鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白GFP融合分子在COS7细胞内的表达

将鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2蛋白基因插入增强型绿色荧光表达载体pEGFP-C1中,构建了真核表达载体pEGFP-VP2。PCR与酶切鉴定结果表明VP2基因成功插入到表达载体pEGFP-C1中。脂质体法转染COS7细胞后,荧光显微镜检测到了GFP-VP2融合蛋白的表达。用200 μg/ml的G418成功筛选到了稳定表达GFP-VP2融合蛋白的细胞系,表达蛋白经镍亲和柱得到了纯化。     

口蹄疫病毒VP2基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

本试验旨在构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重组表达载体,并建立稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系。利用RT-PCR方法扩增Asia 1型FMDV的cDNA,获得VP2基因完整的编码区,构建可表达VP2的带有绿色荧光蛋白标记基因的pIRES2-EGFP-VP2重组表达载体。经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot技术检测VP2蛋白的瞬时表达;然后再转染BHK-21细胞,通过G418筛选,形成单克隆细胞系,经荧光筛选到表达EGFP的抗性单克隆细胞,扩繁培养克隆细胞,再通过West-ern Blot技术检测其VP2的表达,最终筛选到稳定表达FMDVVP2基因的BHK-21细胞系。结果表明,VP2基因重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2构建正确,能够在293T细胞内瞬时表达;转染BHK-21细胞,经G418筛选到表达VP2基因的BHK-21细胞克隆,经长达60d的传代,获得了稳定表达VP2基因和EGFP的BHK-21细胞系。上述结果表明,我们建立了稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系,为进一步探讨VP2基因在FMD...     

番鸭细小病毒VP3基因和鸭IL-2基因真核融合表达载体的构建

将番鸭细小病毒(MDPV)主要结构蛋白VP3基因和免疫刺激基序(CpG)依次克隆至质粒pIRES-dIL2上,构建了重组质粒pIRES-dIL2-VP3-CpG。核酸疫苗重组质粒转染BHK-21细胞进行间接免疫荧光试验,可在细胞浆中检测到绿色荧光,表明重组质粒可以成功地在真核细胞内表达。     

羊口疮病毒VIR蛋白生物活性鉴定及表位预测

为研究羊口疮病毒(ORFV)VIR蛋白的生物活性,扩增了绿色荧光蛋白基因EGFP和ORFV的VIR基因,构建了真核表达载体pVAX1-EGFP和pVAX1-VIR-EGFP,转染至BHK-21细胞,在荧光显微镜下进行了EGFP和VIR与EGFP融合蛋白的绿色荧光检测,用ORFV的全病毒血清作一抗,进行了Western ...     

表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒的构建与筛选

为了构建并筛选表达16型蓝舌病病毒(BTV-16)VP2蛋白的重组痘苗病毒rVTT-VP2,本研究通过同源重组的方法构建重组痘苗病毒,以TK基因缺失和EGFP绿色荧光为筛选标记,通过噬斑纯化法在BHK-21细胞中纯化10次,并连续传代20次来验证重组痘苗病毒遗传稳定性。PCR鉴定结果显示,VP2基因已整合到重组痘苗病毒基因组中,且未扩增出TK基因。荧光显微镜镜下观察,噬斑处均为表达绿色荧光蛋白的病变细胞。本研究成功构建了表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒rVTT-VP2,为后期疫苗的研究奠定了基础。     

短发夹结构RNA对口蹄疫病毒2B基因瞬时表达的抑制

为探讨siRNA在哺乳动物细胞中对口蹄疫病毒（FMDV）2B基因的抑制作用,针对WFL株FMDV的2B基因,设计了4个siRNA,并将shRNA表达模板插入pSilencer1.0-U6载体,构建shRNA表达质粒,将其与含绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP＋2B融合表达质粒瞬时共转染BHK-21细胞,以荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光表达量的变化,以实时定量RT-PCR法检测对2B基因mRNA的抑制作用。结果表明,本试验所构建的针对2B基因的shRNA表达载体可以在BHK-21细胞中抑制2B基因的瞬时表达。     

