或内陷方式被细胞膜获取;主要生理功能表现为保护神经系统,协助细胞的凋亡和分化、黏附,以及参与信号转导等。因此,文章对朊蛋白的生理功能作一总结,为朊病的治疗和朊蛋白的进一步研究提供了理论基础。     

用于免疫治疗朊病毒病的抗体片段的研究进展

朊病毒是一种感染性蛋白质,能引起一系列的被称为传染性海绵状脑病(TSEs)或朊病毒病的致命性神经变性型疾病。在哺乳动物中,朊病毒通过召募普通的细胞蛋白(PrPc)并诱导其转化为具有致病性的PrPsc而实现自我复制。最近的研究结果表明,抗朊病毒的抗体能永久性地治愈被朊病毒感染的细胞。但是,全长的抗体和蛋白质不能通过血脑屏障(BBB),这妨碍了将其用于TSEs的体内治疗。采用另一种方式,即通过腺联病毒(AAV)转导将有朊病毒特异性的scFv传递到大脑内,尽管这不能完全保护其不受感染,但能延迟受感染小鼠的发病时间。通过直接向细胞培养物中加入羊痒病病毒,或使用慢病毒和腺联病毒双转导载体使其感染,作者研究了重组的抗PrP(D18)单链可变片段(scFv)抗朊病毒的效果。结果表明,在感染细胞中重组的抗PrP scFv能够减少蛋白酶K的含量。另外,证实了与AAV相比,慢病毒能更有效的使抗PrP scFv基因转染并减少感染的神经元细胞中PrPsc的含量。最后,作者使用生物信息学的方法构建了D18scFv-PrP复合物的结构模型。有趣的是,根据反馈的结果,在D18scFv将PrPc锚定到抗体凹槽过程中,ArgPrP151(朊蛋...     

利用PRNP-/-羊制备朊蛋白多克隆抗体及其特性分析

<正>【目的】利用朊蛋白双基因敲除(PRNP-/-)羊制备朊蛋白多克隆抗体,并对其特性进行分析。【方法】构建山羊朊蛋白(PrP)原核表达载体,转入大肠杆菌并诱导表达,纯化获得羊PrP;将获得的PrP免疫PRNP-/-山羊,制备朊蛋白特异性的多克隆抗体;并对获得的朊蛋白多克隆抗体进行ELISA及Western-blot检测。【结果】获     

PrP基因在金黄地鼠淋巴和外周组织中表达水平的动态检测

利用实时荧光定量RT—PCR技术，构建了标准重组质粒，制备了标准曲线，对不同年龄金黄地鼠腹股沟浅淋巴结、脾、心、肝、肺和肾提取总RNA，反转录后进行PrP基因的表达定量。结果发现，淋巴组织呈现高的表达量，外周组织的表达量比较低；不同组织在不同年龄出现表达高峰。     

猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×10⁸至2.0×10²拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。     

HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

本试验旨在建立一种用SYBR GreenⅠ荧光染料检测HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR mRNA表达水平的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T)15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和熔解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时荧光定量RT-PCR方法,检测FMDV L蛋白对Ⅰ型IFN效应因子的抑制效果。HeLa细胞在转染FMDV L蛋白真核表达质粒,并受到Ⅰ型IFN刺激后ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR的相对表达量较转染空载体或表达GST的真核表达质粒明显降低。本试验建立了HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法,为在mRNA水平上对HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于FMDV L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路的研究中。     

禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型（FAdV-4）感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NLRP3。以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。通过反应条件优化,成功建立了检测NLRP3基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法对致病性FAdV-4感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行了分析。结果显示,所设计的NLRP3引物可特异性扩增鸡NLRP3基因,建立的实时荧光定量PCR对鸡NLRP3标准质粒的扩增曲线良好,标准品的拷贝数与Cq值呈现良好的线性关系。与对照组相比,NLRP3分子在FAdV-4感染鸡肝和脾中的转录水平极显著高于对照组（P<0.001）,在盲肠扁桃体和法氏囊的表达显著高于对照组（P<0.01）。本研究所建立的鸡NLRP3基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR可以检测FAdV-4感染鸡不同组织中NLRP3的转录水平;致病性FAdV-4感染所造成的组织炎症损伤与NLRP3分子密切相关。     

.基于TaqMan探针的牛布氏杆菌实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据牛布氏杆菌BM28保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105~5.0×101拷贝范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝每微升。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

B亚型禽偏肺病毒SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的B亚型禽偏肺病毒（JN224985．1）F基因序列设计1对特异性引物,经RT—PCR扩增出214bp的目的片段。回收目的片段并与pMD18-T载体连接后转化到基因工程菌DH5a中,提取重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后,筛选出阳性质粒作为模板,建立SYBRGreenI荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物T值在83．0～83．7℃之间,灵敏度为7．9×10^2拷贝／μL,特异性和重复性较好。本试验建立了检测B亚型禽偏肺病毒的sYBRGreenI荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断以及感染程度的定量分析奠定了基础。     

基于TaqMan探针的虎制品实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据虎线粒体细胞色素b核苷酸保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定虎制品的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,5.0×10⁵~ 5.0×10¹拷贝/μL范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝/μL。对豹、狮子、猫等7种非虎哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在虎制品的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

禽流感病毒HA-M2融合表位与EGFP蛋白在鸭胚成纤维细胞中的表达

本研究选择禽流感病毒H9N2株的HA的两个保守T细胞表位基因和M2基因胞外保守序列(M2e),经人工合成并通过PCR扩增获得HA-M2融合表位基因,将其与含有增强型绿色荧光蛋白的载体pEGFP-N1连接,构建了重组真核表达质粒HA-M2-pEGFP-N1。采用脂质体法转染体外培养的鸭胚成纤维细胞(DEF)后,通过RT-PCR、直接荧光观察和间接免疫荧光检测,结果表明,成功构建了重组真核表达质粒HA-M2-pEGFP-N1,且以HA抗原表位和保守的M2e序列为基础构建的重组蛋白能够在鸭胚成纤维细胞中成功表达。本试验为研制新型的禽流感通用疫苗,进一步探索HA基因与靶细胞相互作用及AIV的感染机理等奠定了基础。     

Establishment of SYBR GreenⅠ Fluorescent Quantitative PCR Detection Method for Coxiella bumetii Q Fever

Primers were designed based on insert sequence IS1111 of Coxiella bumetii of Q fever, SYBR GreenⅠReal-time quantitative PCR assay was developed for indentification of Q fever. The recombinant plasmid containing the target sequence was constructed to detect the sensitivity and prepare the standard curve. The method could detect 10² of the plasmid copy numbers.Related coefficient was 0.991 of the standard curve,the amplification efficiency was 98%.The results of specific detection of nucleic acid sample for M.tuberculosis,Chlamydia,Brucella and bovine blood were negative. SYBR GreenⅠfluorescent quantitative PCR method developed in this study had high Brucella sensitivity and specificity,and could be used for clinical test.     

Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。