β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体的构建

【目的】构建β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因具有功能性间隔序列的发夹结构（Intron-hairpin RNAi,ihp-RNA）的RNA干扰(ihp-RNAi)表达载体并转化大豆,为通过RNA干扰技术改良大豆的营养品质奠定基础。【方法】以大豆总RNA反转录获得的cDNA为模板,通过PCR扩增克隆了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的核心保守序列(400 bp),并将该片段的反义和正义片段插入到重组植物表达载体p3301P的种子特异性启动子7αp下游,将功能性间隔序列intron-SSR插入反义片段与正义片段之间,构建α′-亚基基因ihp-RNAi安全型表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,并进行PCR及双酶切鉴定。利用农杆菌介导法将带有p3301-PFNZ-α′-BADH 的菌株转化“吉农27”大豆植株,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,并对转基因植株α′-亚基基因的表达量进行RT-PCR。【结果】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,利用农杆菌介导法转化大豆得到7株阳性转化植株;Southern杂交结果显示,外源基因以1～2个拷贝整合于大豆基因组中;RT-PCR检测表明,β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的表达被明显抑制。【结论】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体,获得了α′-亚基基因被明显抑制的转基因大豆植株,为应用基因工程技术进行大豆品质改良奠定了基础。     

β-伴大豆球蛋白α′-亚基的基因克隆及原核表达

为制备N-连接糖基缺失的重组β-伴大豆球蛋白α′-亚基,以‘鲁96150’大豆种子为原料提取总RNA,经RT-PCR一步法获得‘鲁96150’大豆的全长cDNA,采用自行设计的引物F1/F2扩增得到目的基因α′,与pGEM-T easy载体相连构建重组克隆载体pGEM-α′,经XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切得到目的基因与载体pET-28a连接构建重组原核表达载体pET-28a-α′,将经菌落PCR、双酶切及测序鉴定正确的表达载体转入感受态细胞E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白α′-亚基。对重组α′-亚基的诱导表达条件进行筛选,发现在菌液OD600值为0.8、诱导温度30℃、IPTG浓度为0.2mmol/L的诱导条件下诱导9h后α′-亚基的表达量较高,重组α′-亚基的分子质量大小约为70ku;工程菌pET-28a-α′-BL21经超声破碎、离心后发现重组α′-亚基部分存在于上清液中,部分形成包涵体蛋白。重组α′-亚基的克隆及表达为β-伴大豆球蛋白结构及功能特性的研究奠定基础。     

小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α亚基cDNA片段的克隆和序列分析

利用简并引物，采用PCR等分子生物学技术，对小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)α亚基的cDNA片段进行克隆，并对序列进行分析。测序结果显示，扩增的目的基因片段包含了nAChRα亚基的3种亚型（分别命名为Pxαl，Pxα2，Pxα3）。都具有典型的α亚基的结构；2个相邻的半胱氨酸，由2个半胱氨酸之间二硫键形成包含15个氨基酸的胞外环，与烟碱和α银环蛇毒素结合有关的氨基酸残基，克隆的基因片段在氨基酸序列上和其他昆虫nAChRα亚基基因之间有高达65%-99%的同源性，表明克隆的cDNA片段是小菜蛾nAChRα亚基基因的部分序列。     

福建黄兔促卵泡素β亚基(FSHβ) cDNA序列的克隆与序列分析

从性成熟的福建黄兔母兔脑垂体中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的片段,获得长为390bp的黄兔促卵泡素β亚基cDNA片段。将扩增的片段与pMD18-T载体连接,转化至DH5α感受态细胞中。随机挑选阳性重组子进行鉴定、测序,将测序结果与包括人、奶牛、绵羊、水牛、小鼠在内的多种哺乳动物基因序列进行同源性分析,同源性相似度72.2%~96.5%,同时遗传进化分析结果表明,兔形目的FSHβ基因与灵长目动物的亲缘性更高。对福建黄兔与日本白兔已提交的FSHβ亚基的cDNA序列进行比较,发现在81bp及219bp处存在C→T和G→A两处突变,但未引起氨基酸变化。     

龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因(mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene),并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因全长序列;随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达规律。【结果】成功克隆龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因完整cDNA序列(GenBank登录号:FJ222749),该序列全长2099bp,由1677bp核苷酸组成的ORF,编码558个氨基酸。该基因与其它植物的线粒体ATP合酶β亚基基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面相似性较高。对来源于动、植物的28条线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所构建的进化树分析表明,由线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所建立的系统关系树与真实的动、植物进化基本一致,龙眼处在双子叶植物中,由于该基因在龙眼同科属的植物中为首次克隆,所以有自己单独的分支。qRT-PCR结果分析表明,随着龙眼体胚的发育,线粒体ATP合酶β亚基基因转录水平逐渐升高,到球形胚阶段达到最高,而后又急剧下降,到鱼雷形胚阶段降到最低,子叶形胚阶段略有升高。【结论】龙眼线粒体ATP合酶β亚基基因与其它植物相应序列具有较高同源性,在龙眼体胚发育过程中,以球形胚阶段的表达最高。     

刺五加ATP合酶β亚基基因的克隆与序列分析

[目的]克隆刺五加叶绿体的ATP合酶β亚基cDNA并对其进行生物信息学分析。[方法]根据已知物种叶绿体ATP合酶β亚基基因的序列,设计1对同源引物,通过RT-PCR扩增得到刺五加ATP合酶β亚基cDNA,并对其进行序列比对及结构预测分析。[结果]RT-PCR扩增获得了长1099bp的刺五加ATP合酶β亚基cDNA,该基因编码366个氨基酸。序列比对及结构预测分析表明,刺五加ATP合酶β亚基基因编码的氨基酸与水稻的同源性最高,达96.41%。其二级结构中含有171个α螺旋（alpha helix）,占46.72%;53个延伸链（extended strand）,占14.48%;27个β折叠（beta turn）,占7.38%;115个无规则蜷曲（random coil）,占31.42%。第262～271位氨基酸为ATP合酶β亚基的标志性位点。整个多肽链无明显的疏水区域,初步认定为亲水性蛋白。[结论]该试验克隆得到的ATP合酶β亚基基因为叶绿体ATP合酶β亚基基因,为研究刺五加能量代谢对植物次生代谢的影响及了解植物ATP合酶的结构与功能提供了必要的信息。     

刺五加ATP合酶β亚基基因的克隆与序列分析

[目的]克隆刺五加叶绿体的ATP合酶β亚基cDNA并对其进行生物信息学分析。[方法]根据已知物种叶绿体ATP合酶β亚基基因的序列,设计1对同源引物,通过RT-PCR扩增得到刺五加ATP合酶β亚基cDNA,并对其进行序列比对及结构预测分析。[结果]RT-PCR扩增获得了长1 099 bp的刺五加ATP合酶β亚基cDNA,该基因编码366个氨基酸。序列比对及结构预测分析表明,刺五加ATP合酶β亚基基因编码的氨基酸与水稻的同源性最高,达96.41%。其二级结构中含有171个α螺旋(alpha helix),占46.72%;53个延伸链(extended strand),占14.48%;27个β折叠(beta turn),占7.38%;115个无规则蜷曲(random coil),占31.42%。第262～271位氨基酸为ATP合酶β亚基的标志性位点。整个多肽链无明显的疏水区域,初步认定为亲水性蛋白。[结论]该试验克隆得到的ATP合酶β亚基基因为叶绿体ATP合酶β亚基基因,为研究刺五加能量代谢对植物次生代谢的影响及了解植物ATP合酶的结构与功能提供了必要的信息。     

