应用VirB12蛋白建立检测牛布鲁菌血清抗体的方法

从牛布鲁菌基因组中克隆出VirB12基因,以pET-28α(+)为模板构建VirB12原核表达载体pET-V12,pET-V12在E.coli BL21(DE3)中表达重组VirB12蛋白.经Western-blotting分析,表明重组的VirB12蛋白具有免疫原性.以纯化的VirB12蛋白为抗原,建立了间接ELISA检测牛布鲁菌抗体的方法.经对300份牛血清样品间接ELISA与虎红平板试验(RBPT)检测结果的比较,该方法的敏感性为89％,特异性为98.3％,准确度为92.7％.     

同时检测动物布鲁菌病和结核病胶体金抗体检测试纸条的研制

本研究分别以布鲁菌LPS和牛分枝杆菌MPB70蛋白作为检测抗原,建立了动物布鲁菌病和结核病双抗原夹心法胶体金抗体检测技术,并研制了同时检测动物布鲁菌病和结核病的快速抗体检测试纸条,用于动物布鲁菌病和结核病临床快速血清抗体检测。检测试纸条与其他病原无交叉反应,与牛、鹿口蹄疫血清、巴氏杆菌病血清、耶尔森氏菌病血清无交叉反应;敏感性高,临床采集的布鲁菌病和结核病阳性血清最大稀释倍数可以达到1:512;特异性好,准确率高。研制的检测试纸条与现有的检测方法具有较高符合率:与RBT检测布病结果阳性符合率为100%,阴性符合率为96%,总符合率为96%;与牛结核γ-干扰素ELISA检测结核病结果阳性符合率94%,阴性符合率为97%,总符合率为96%。试纸条检测卡在吉林省多个地区进行临床试验,具有快速、敏感、特异、操作简单、可以用于现场快速检测等优点,能够同时用于动物布鲁菌病和结核病的临床抗体检测。     

应用荧光偏振检测方法对出口牛进行布氏杆菌病检测

荧光偏振试验(FPA)是一种新的试验方法。本文应用荧光偏振检测方法对出口哈萨克斯坦的321份牛进行布氏杆菌病检测,结果有25份牛血清样品检测为抗体阳性。同时对321份血清进行虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、间接ELISA试验(I-ELISA)、竞争ELISA试验(C-ELISA)等比对试验,结果是FPA从敏感性和特异性上都优于或等于目前主要采用的RBPT、SAT、CFT、ELISA检测方法。FPA方法简便、快速、通量大,不需洗板,可在15分钟内完成92份样品的布氏杆菌病检测,极适合于大批量牛布氏杆菌病的检疫、筛查和疫病监控。     

3种国产布病抗体检测试剂盒的效果评价

为了比较国产布鲁菌病间接ELISA抗体检测试剂盒、竞争ELISA抗体检测试剂盒和胶体金试纸条的检测效果,通过对已知阴阳性血清样品的检测,比较了上述3种检测方法的敏感性和特异性。进一步采用临床血清样品比较了3种检测方法与虎红平板凝集试验(RBT)的检测效果,并采用补体结合试验(CFT)对结果进行了复核。结果显示,间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条的敏感性分别为96.67%,100.00%和98.33%,3种检测方法的特异性分别为98.33%,93.33%和93.33%。对300份临床样品的检测结果显示,4种检测方法共同检出的阳性样本为27份,阴性样品为210份,整体符合率为79%。通过CFT对63份不同方法检验结果有差异的样本进行确诊,结果表明RBT与CFT的符合率最低,仅为3.17%;间接ELISA与CFT的符合率最高,为98.41%;竞争ELISA和胶体金试纸条的符合率分别为87.30%,85.71%。结果表明,间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条具有良好的特异性和敏感性,能够满足布病临床检测需求;RBT对临床样本的检测存在较高比例假阳性和假阴性。     

牛布鲁菌荧光标记免疫层析试纸条快速检测方法的建立

为建立一种快速诊断牛布鲁菌病的方法,以原核表达、纯化的外膜蛋白OMP22作为抗原,以带荧光标记的IgG抗体作为标记物制备免疫层析试纸条,建立一种布鲁菌病快速检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行验证。结果显示,制备的试纸条最低可检出1∶100稀释的牛布鲁菌标准阳性血清,且与牛结核、牛蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛口蹄疫、牛巴氏杆菌病、牛白血病的血清无交叉反应;试纸条检测结果与商品化ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为93.5%。以上结果表明,建立的荧光标记免疫层析试纸条方法能快速检出牛血清中的布鲁菌抗体,具有良好的敏感性和特异性,是一种适合现场初筛的检测方法。     

