慢病毒载体法制备转基因动物研究进展

慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体,已成为制备转基因动物的一种工具,转基因效率明显提高。该文介绍了制备转基因动物的技术方法,比较了慢病毒载体制备转基因动物的特点和优势,介绍了慢病毒载体安全设计的发展,并将近年来国内外利用慢病毒载体法制备转基因动物的研究进行了概述。     

猪精子与慢病毒作用机制的探讨

在制备转基因动物的方法中,精子载体法(与质粒结合)因操作简单而备受关注,但整合效率低,遗传稳定性较差,而慢病毒载体具有良好的感染效率和整合效果,慢病毒与精子孵育制备转基因动物是转基因方法的有益尝试。本研究采用这一新方法成功制备出转基因猪。为了探索精子与慢病毒的相互作用机制,首先制备慢病毒,经梯度稀释法测定其滴度为1.2×105 ifu/mL。然后,用DNA酶消化去除慢病毒液中载体质粒,将慢病毒液与精子在17℃下共孵育2h后,再用RNA酶消化慢病毒颗粒,对精子进行RT-PCR、PCR和FISH检测。结果提示,慢病毒颗粒可能进入精子中。该发现为这一转基因新方法的建立提供了理论依据。     

慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展

为提高慢病毒载体构建水平,提高转基因整体效率,作者综述了慢病毒载体结构及围绕改善生物安全性、提高目标基因装载量、扩大宿主范围而进行的慢病毒载体改造研究发展历程,指出新型慢病毒载体去除了病毒所有辅助基因,引入了外源调控序列,替换了包膜蛋白,大大提高了慢病毒载体的安全性、基因转移效率和表达效率,使宿主细胞类型更广范,而下游表达载体转染方法的研究又为转基因方法的集成与优化奠定了基础。慢病毒载体制备与多种转基因技术的优化集成,将有助于发展简便、高效、经济的转基因新技术,提高转基因技术的整体水平。     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒栽体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒载体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体在制备转基因动物中的最新进展

慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒，由于这类病毒的一个重要特点是毒粒中含有依赖RNA的多聚酶即逆转录酶，故现名为逆转录病毒。慢病毒载体（Lentivirus vectors）与简单的逆转录病毒载体相比，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞，转移基因片段容量较大，目的基因表达时间长，不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前制备转基因动物的载体之一。     

转基因动物制备技术

所谓转基因动物是指基因组整合有外源基因,并且能将外源基因稳定遗传给后代的一类动物。本文简要介绍了转基因动物制备技术的受精卵原核显微注射法、干细胞嵌合体法、体细胞克隆法和病毒载体法四种主要技术的原理、方法及优缺点。     

慢病毒载体的研究进展及应用

慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用。作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述。     

转座子在动物转基因研究中的应用

转座子是生物界中存在的一类可移动的遗传因子,它们在转基因和基因组进化中扮演了一个极其重要的角色.转座子技术已成为制备转基因动物的重要手段.论文综述了转座子及其在动物转基因领域的相关应用,并对转座子技术进行了展望.     

转基因动物在免疫学研究中的应用

转基因动物技术在分子免疫、免疫耐受、自身免疫、移植免疫、抗感染免疫和免疫防治等研究中的应用日益广泛。表达功能性重排的 T细胞抗原受体 (TCR)的转基因动物的应用加深了人们对 TCR基因重排、T细胞在胸腺中的发育过程、αβT细胞和γδT细胞分化途径及 T细胞免疫耐受形成机制的认识 ;免疫分子及其受体转基因动物成为研究其功能的直接手段 ;病毒及病毒受体转基因动物为研究病毒致病机制、抗病毒治疗及疫苗评价提供了新的模型 ;自身免疫病和用于移植免疫研究的转基因动物模型成为探讨疾病发病机制及治疗手段的有力工具。目前利用转基因动物已生产出多种抗体、干扰素、IL-2、TNFα、G-CSF、L F等诊断和治疗性生物活性蛋白     

转基因技术提高动物生产性能的研究进展

动物转基因技术是在基因工程、细胞工程及胚胎工程的基础上发展起来的一种综合性的生物技术.利用该技术,人类可以按照自己意愿去改变动物的遗传组成,提高动物生长率,改进动物脂肪质量、动物乳品质量以及羊毛产量和品质,还可获得用于治疗或预防人类疾病的转基因生物药品等.然而,动物转基因技术仍在探索之中,许多问题尚未解决,转基因动物的...     

诱导多能干细胞技术在猪转基因研究中的应用前景

长期以来,猪都是科学研究中重要的生物模型,转基因猪在生物模型、器官移植和动物良种繁育等方面有着极其重要的研究及应用价值,而现在的转基因克隆猪的成功率及成活率都普遍偏低。诱导多能干细胞技术在再生医学和畜牧业等领域有着广泛而诱人的应用前景,但目前还较少被应用于转基因猪的研究中。作者对转基因技术和诱导多能干细胞技术的发展历程,特别是诱导多能干细胞技术在猪转基因研究中的应用进行简述,以期为开展相关研究的科研人员提供一定的参考。     

现代生物技术与动物育种

本文概述了动物育种技术及其发展、现代生物技术的产生与现状,转基因动物技术、胚胎工程技术、动物克隆技术和各种分子生物技术及其对动物中育种技术的影响,并讨论了２１世纪动物育种的趋势和展望。     