莱芜黑猪FSHβ亚基基因的多态性分析

PCR扩增分析中国华北型优良地方猪种莱芜黑猪和产仔数与其差异较大的大约克夏，以及它们的杂交后代大莱猪在卵泡刺激素（FSH）β亚基基因结构区的多态性。通过测序发现莱芜黑猪在该区存在插入突变，插入片段长度为275bp，位于己发表的猪FSHβ亚基基因全序列的 809与 810碱基之间，插入片段中存在一个RNA聚合酶Ⅲ启动子及Alu I内切酶识别位点，末端有17个腺苷酸的poly(A),所以该片段可能为Alu成分。对FSHβ亚基基因插入片段进行BanH I多态性分析，发现本研究所检测样品中不存在BanH I多态性。把FSHβ亚基基因作为控制猪产仔数主效基因的候选基因与产仔数进行连锁分析，证明FSHβ基因座位在莱芜猪种中与控制猪产仔数的主效基因紧密连锁，优势基因AA纯合子比BB纯合子母猪平均每胎多产仔1.2头。因莱芜猪与太湖猪插入序列的主要差异是末端的poly(A)长短不同，故推测该插入片段末端的poly(A)结构亦可能影响猪的产仔数。     

华山松大小蠹β-肌动蛋白基因的克隆与组织表达

【目的】获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因序列,探讨其作为内参基因的可行性。【方法】通过比对其他昆虫β-肌动蛋白的氨基酸序列设计简并引物,用PCR的方法获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,进一步通过RT-PCR和qRT-PCR的方法,研究β-肌动蛋白基因在华山松大小蠹不同发育阶段和成虫不同组织的表达情况。【结果】获得了1 461bp的华山松大小蠹β-肌动蛋白基因cDNA序列,与其他昆虫肌动蛋白基因核苷酸序列的相似性在86%以上,且该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹、成虫3个发育阶段以及成虫的头、胸、腹、足、翅等组织中表达稳定,且表达量无明显差异。【结论】成功获得了华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,且该基因片段可以作为基因表达差异性研究的内参基因。     

猪FSHβ亚基基因结构区插入突变的研究

通过聚合酶链式反应(PCR)对长白猪、杜洛克、大白猪、民猪和野猪的卵泡刺激素β亚基基因(FSHβ)结构区插入片段进行扩增,统计了不同基因型在不同猪种内的分布情况以及5个群体的平衡状况,并对0.5 kb的扩增产物进行了克隆和测序。结果表明:A、B基因频率在民猪内的分布与在大白猪、长白猪和杜洛克内的分布均差异显著,而与野猪差异不显著,杜洛克则与其他4个猪种均差异显著;序列分析表明,在已发表的猪FSHβ亚基基因全序列的+809与+810碱基之间,5个猪种内均存在插入片段,对插入片段进行BamHⅠ多态性分析发现本研究所检测样品中存在多态性,无BamHⅠ酶切位点的插入片段为典型的逆转座子结构,有BamHⅠ酶切位点的则不是,所有插入片段中均存在一个RNA聚合酶Ⅲ启动子及2个AluⅠ内切酶识别位点,插入片段的位置正好是FSHβ亚基上的2个糖基位点之间,它的存在很有可能会影响到FSH的生物活性。     

棉铃虫Gq蛋白α亚基基因的克隆及组织特异性表达

 【目的】了解棉铃虫体内Gqα的组织特异性表达情况。【方法】利用RACE技术获得了Gqα全长基因，利用半定量RT-PCR研究了该基因的时空表达情况。【结果】从棉铃虫Helicoverpa armigera触角中克隆了一条全长1 101bp的Gqα cDNA序列，命名为GqαHarm；阅读框全长1 062 bp，编码353个氨基酸残基。GqαHarm与已报道的昆虫Gq蛋白α亚基同源性在90％以上，与近缘种甘蓝夜蛾Mamestra brassicae Gqα的同源性高达96.88％，与家蚕Bombyx mori Gqα的同源性高达97.73％。半定量RT-PCR研究表明，GqαHarm在棉铃虫雌雄成虫触角中表达，在头、胸、腹、足和翅中也有表达，并且表达量差异不显著；此外，在喙、下颚须和下唇须中也有表达；在卵、幼虫、蛹和成虫体内也都有表达；在卵中的表达量最高，而在成虫中的表达量最低，在幼虫和蛹的前、中、后期的表达量差异不大。【结论】研究表明GqαHarm是一种在棉铃虫体内普遍存在的蛋白。     