布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。用本方法检测5株不同种的布鲁菌以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌。结果显示,5株不同种的布鲁菌均出现典型的"S"型扩增曲线,4株对照菌40个循环内均无CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁菌病流行地区3个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的敏感性明显高于B4/B5-PCR方法。试验表明,所建立的Cycling探针荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特点,可用于布鲁菌感染的快速检测。     

布鲁氏菌4种高通量抗体检测方法的比较研究

旨在科学选择和使用布鲁氏菌抗体检测方法,推动布病诊断试剂标准化。本研究用布病阳性血清标准品测定了国家/OIE布鲁氏菌病参考实验室开发的布鲁氏菌荧光偏振（FPA）抗体检测试剂盒、动物布鲁氏菌病竞争ELSIA （cELISA）抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA （iELISA）抗体检测试剂盒和改进的微量补体结合试验（mCFT）等4种方法的灵敏度。通过对已知阴、阳性血清样品的检测,比较了各检测方法的敏感性和特异性,并用临床样本进一步比较了各种方法检测结果的吻合性。结果表明,4种方法检测的灵敏度基本一致,当布病阳性血清标准品按1∶20稀释（即50 IU·mL^-1）时均检测为阳性,1∶40稀释（即25 IU·mL^-1）时均检测为阴性。FPA、cELISA、iELISA和mCFT方法的敏感性分别为97.14%、100.00%、100.00%、98.57%,特异性分别为96.34%、95.12%、97.56%、100.00%。对315份临床样本的检测结果显示,各方法之间的符合率均高于90.00%,其中iELISA、FPA、cELISA与mCFT符合率分别为97.14%、96.83%、92.70%;FPA、cELISA与iELISA符合率分别为95.24%、93.65%;FPA与cELISA符合率为91.43%。iELISA、FPA、mCFT 3种方法之间吻合性最高,cELISA与其他3种方法之间的吻合性略低。     

广西牛羊赤羽病和蓝舌病流行病学调查

为了解赤羽病病毒(AKAV)和蓝舌病病毒(BTV)2种虫媒病毒(Arbovirus)在广西的流行与分布情况,本研究对采集自2010年～2011年广西11市的706份牛、羊血清样品进行检测,共检测出AKAV抗体阳性样品382份,总阳性率为54.11％.其中山羊血清82份,阳性率为28.37％(82/289);牛血清300份,阳性率为71.94％(300/417).BTV抗体阳性样品279份,总阳性率为39.52％.其中山羊血清95份,阳性率为32.87％(95/289),牛血清样品184份,阳性率44.12％(184/417).同时检测出2种虫媒病毒抗体185份,占样品总数的26.20％.本研究结果表明2种虫媒病毒在广西广泛流行,并首次证明广西存在AKAV的感染.     

一起山羊流产衣原体感染的诊断

陕西省某山羊养殖场发生了一起山羊流产病,经流行病学调查,临床症状和病理剖检观察进行初步诊断;利用布鲁菌虎红平板凝集试验、衣原体间接血凝试剂盒对10份流产母羊血清检测;对病料进行细菌学检测;依据GenBank收录的山羊流产性衣原体基因组设计1对特异性引物,通过PCR方法从病料中扩增衣原体特异性片段。结果表明,根据临床症状和病理变化初步怀疑为布鲁菌和鹦鹉热亲衣原体感染;10份血清检测结果为布鲁菌病血清全部阴性,衣原体感染血清全部为阳性;细菌学检测结果为阴性;PCR结果获得523bp基因片段,测序结果与鹦鹉热亲衣原体100%相似。依据流行病学调查,临床症状和病理剖检观察,病原学和血清学诊断,最终确诊该病为鹦鹉热亲衣原体引起的山羊地方流行性流产。     

布鲁菌bp26基因的表达与bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

为了研制布鲁菌bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒,将布鲁菌bp26基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,以纯化后的重组蛋白bp26包被酶标板,优化ELISA反应条件,组装试剂盒。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,重组蛋白分子质量约为41 ku,经IPTG诱导后高效表达,且具有良好的免疫原性;优化试验确定重组抗原最佳包被浓度为3.6 μg/mL,血清样本的阳性临界值为0.370;特异性试验结果表明,重组蛋白与牛结核菌、副猪嗜血杆菌、链球菌等多种病原体的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果表明,血清稀释至1:12800时,仍检测为阳性;该试剂盒的批内、批间变异系数均小于10%;用该试剂盒检测241份临床牛血清样本,并与试管凝集试验(SAT)检测结果比较,两者符合率为97.1%。原核表达的布鲁菌bp26具有良好的免疫原性,研制的布鲁菌bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒敏感性、特异性和重复性较好,可为布鲁菌基因缺失标记疫苗的应用提供配套的血清学诊断方法。     