转基因动物研究进展

转基因动物技术始于 2 0世纪 80年代 ,近 3 0年来 ,随着研究的深入 ,转基因动物的制作技术得到了突破性的发展。最初的原核注射法是应用最普遍、最可靠、效果最稳定的一种方法。但该方法存在价格昂贵 ,整合率低及不能定点整合的问题 ,所以近几年来转基因动物技术已出现了胚胎干细胞法 ,精子载体法 ,体细胞核移植法和人工酵母染色体法等一系列新方法。随着这些技术的不断发展 ,转基因动物技术应用正以其突出的优越性指导着多个领域的工作。目前 ,它的应用已渗透到基础理论、疾病动物模型、人异种器官移植、制药、畜牧兽医等领域。转基因动物应用正走向产业化的道路 ,具有十分广阔的前景。但作为一个新兴的技术 ,转基因动物研究还面临着一些急需解决的问题     

携带抗口蹄疫病毒ScFv基因猪成纤维细胞系的建立

根据口蹄疫病毒的感染特征及其在临床发病过程中呈现的症状,筛选抗口蹄疫病毒单链抗体基因。通过EcoRⅠ/NotⅠ双酶切中间质粒pGEX-ScFv获得单链抗体基因片段,并克隆至反转录病毒载体质粒pFB-neo,构建反转录病毒穿梭载体质粒pFB-ScFv。将pFB-ScFv与辅助质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装重组反转录病毒MMLV-ScFv。同时,构建含增强型绿色荧光蛋白基因的重组反转录病毒MMLV-EGFP作为对照。利用所包装重组反转录病毒感染猪成纤维细胞,通过G418筛选获得携带目的基因的单克隆细胞集落。试验结果表明,本试验在成功构建反转录病毒穿梭载体pFB-ScFv和pFB-EGFP的基础上,获得了分别携带抗口蹄疫病毒单链抗体基因和增强型绿色荧光蛋白基因的反转录病毒,并最终筛选出分别携带上述基因的猪成纤维细胞克隆,为抗口蹄疫病毒转基因动物的研究奠定了基础。     

转基因动物及其食品安全评价技术研究进展

在确保转基因动物及其食品安全的条件下,搞好转基因动物食品产业的发展,对于有效解决资源短缺,食物不足,促进国民经济可持续发展等方面具有重要意义.要切实保证转基因动物食品安全,就必须借鉴发达国家的先进技术,集成创新我国转基因动物及其食品的安全评价技术体系,为我国转基因动物及其食品的安全检测提供可靠的技术支撑.为此,论文参阅...     

现代生物技术在动物育种中的应用

本文介绍了转基因技术、胚胎工程技术、动物克隆技术以及分子生物技术等现代生物技术在动物育种中的应用,并讨论了现代生物技术目前存在的问题以及今后的发展前景。     

神经退行性疾病转基因猴模型的构建及相关技术体系建立

非人灵长类动物因与人有最近亲缘关系而成为研究人类生命领域最高级模式动物。本研究采用慢病毒载体技术结合胚胎工程技术,拟建立一套高效简便转基因猴制作技术体系,建立小脑共济失调转基因猴模型,为该病研究提供最为理想动物模型,同时为建立其他疾病转基因猴模型提供技术路线。利用卵泡浆内单精子显微注射技术(Introeytoplasmiesperm injection,ICSI)技术总共构建88个体外受精胚胎,经过体外培养共计32枚发育到原核期并进行病毒注射后移入7只受体猴输卵管内。B超妊娠检测,怀孕3只,其中:1只未能发育到期中间流产,1只发育到期生1死胎,1只顺产生1只活试管猴,经过人工喂养奶粉后健康存活,但经检测转基因为阴性。本研究虽然未能通过病毒注射获得阳性转基因猴,但对食蟹猴(Macaca fascicularis)超数排卵及B超监测卵泡发育技术、卵母细胞回收及体外成熟培养技术、电刺激采精及精子获能技术、食蟹猴体外受精技术和胚胎体外培养技术以及胚胎移植等技术体系进行多次探索和优化,并成功建立相关技术平台,将为后续利用试管猴技术结合高效的TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑工具获得各种疾病模型奠定基础。     

脂质体介导抗猪瘟病毒基因转染小鼠胚胎成纤维细胞的研究

本研究旨在探索脂质体介导抗猪瘟病毒基因重组质粒PGPUG/GFP/Neo转染小鼠胚胎成纤维细胞的条件,为构建疾病模型动物及抗猪瘟病毒转基因猪提供技术平台。本研究比较了不同的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养方法,将培养至3~5代的胚胎儿成纤维细胞,通过脂质体(LiPofectamine^TM 2000)介导转染抗猪瘟病毒基因重组质粒PGPUG/GFP/Neo。结果显示,在所选用的不同浓度脂质体和重组质粒,以及不同转染时间的组合中,2 μL脂质体介导1.5 μg重组质粒,转染6 h时可获得19%的转染效率,极显著高于其他剂量和时间组合(P＜0.01)。这些结果表明,脂质体、重组质粒及转染时间的优化组合,能有效介导抗猪瘟病毒基因重组质粒PGPUG/GFP/Neo转染小鼠胚胎成纤维细胞。     

CRISPR/Cas9 knock-in介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究进展

利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的生物技术。鸡输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免蛋白提取过程中对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。目前利用慢病毒结合原始生殖细胞(PGCs)制备转基因鸡被认为是最可行的方法,但因外源基因随机整合且生殖系传递效率较低,使转基因鸡研究受到技术上的限制。而2013年问世的CRISPR/Cas9基因敲入(CRISPR/Cas9 knock-in)技术能够使外源基因精准定向插入基因组特异性位点,这对生产输卵管特异性转基因鸡具有重大意义。文章综述了鸡输卵管反应器的研究进展、CRISPR/Cas9 knock-in技术在输卵管特异性表达转基因鸡研究和鸡育种领域的应用现状,并指出了目前存在的问题和相应的解决办法。