禽白血病病毒群特异性抗原单克隆抗体的制备与鉴定

为制备禽白血病病毒(ALV)群特异性抗原的单克隆抗体(MAb),本研究从ALV-J病毒株感染DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出ALV群特异性抗原p27基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,酶切鉴定后进行序列测定和分析。最后将p27基因亚克隆至载体pET-30a(+)中,转化受体菌BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测获得融合蛋白。经过western blot检测,表达的蛋白具有良好的反应原性。将纯化的p27蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得5株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株。5株MAb与纯化的p27蛋白以及不同亚群ALV可以发生特异性反应。所制备的MAb为禽白血病的诊断方法研究奠定了基础。     

禽白血病病毒衣壳蛋白单克隆抗体研制及其双夹心ELISA的建立

为制备禽白血病病毒(ALV)核衣壳蛋白p27的单克隆抗体,本研究以原核表达的融合蛋白GST-ALV p27免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过间接免疫荧光(IFA)和间接ELISA进行筛选,制备了5株能够稳定传代并分泌抗p27单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5D3、4F12、5B10、1C5和3C6,亚类鉴定3C6为IgG2b,其余为IgG1.通过IFA、Western-blot及竞争抑制ELISA,表明该5株单抗与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)呈阳性反应,而与其他常见禽源病毒无交叉反应.利用5D3和4F12单抗建立了双抗体夹心ELISA方法,经663份临床样本验证,该方法与商品化试剂盒的符合率达到95.17％,证明所研制的针对ALV p27蛋白的单抗及建立的双抗体ELISA方法具有较高的应用价值.     

抗禽白血病病毒p27蛋白线性抗原表位的鉴定

为鉴定禽白血病病毒(ALV)p27蛋白中的线性抗原表位,本研究以原核表达的重组p27蛋白免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接ELISA方法筛选纯化获得一株能够稳定分泌特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。Western blot试验结果显示,该MAb可以识别ALV的群特异性抗原p27蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,MAb与A、B和J亚群ALV均呈阳性反应。对p27蛋白进行截短表达,利用western blot和间接ELISA进行表位鉴定,确定了MAb所识别的抗原表位位于129LVAITASALQAFRE142。氨基酸序列比对结果显示,本研究所鉴定出的p27表位在A、B和J亚群ALV之间高度保守。本研究为ALV检测方法的建立及其免疫学功能的研究提供了有利的工具。     

禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从J亚群禽白血病病毒(ALV-J)HB09JY03株感染的DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出约720bp的gag-p27基因片段,克隆至pMD18-T载体。鉴定正确后,将该片段克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导表达。表达产物经His Trap TMHP纯化后,测蛋白浓度达到9mg/mL。用兔抗自然p27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组p27蛋白有抗原反应活性。免疫新西兰大白兔后,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组p27蛋白和多克隆抗体将在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。     

禽白血病J亚群病毒GP85蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备能够区分禽白血病A亚群和J亚群病毒的单克隆抗体,将J亚群病毒gp85基因构建到原核表达载体上,并在大肠杆菌BL21中表达携带His标签的禽白血病J亚群GP85融合蛋白,用复性纯化的融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。4次免疫后取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,经过3次亚克隆后获得1株稳定分泌针对GP85蛋白的杂交瘤细胞株,命名为386。经间接ELISA测定,小鼠腹水效价为6.4×10~5,亲和力解离常数(kD)为2.18×10~(-9),这株单抗的亚型为IgGl。通过Western Blot和IFA实验证实该株单抗是针对J亚群病毒蛋白GP85的特异性抗体。初步确定此株单克隆抗体的抗原识别区位于GP85蛋白N端的1-50位氨基酸。该株单抗的制备为ALV-J病毒抗原检测以及致病机理的研究奠定了基础。     

禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化

利用原核表达的禽白血病病毒(ALV)P27蛋白作为抗原制备的单抗作为包被抗体,以制的酶标兔抗P27作为酶标抗体,在国内首次建立了检测ALV抗原的双抗体夹心ELISA方法.该方法对禽白血病P27抗原的最小检出量为5 ng/mL,通过统计学试验证明自制的诊断试剂具有良好的特异性和稳定性.与IDEXX试剂盒的平行实验确定自制诊断试剂S/P＞O.17为阳性判定标准.应用此方法对北京附近鸡场对抽样检测687份蛋清样品,检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到100%.     

J 亚群禽白血病病毒gp85单抗1E3株抗原识别表位的初步分析

J 亚型禽白血病是由 J 亚群禽白血病病毒引起的一种以成髓细胞增生、免疫抑制、生长发育受阻为特点的传染性肿瘤疾病,于1988年首次发现,其病毒囊膜表面蛋白gp85决定了病毒亚群特异性.本试验将原核表达质粒pET-28a-J gp85中的gp85基因分段亚克隆至重组表达质粒pGEX-6p-1上并在大肠杆菌中成功地表达,用ALV-J Sl gp85单克隆抗体1E3株对分段表达的gp85蛋白进行初步的免疫印迹分析.结果表明:ALV-J Sl gp85单抗1E3株所识别的抗原表位位于蛋白N端的第69至112个氨基酸之间.这将为ALV-J gp85抗原决定簇所在位点及其免疫学功能的研究奠定基础.     

ALV-A p27基因的原核表达及其鼠源多克隆抗体的制备

试验拟通过构建A亚群禽白血病病毒(ALV-A) p27基因原核表达载体,从而制备抗p27蛋白鼠源多克隆抗体。将感染ALV-A毒株的DF-1细胞反复冻融后提取RNA并反转录为cDNA,利用PCR扩增获得ALV-A p27基因,将目的基因克隆至pColdⅠ载体,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌中进行诱导表达,经镍柱纯化后免疫28～32日龄的雌性小鼠,采用间接ELISA法测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。试验经PCR扩增出750 bp左右的特异性条带,并成功构建pColdⅠ-ALV-A-p27原核表达载体,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG于18℃诱导表达18～24 h成功得到重组蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。间接ELISA检测显示,制备的鼠源多克隆抗体血清抗体效价为1∶3 200;Western blot检测结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别原核表达的p27蛋白。试验结果在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。     

湖北省地方鸡核心群禽白血病净化的初步研究

试验针对湖北省地方鸡江汉鸡核心群进行禽白血病初步净化。禽白血病病毒感染本底调查结果显示,该种鸡群存在A/B亚群、J亚群禽白血病病毒感染,父系精液病毒分离率为7.1%,高于种蛋蛋清p27抗原阳性率2.5%。采用1日龄胎粪p27抗原检测,开产初期和留种前的种蛋蛋清p27抗原检测、父系公鸡血浆及精液病毒分离的方法,结合生物安全措施,对核心种群开展了净化淘汰,结果显示:经过两个世代的净化,种蛋蛋清p27抗原阳性率由2.7%降至0.5%,公鸡病毒分离阳性率由8.6%降至1.7%,阳性率显著降低。表明该净化方案实施效果明显,适于进一步推广应用。     

间接ELISA检测抗禽白血病病毒抗体方法的建立

禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是禽白血病的病原,可引起鸡的免疫抑制和肿瘤。净化种鸡群是控制ALV的主要方法之一。本研究将ALV的p27基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,在大肠杆菌中获得了高效表达,以纯化后的p27-GST融合蛋白为抗原包被,经过条件优化,建立了检测鸡血清中抗ALV抗体的间接ELISA方法。与IFA检测结果比较,该方法比IDEXX ELISA试剂盒有更高的符合率。可用于禽白血病病毒感染根除的大规模检测,并具有低成本、易操作的特点,能同时检测到针对ALV所有亚群的抗体。     

Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup A avian leukosis virus

Avian leukosis virus subgroup A (ALV‐A) is a retrovirus which infects egg‐type chickens and is the main pathogen of lymphoid leukosis (LL) and myeloid leukosis (ML). In order to greatly enhance the diagnosis and treatment of clinical avian leukemia, two monoclonal antibodies (MAbs) to ALV‐A were developed by fusion between SP2/0 and spleen cells from mice immunized with expressed ALV‐A env‐gp85 protein. Using immunofluorescence assay (IFA), two MAbs reacted with ALV‐A, but not with subgroups B and J of ALV. Western blot tests showed that molecular weight of ALV‐A envelope glycoprotein recognized by MAbs was about 53 kD. Isotyping test revealed that two MAbs (A5C1 and A4C8) were IgG1 isotypes. These MAbs can be used for diagnosis and epidemiology of ALV‐A.     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup J avian leukosis virus.

In an attempt to develop a specific diagnostic test for avian leukosis virus (ALV) subgroup J (ALV-J) strain Hc1, four monoclonal antibodies (MAbs), JE9, G2, 145, and J47, were generated that are specific for ALV-J envelope glycoprotein, gp85. Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify genomic pro-viral DNA of Avian Disease and Oncology Laboratory (ADOL)-Hc1 and ADOL-4817 envelope genes. Both open reading frames encoding glycoproteins gp85 and gp37 were cloned into baculoviruses. Abundant expression of gp85 and gp37 was detected in the recombinant viruses with specific antibody to Hc1 strain of the ALV-J. The expressed proteins were used for immunization of mice to produce hybridoma cell lines secreting MAbs specific to ALV-J envelope protein. A panel of MAbs was generated by fusing NS1 myeloma cells and spleen cells from mice immunized with the recombinant baculoviruses. With the use of an immunofluorescence assay, three MAbs (JE9, G2, 145) reacted with ALV-J but not with subgroups A, B, C, D, or E of ALV. MAb J47 reacted with all exogenous subgroups of ALV including A, B, C, D, and J but not with endogenous subgroup E viruses. Western blot analysis was performed with all four MAbs against recombinant baculovirus and Hc1-infected chicken embryo fibroblast (CEF) lysates. A major band with a molecular weight about 90 kD corresponding to the size of ALV-J envelope was consistently obtained. With these MAbs, we detected the Hc1 antigen in CEFs infected with several ALV-J viruses isolated in the United States and also in tissue sections from chickens infected with Hc1 strain of ALV-J. These MAbs will be useful reagents for the diagnosis of ALV-J infection because they recognize a common antigenic epitope in six isolates tested thus far.     

猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其识别表位分析

为获得针对猪源EMCV结构蛋白VP2的特异性单克隆抗体,本试验以EMCV结构蛋白VP2为对象,将EMCVBJC3株VP2基因定向插入穿梭质粒中,构建重组腺病毒AdV—VP2,免疫BALB／c小鼠制备单克隆抗体,利用Pepscan技术对单抗识别的抗原位点进行分析。结果显示,间接ELISA及间接免疫荧光法筛选获得了2个阳性细胞克隆株,命名为C11和G8。经检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：1600,腹水效价分别为1：2．56×106和1：1.28×106,中和试验鉴定均无中和活性。Western—blot鉴定表明获得的2株单抗均能识别原核表达的重组VP2蛋白。亚类鉴定结果显示2株单抗均为IgG2b亚类,轻链均为κ型。Pepscan分析结果显示,这2株单抗可分别识别EMCVVP2蛋白上的2个B细胞线性表位。本研究获得的蛋白十分接近于其天然构象,很大程度上保证了病毒表面抗原位点的结构和功能。     

抗猪支原体共同抗原单克隆抗体的制备与鉴定

以猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)168菌株F332作为抗原，免疫8周龄BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，获得两株能稳定分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株。两株单抗与Mhp和猪鼻支原体（M.hyorhinis,Mh)等反应，而不与鸡支原体，对照血清等反应。结果表明两株单抗可能是针对猪支原体共同抗原的单抗，用SDS-PAGE电泳和Western-blot分析猪支原体的膜蛋白成分。结果显示，猪支原体的共同抗原是80kd和30kd蛋白，两株单抗均与Mhp和Mh的30kd蛋白条带反应，表明这两株单抗特异地针对猪支原体的共同抗原成分30kd蛋白，可以看出，这两株单抗在Mhp的抗原分析，血清学诊断和疫苗质量监测以及猪源支原体污染细胞检测等方面有重要应用价值。     

禽白血病抗原快速检测试纸条的研制及初步应用

禽白血病给养鸡业带来极大损失,目前检测该病病原的方法主要有ELISA、PCR及RT-PCR、原位杂交(ISH)、间接免疫荧光(IFA)等。本研究应用2株抗禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体5D3和4F12研制了ALV快速检测试纸条。结果证明该试纸条具有良好的特异性,与H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、小鹅瘟病毒、鸡贫血病病毒没有交叉反应;采用p27表达蛋白检测试纸条灵敏性,检测下限达到70ng/mL;应用该试纸条检测71份临床样品,与商业ELISA试剂盒检测结果比较,二者符合率达到93%。该试纸条的研制,为基层快速检测ALV提供了条件。     

Expression of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) Gene Carried by a Lentiviral Vector RCASBP in DF-1 Cell

To construct a lentiviral vector RCASBP carrying the enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene which could be expressed stably in DF-1 cell,EGFP gene was amplified by PCR and then inserted into the lentiviral vector RCASBP after digested with the restriction endonuclease ClaⅠto construct recombinant lentiviral vector RCASBP-EGFP.The recombinant vector was transfected into DF-1 cells by Lipofectamine^TM 2000.Avian leukosis virus (ALV) p27 antigen ELISA test was performed after four passages of the transfected cells and the positive results of ELISA suggested the success rescue of the virus.The expression of EGFP was observed in more than 80 percentages of DF-1 cells under fluorescence microscope.The proviral genome PCR showed EGFP gene carried by the recombinant lentiviral vector RCASBP-EGFP had been integrated into the genome of DF-1 cells.The RCASBP lentiviral-mediated expression system provided a basis for study of the structure and function of ALV genes.     

反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达

为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV) p27抗原的ELISA检测盲传至第4代的细胞上清,ELISA阳性结果说明重组病毒拯救成功;荧光显微镜观察发现80%以上DF-1细胞都有明显的绿色荧光信号,证明DF-1细胞表达绿色荧光蛋白;对DF-1细胞基因组进行特异性PCR检测,扩增出特异性条带说明重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP携带的EGFP基因整合到DF-1细胞的基因组中。本研究建立的RCASBP介导反转录病毒表达体系为研究ALV基因的结构和功能奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒单抗制备及在外源病毒检测中的应用

为了建立外源病毒检验用间接免疫荧光染色方法,本研究将禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白gp90(SU)的基因合成后连接至原核表达载体中进行表达,获得REV-SU蛋白,通过Ni柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,免疫BALB/C小鼠,应用杂交瘤技术获得1株分泌特异性抗REV SU蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞系(2A2株),该细胞株制备的腹水与不同REV毒株具有良好的反应性,荧光效价可达1：51200,与不同ALV毒株和其他常见禽的病原均没有交叉反应,特异性良好。采用该细胞株分泌的单克隆抗体建立的间接免疫荧光染色法能检出至少5个TCID50REV病毒感染量,与多克隆抗体作为检测一抗具有同等的效力,且检测背景更加纯净,适用于外源性REV病毒检验。