传染性支气管炎病毒(M41株)HI试验抗原的特异性和敏感性试验

采用本研究室制备的3批传染性支气管炎病毒(IBV,M41株)HI试验抗原,分别对100份和80份不同鸡血清进行IBV HI抗体检测,同时用IBV ELISA抗体检测试剂盒进行检测,比较两种不同方法检测的特异性和敏感性。结果显示,特异性试验中80份SPF鸡血清,自制抗原检测均为阴性,IBV ELISA检测79份为阴性,10份其他鸡病血清,两种方法检测9份均为阴性,10份IBV阳性血清两种方法检测均为阳性;敏感性试验中,74份已知IB疫苗免疫或IBV M41株感染鸡血清IBV HI检测72份为阳性,阳性检出率为97.3%(72/74),IBV ELISA检测74份均为阳性,阳性检出率为100%(74/74),SPF鸡血清及其他鸡病血清,两种方法检测均为阴性,两种检测方法总符合率为97.5%,差异不显著(P0.05)。试验结果证明,本研究室自制抗原具有良好的特异性,特异性为100%,抗原同时具有良好的敏感性,但IBV ELISA方法的敏感性要高于IBV HI方法。     

牛、羊布鲁菌多重PCR方法的建立与应用

根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列,设计合成了3对引物,以牛种布鲁菌544A、104M和羊种布鲁菌16M基因组DNA为模板,通过优化反应条件,建立了可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法。牛种布鲁菌可扩增出301和114 bp 2条带,羊种布鲁菌可扩增出301和253 bp 2条带,该方法对牛种布鲁菌544A和羊种布鲁菌16M混合DNA模板的最小检出量为100 pg,对大肠杆菌O157∶H7、小肠结肠炎耶尔森菌等15种参照菌的核酸扩增结果均为阴性。应用该方法对吉林省某牛场的106份粪便进行检测,虎红平板凝集试验作对照,结果PCR检测9份为阳性,且全为牛种布鲁菌阳性,对应的虎红平板凝集试验也为阳性。结果表明,建立的多重PCR方法具有良好的敏感性和特异性,为布鲁菌病的鉴别诊断提供了一种分子检测工具。     

BA-BLISA检测牛结核血清抗体的研究

本试验建立了 BA-BLISA 检测牛结核血清抗体的方法.以结核清净场604头牛血清,经 BA-ELISA 检测,阴性平均值 ()=0.18.以平均值 3倍标准差为临界值,检测了结核菌素(OT)变态反应阳性牛115头,BA-ELISA的阳性率为61.73%,比常规 ELISA 的阳性率(54.78%)提高6.95%.BA-ELISA 的敏感性是 ELISA 的4倍.对10头变反阳性、50头变反阴性牛的 BA-ELISA 检测结果,与病变及细菌学检查的阴、阳性符合率均为100%.对5种病牛血清(牛副结核、牛布氏杆菌病、牛腹泻粘膜病,牛白血病、牛传染性鼻气管炎)及3种分枝杆菌(草分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌)的免疫血清检测结果证明,BA-ELISA 具有较好的特异性,所建立的 BA-ELISA 是检测牛结核血清抗体的一种敏感性高、特异性强的新方法.     

规模化牛场奶牛衣原体和布鲁菌病相关抗体的检测分析

为检测并分析银川地区规模化牛场牛衣原体和布鲁菌病的相关抗体,采用鹦鹉热衣原体McAb-ELISA方法和布鲁菌虎红平板凝集试验(RBPT)方法进行特异性检测,应用McAb-ELISA方法与传统的IHA试验方法分别对同样50份待检牛血清进行衣原体抗体的比较检测。结果表明,银川地区的16个牛场1 161份牛血清衣原体总的阳性率为9.22%。布鲁菌的血清阳性率为13.26%。对50份牛血清采用2种试验方法同时进行衣原体抗体检测,ELISA阳性检出率为32%,IHA为24%。McAb-ELISA比IHA的特异性强。     