表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为p SVA-Strep,并采用双酶切和测序鉴定正确后,将p SVA-Strep转染BHK-21细胞拯救重组病毒,收集病变细胞上清,并将含有病毒的细胞上清和野生型SVA(SVA-WT)分别感染BHK-21细胞,以未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照,感染后24 h分别以鼠源SVA VP2蛋白单克隆抗体(MAb) 5D10 (1∶1 000)、鼠源Strep-tag II MAb (1∶2 000)作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠Ig G (1∶2 000)为二抗,采用间接免疫荧光试验(IFA)对重组病毒鉴定。IFA结果显示,以鼠源SVA VP2蛋白MAb 5D10为一抗,SVA-WT和重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光,以Strep-tag II MAb作为一抗时,仅有重组病毒感染的细胞出现绿色荧光,经SVA-WT感染的BHK-2...     

鸡传染性贫血病毒VP3基因的原核表达及抗血清制备

为了研究鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CIAV)VP3蛋白与病毒自身蛋白之间的相互作用,需对该蛋白进行原核表达制备相应兔源抗血清,试验通过提取CIAV M9905株基因组DNA,PCR扩增出VP3基因,构建重组质粒pET30a(+)-VP3,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,进一步通过IPTG诱导表达后用Ni-NTA亲和柱纯化获得融合蛋白,经SDS-PAGE分析后对融合蛋白进行乳化,免疫新西兰兔制备抗血清,并对其进行ELISA效价测定、Western-blot及IFA检测。结果表明:SDS-PAGE分析证实获得高纯度的重组蛋白VP3,大小约为22 ku,且其在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;ELISA法检测制备的兔源抗VP3血清效价在1∶6 400以上;经Western-blot及IFA检测证实,VP3兔源血清可特异性结合Vero细胞表达的VP3蛋白。说明试验成功表达出CIAV VP3蛋白,制备的兔抗血清具有较好的特异性。     

逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳前体基因（P1）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞（BHK-21）。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

鸡氨肽酶N基因转染BHK-21细胞后IBV感染情况的改变

构建了带绿色荧光蛋白基因及鸡氨肽酶N全长基因的真核表达重组载体,重组载体转染BHK-21细胞后12h开始可见绿色荧光,36h荧光最强,试验中转染24h后感染IBV鸡胚肾细胞适应毒,72h收获病毒接下一次转染的BHK-21细胞,如此在转染细胞上连续传5代,用间接免疫荧光检测各代次病毒感染转染BHK-21细胞,可见随着代次增加,感染程度增加;病毒毒力EID50逐渐增加,第5代时原病毒毒力基本恢复,半定量RT-PCR检测各代次病毒也可见病毒含量逐渐增加。结果表明,鸡氨肽酶N转染至IBV非易感的BHK-21细胞系后,BHK-21细胞变得对IBV敏感,鸡氨肽酶N可能用作IBV感染的细胞受体。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因结构预测及亚细胞定位

利用PCR方法扩增到VP1基因，序列测定后利用Mega4．0、swiss—model、GOR4和RasMol软件预测了VP1基因的二、三级结构。将VP1基因融合EGFP基因后定向克隆入PcDNA3．1（＋）真核表达载体，构建正确的重组质粒命名为PVP1E，在脂质体介导下将PVP1E质粒转染BHK-21细胞，WesternBlotting试验证实VP1基因成功表达，经DAPI细胞核染色后在共聚焦显微镜下观察VP1亚细胞定位。结果表明本研究预测了VP1基因的二、三级结构，其在BHK-21细胞中呈现以细胞核为主的弥散性分布，VP1基因亚细胞定位及结构预测为进一步深入探究AsiaI型FMDVVP1结构和功能提供丰富的资料。     