枇杷β-胡萝卜素羟化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物β-胡萝卜素羟化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以枇杷基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约450 bp的DNA片段,克隆人pMD-18T载体中,测得该基因片段长为440 bp,编码145个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在GenBank中进行同源性检索,结果该序列与苹果β-胡萝卜素羟化酶基因同源性为95%,证明它属于枇杷的β-胡萝卜素羟化酶基因。     

整合素β1和β2亚基胞内区的原核高效表达及纯化

【目的】构建整合素(Integrin)β1和β2亚基胞内区原核表达载体,高效表达整合素β1和β2亚基胞内区蛋白,为进一步研究其在细胞迁移和信号传导中的定位及其多克隆抗体的制备奠定了基础。【方法】采用PCR技术,从cDNA中扩增出整合素β1和β2亚基胞内区基因片断,并将其克隆到pGEX-4T2原核表达载体上,构建了GST-β1和GST-β2质粒,然后将GST-β1和GST-β2质粒分别转化E.coliBL21(DE3)表达菌,用IPTG诱导,成功表达了整合素β1和β2亚基胞内区蛋白,并利用Glutathione SepharoseTM4B对表达产物进行纯化。【结果】利用PCR扩增得到了整合素β1和β2亚基胞内区基因片段,并成功构建了GST-β1和GST-β2质粒;对GST-β1和GST-β2诱导表达发现,这2种融合蛋白均为可溶性蛋白,具有良好的生物学活性。通过纯化得到了高纯度的GST-β1和GST-β2融合蛋白。【结论】整合素β1和β2亚基胞内区基因可以高效表达,并具有良好的生物学活性。     

小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与序列分析

目的：构建小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA重组表达质粒，以便深入进行CK2结构与功能的研究。方法：通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA，PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶。将NdeⅠ/HindⅢ彻底双酶切PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去5′端磷酸的同样彻底NdeⅠ/HindⅢ双酶切的表达载体pT7—7中，转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子，用0．8％琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化予，将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行DNA测序。结果：转化子的阳性筛选率为100％，限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质拉的大小与理论推测值相符。DNA测序结果表明：两个重组小鼠CK2β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，但我们报道的这2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列一致。结论：本实验克隆的小鼠蛋白温酶CK2β亚基cDNA编码区序列可能是正确的序列。     

中华鲟促甲状腺激素β亚基基因（TSHβ）cDNA序列的克隆及其表达分析

【目的】克隆中华鲟(Acipenser sinesis)促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因,分析其序列特征和进化特征,研究其在中华鲟中的组织表达特征和不同年龄垂体中的差异表达,为中华鲟生长发育调控研究提供基础数据。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE),克隆中华鲟TSHβ,对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行序列特征分析和系统发生分析;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,对TSHβ-mRNA在中华鲟肝、心、脾、性腺、肠、垂体、下丘脑、中脑、端脑、小脑和延脑等组织中的表达状况,以及在1,3,5龄中华鲟个体垂体中的表达差异进行研究。【结果】克隆获得TSHβ基因,该cDNA序列全长649bp,5′和3′端非编码区分别为142和75bp;开放阅读框432bp,编码143个氨基酸。TSHβ亚基成熟多肽含有12个半胱氨酸(Cys)和2个N连糖基化位点。氨基酸序列多重比对表明,中华鲟TSHβ与促滤泡激素β亚基和促黄体激素β亚基的一致性分别为36%和35%,但与糖蛋白激素α亚基的一致性约为10%。与其他脊椎动物的TSHβ氨基酸序列进行比对发现,中华鲟TSHβ亚基与西伯利亚鲟一致性最高(98%);与鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类的序列一致性分别约为44%,55%,56%和60%;脊椎动物TSHβ的Cys和N连糖基化位点位置高度保守。TSHβ亚基仅在中华鲟垂体中有表达;3龄雄性个体垂体中TSHβ的表达量约为1龄的9倍,3龄和5龄雌性个体垂体中的表达量均约为1龄的5倍左右。【结论】成功获得了中华鲟TSHβ亚基基因,该基因具有与其他动物TSHβ相似的结构和表达特征;雄性个体表达量高于雌性个体,其在中华鲟个体的生长发育过程中表达量上升。     

利用RACE方法克隆小麦β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA

【目的】研究小麦抗条锈菌的分子机制,在受条锈菌侵染的非亲和组合小麦叶片中克隆一个新的β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA。【方法】采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增技术(RACE),在感染小麦条锈菌的小麦(水源11)叶片中进行-β1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的扩增。【结果】得到了一个1338 bp-β1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,Genbank上注册号为DQ090946,测序结果和序列生物信息学分析结果表明,其与-β1,3-葡聚糖酶基因gi3757681和gi6782375的同源性分别为94.3%和92.1%。该全长cDNA具有完整的编码框,编码334个氨基酸,Genbank上注册号为AAY96422,与-β1,3-葡聚糖酶CAA77085和AAA32958的同源性分别为95.8%和86.7%。【结论】初步推断此全长cDNA是小麦中编码-β1,3-葡聚糖酶的一个新基因。     

小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基基因TaBβ-1的克隆及其在非生物胁迫下的表达特性

【目的】克隆小麦蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基(PR55)基因TaBβ-1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为小麦抗逆育种提供候选基因。【方法】以小麦品种旱选10号为材料,通过电子克隆和RT-PCR获得TaBβ-1的全长cDNA序列,采用生物信息学软件分析TaBβ-1及其编码蛋白TaBβ-1的序列特征,预测其功能,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术分析该基因在小麦孕穗期不同组织中、不同生育时期新叶中的表达情况,以及在PEG、NaCl、低温及外源激素ABA等非生物胁迫下的表达模式,检测不同水分条件下成株期转基因拟南芥的叶片细胞膜稳定性。【结果】获得TaBβ-1的全长cDNA序列1931bp,其开放阅读框(ORF)为1539bp。该基因编码512个氨基酸,预测TaBβ-1蛋白分子量为57.1kD,等电点为5.87,含有PP2A调节亚基的1个CDC55保守结构域、1个alpha/beta结构域、2个PR55保守结构域和6个WD重复子。TaBβ-1在小麦孕穗期的根、穗、叶中均有表达,表达量依次为根穗叶;在不同生育时期的新叶中,苗期叶片的表达量最高。TaBβ-1的表达明显受PEG、NaCl、低温以及外源ABA的诱导。【结论】小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基家族基因TaBβ-1在小麦苗期叶片中的表达量明显高于根、穗以及其它时期的叶片;TaBβ-1参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫以及ABA处理的应答反应,但表达模式不同;在水分胁迫条件下,转基因拟南芥比野生型具有较高的细胞膜稳定性。     

水牛α-清蛋白基因3’端调控区的PCR克隆及序列分析

对水牛α-乳清蛋白基因的3’端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定,比较了水牛和牦牛该基因的核苷酸序列同源性。序列分析结果表明：水牛α-乳清蛋白基因3’端序列与牦牛该基因在641bp的序列中存在34bp的差异,同源性为94．69％。     

水牛α-清蛋白基因3′端调控区的PCR克隆及序列分析

对水牛α-乳清蛋白基因的3′端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定,比较了水牛和牦牛该基因的核苷酸序列同源性.序列分析结果表明:水牛α-乳清蛋白基因3′端序列与牦牛该基因在641 bp的序列中存在34 bp的差异,同源性为94.69%.     

珊瑚藻藻红蛋白β亚基脱辅基蛋白基因克隆与序列分析

首次报道珊瑚藻R-藻红蛋白β亚基基因的全序列.测定的基因序列长为983个碱基,包括β亚基起始密码子上游的10个碱基、β亚基编码区的534个碱基(编码177个氨基酸)、101个碱基的间隔区以及α亚基编码区近5′端的338个碱基(编码112个氨基酸).对其序列在核酸和氨基酸水平上的同源性与已知基因序列的9种红藻作了比较分析,认为β亚基氨基酸序列在红藻分类上具有重要意义.