虎红平板凝集试验与试管凝集试验检测奶牛布鲁菌病的比较

布鲁菌病主要采用凝集试验来检测,本试验用虎红平板凝集试验和试管凝集试验对江苏海安、江都、无锡和兴化地区的660头奶牛的血清样品进行平行检测,虎红平板凝集试验的阳性检出率为9.7%,试验管凝集试验的阳性检出率为5.5%;与后者相比,虎红平板凝集试验的敏感性为100%,特异性为95.3%,符合率为95.6%。这些数据表明,江苏地区某些奶牛场存在布鲁菌感染,虎红平板凝集试验可以用于布鲁菌病初步检测。     

布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 bp片段的多重PCR快速检测方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法从布鲁菌标准菌株中扩增出了特异性的目的片段,而对大肠埃希菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过对10倍倍比稀释的模板进行检测,多重PCR的敏感度为最低可检出1.1×10-3ng的DNA,在感染布鲁菌病奶牛乳汁模拟标本中最低可检出细菌数为80 cfu/mL。不同人员用该方法重复检测,结果均一致,表明重复性好。应用该方法对88份临床疑似布鲁菌感染的奶牛乳样进行了检测,结果检出17份阳性,阳性检出率约为19.3%。检测结果表明,该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于奶牛布鲁菌病的临床检测及流行病学监测等。     

靖边县2010年—2012年羊布鲁菌病血清学调查

为了解陕西省靖边县羊布鲁菌的感染及分布状况,自2010年1月—2012年12月,采集陕西省靖边县羔羊、种羊等55 059只的羊血清样品,通过试管凝集反应对布鲁菌病抗体进行检测,分析羊布鲁菌的分布情况。结果显示,55 059份羊血清样品共检出阳性样品78份,其中羔羊样品阳性71份。种羊养殖场和养殖户因引进布鲁菌隐性种公羊造成2个养殖场出现77只病羊,4个养殖户出现117只病羊。羔羊布鲁菌抗体阳性率呈增高趋势,由2010年的0.04%上升到2012年的0.29%;由于引种造成的布鲁菌感染率较高。     

牛型结核菌素皮内变态反应试验和γ-干扰素ELISA试验检测奶牛结核病的比较研究

本研究采用PPD皮内变态反应试验和γ-干扰素ELISA试验,对甘肃省3个地区的1585头奶牛进行结核病检测.结果表明,PPD皮内变态反应共检出7份阳性样品;经γ-干扰素ELISA检测2份为阳性、其余5份为假阳性或禽型阳性,假阳性或禽型阳性样品再经细菌分离鉴定表现为阴性;PPD皮内变态反应检出的21份疑似样品再经γ-干扰素ELISA检测,表现为禽型阳性、假阳性或阴性;PPD皮内变态反应阴性样品经γ-干扰素ELISA试验检测,结果为阴性或禽型阳性.在检测奶牛结核病时,PPD皮内变态反应试验特异性较差,γ-干扰素ELISA试验结果与牛结核分枝杆菌细菌分离鉴定结果一致,而且该技术敏感性、特异性和鉴别假阳性均优于PPD皮内变态反应试验.     

应用TaqMan荧光定量PCR检测牛分枝杆菌

为建立快速检测牛分枝杆菌(M.bovis)的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究以GenBank登录的M.bovis特有229 bp基因为研究对象,设计并合成引物及探针。该方法具有较好的特异性,与标准质控菌株呈阳性反应,与其他微生物样品呈阴性反应;灵敏性最低检测值可达1 pg/mL;对20阳性临床样品进行荧光定量PCR检测,均为阳性;而对培养为阴性的20份临床样品进行检测,6份为阳性。该研究结果表明,建立的方法特异性强,敏感性高,稳定性好,能够用于M.bovis的鉴别检测,对牛分枝杆菌病的快速检测和早期诊断具有重要意义。     

抗凝剂对动物布鲁菌病虎红平板凝集试验的影响

为探讨含抗凝剂样品对动物布鲁菌病虎红平板凝集试验的影响,采集猪、牛、羊等不同动物的血液各10份,经柠檬酸钠、EDTA、肝素钠等抗凝剂处理后与对应的自然凝固、立即离心获得的样品分别进行虎红平板凝集试验和试管凝集试验,比较两种试验结果的差异。结果显示,经抗凝剂处理后的血浆样品虎红平板凝集试验结果均为阳性,试管凝集试验均为阴性,而自然凝固的血清样品两个试验结果均为阴性,不同处理方式造成的虎红平板凝集试验结果差异现象不受动物种类的影响。抗凝剂对虎红平板凝集试验影响非常显著,对试管凝集试验无影响。因此,临床上用虎红平板凝集试验进行动物布鲁菌病筛查时,不能使用含有抗凝剂的血液样品,否则会出现严重的非特异性凝集现象。