重组辛德毕斯病毒E基因痘苗病毒的构建

为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒前导蛋白（L^pro）亚细胞定位

为研究Asia 1型口蹄疫病毒（FMDV）前导蛋白（Lpro）亚细胞定位,利用RT-PCR方法获得L基因,将其定向克隆入pEGFP-N1真核表达载体,经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pEGFP-L。利用脂质体介导法将pEGFP-L转染BHK-21细胞,用荧光显微镜观察和Western blotting方法检测目的基因的表达,经碘化丙啶（PI）染色后在激光共聚焦显微镜下观察Lpro的亚细胞定位。结果表明,成功构建重组表达质粒pEGFP-L;FMDV L基因在BHK-21细胞中得到表达;Western blotting证实表达的Lpro具有反应活性;激光共聚焦显微镜观察发现Lpro在BHK-21细胞中呈弥散性分布。     

猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒在伪狂犬病病毒表达系统中的表达

利用PCR技术从猪细小病毒（PPV）SC1株基因组中扩增VP2全基因,并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中,构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒（PRV）SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞,待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化,并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中,并获得表达。进一步电镜观察表明,感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种类病毒样颗粒。结果表明,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒,为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

猪流感病毒（A／swine／Jiangsu／2／2006（H3N2）NS1基因表达产物分析

采用RT—PCR方法克隆猪流感病毒H3N2亚型NS1全长基因,构建NS1基因原核表达质粒pET-28a—NS1和真核表达质粒p3XFLAG—CMV—NS1,在大肠杆菌和真核细胞内表达NS1基因,制备抗NS1多克隆抗体。用所制备的抗体分析p3xFLAG—CMV—NS1转染表达NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导后,重组蛋白NS1在大肠杆菌中得到表达。表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备抗NS1蛋白多克隆抗体,Western—blot分析表明抗NS1多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的NS1蛋白、转染Veio细胞表达的NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。间接免疫荧光发现NS1蛋白主要定位于细胞核。结果显示,本试验成功构建了NS1基因原核和真核表达系统,获得了NS1特异性多克隆抗体,分析了NS1细胞定位,为进一步研究NS1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能和猪流感病毒的复制机理奠定基础。     

副结核分枝杆菌SOD基因在BHK-21细胞中的表达

将重组质粒pGEM-T-SOD中的副结核分枝杆菌SOD基因亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建真核表达重组质粒pVAX1-SOD,以脂质体介导法转染至BHK-21细胞中,并采用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测SOD基因在BHK-21细胞中的表达。结果显示,成功地构建了副结核分枝杆菌SOD基因的真核表达载体,且SOD基因在哺乳动物细胞中获得了表达。为研究副结核分枝杆菌SOD基因的免疫效果及作为牛副结核病DNA疫苗奠定基础。     

Construction and Identification of Cell Penetrating Peptides VP22 Gene Fused with Enhanced Green Fluorescent Protein and Three Antigens of Toxoplasma gondii

To study a novel vaccine of Toxoplasma gondii,the recombinant plasmids that cell penetrating peptides VP22 gene fused with one enhanced green fluorescent protein（EGFP)(pcDNA-VP22-EGFP)and three antigens of T.gondii（pcDNA-VP22-SAG1,pcDNA-VP22-GRA4 and pcDNA-VP22-AMA1）were constructed,respectively.The recombinant plasmids were identified by PCR,restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.The pcDNA-VP22-EGFP plasmid was transfected into COS7 cells,and the expression of VP22-EGFP in COS7 cells was confirmed by fluorescence microscope and RT-PCR.The results showed that all recombinant plasmid were constructed correctly.Green fluorescence was observed successfully under the fluorescence microscope in transfected cells after 72 h.The gene fragment of 1 449 bp was obtained by RT-PCR.The results indicated that the recombinant plasmids were constructed successfully.     

含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒的构建

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2．EGFP．VP2。采用磷酸钙转染系统，将pPI-2．EGFP．VP2 DNA和PRV DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blot核酸杂交筛选得到几株重组病毒，将其中一株（命名为SA215-B）DNA用BamHI酶切和Southern转印杂交进一步验证重组病毒构建成功，并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PPV VP2基因在重组病毒内获得表达，产生大小约93ku的融合蛋白，同时融合蛋白中的PPV VP2结构蛋白仍然保持了原有的反应原性，表明成功构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒。