非核糖体肽合成酶腺苷化结构域在E.coli中的表达及底物特异性分析

侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)S62-9产生的抗菌肽(Brevibacillin,BBL)是一种非核糖体多肽,由非核糖体肽合成酶催化合成。本研究所用基因是从侧孢短芽孢杆菌(B. laterosporus)S62-9质粒基因组中克隆的一个非核糖体肽合成酶的腺苷化结构域(Nonribosomal peptide synthetase adenylation, NRPS-A)基因,根据此NRPS-A基因构建了pET21b-N1、pET21b-B2、pET22b-N1、pET22b-N3四个重组表达载体。将以上重组表达载体分别转化E. coli BL21、E. coli Rosetta(DE3)和E. coli Origami B(DE3)受体细胞,并用1 mmol/L异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在16°C 200 r/min下进行诱导,将诱导产物用SDS-PAGE检测分析。结果显示,4种重组载体在E.coliBL21中均无表达,在E.coliRosetta(DE3)大量表达但均以包涵体形式存在,在E. coli Origami B(DE3)均表达,但只有pET22b-N3这一重组表达载体出现了可溶性融合蛋白。可溶性融合蛋白对赖氨酸有较高的腺苷化活性,表明该A结构域负责抗菌肽BBL中的赖氨酸的识别和上载。该研究结果不仅为其它NRPS-A域的可溶性表达提供了方法,同时为研究抗菌肽BBL的生物合成机制提供依据。     

致病性坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了扩增坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列和了解该蛋白的分子特征,以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板,利用染色体步移技术分别扩增已知序列的5'端旁侧序列和3'端旁侧序列,并测序和拼接,对拼接结果进行生物信息学分析。结果显示,成功获得F.necrophorum血凝素相关外膜蛋白基因的完整核苷酸序列,全长4247bp,含有1个3372bp的开放阅读框,编码1123个氨基酸,蛋白质分子质量约为120ku。生物信息学分析表明,该蛋白没有明显的信号肽序列和跨膜结构;该蛋白质第750位~1123位氨基酸残基区域具有较强的抗原性;SMART预测显示,该蛋白存在一个自转运蛋白结构域、血凝活性结构域和多个参与碳水化合物代谢的结构域。上述结果提示,成功获得F.necrophorum血凝素相关外膜蛋白基因的完整核苷酸序列,编码约为120ku的蛋白质,该蛋白质可能是具有血凝活性的外膜自转运蛋白家族的成员,并且该蛋白质的C端可能具有较强的抗原性。     

侧孢短芽孢杆菌S62-9抗菌肽基因的初步定位

侧孢短芽孢杆菌S62-9可以产生高效广谱抑菌活性的细菌肽,为了确定该抗菌肽基因的遗传定位,本研究采用质粒消除和质粒转化进行正反论证。结果发现,电击法消除S62-9菌株的野生质粒pBLS62后,其突变株抑菌活性消失,而且对S62-9细菌肽的敏感性大大增强;而野生质粒pBLS62导入没有抑菌活性的枯草芽孢杆菌Wb800中,转化子Z4产生了抑菌活性,而且RP-HPLC结果表明Z4表达的抗菌物质与原始菌株S62-9抗菌肽为同一产物。从质粒消除和质粒转化与由此带来的表观性状的关系上,可以推断,侧孢短芽孢杆菌S62-9细菌肽及其免疫相关基因位于质粒而不是染色体上。     

羊毛硫抗生素雷可肽同源基因簇的异源表达

高杰氏链霉菌中含有新型羊毛硫抗生素雷可肽(lexapeptide)的同源基因簇lxm2,为探索该基因簇相应的产物,将包含lxm2的细菌人工染色体转到变铅青链霉菌中进行异源表达,证实其可以产生雷可肽;同时还获得另一个新次级代谢产物,基因敲除实验表明此化合物的合成也与lxm2相关。通过色谱技术对新化合物进行分离纯化,结合核磁共振谱、高分辨质谱和二级质谱确定其结构为具有多重修饰的线性六肽,与雷可肽的N-端六氨基酸序列相同,命名为Lxm-N-六肽,该化合物没有检测到抗菌活性。     

一株牦牛源产细菌素植物乳杆菌SWUN5815全基因组测序及序列分析

旨在分析一株牦牛源植物乳杆菌SWUN5815的全基因组序列测序,并对该菌株的功能特性基因进行挖掘。基于PacBio RSII测序平台对乳杆菌SWUN5815进行全基因组测序分析和GO、KEGG、COG和NR数据库进行基因组基本功能注释。结果表明:1)植物乳杆菌SWUN5815的基因组大小为3.27 Mb,GC含量44.59%;2)预测到3 258个编码基因,编码基因总长度为2 814 147bp,平均长度为864bp;3)编码基因通过功能数据库对该菌株基因组基本功能注释和代谢通路基因信息注释得知,SWUN5815基因组中包括5个基因参与抗氧化活性过程,2个基因参与免疫过程;基因组中包含了抗生素、生物降解等代谢过程;可调控免疫和炎症的相关通路;基因组中含有18种已知细菌素基因;有4个合成ABC型细菌素转运系统的功能序列。综上,SWUN5815全基因组测序及分析挖掘其特异性功能基因有利于研究其益生特性提供基础,为菌株作为抗生素替代品的益生菌和饲料添加剂的应用研究提供了重要的参考数据。     

犬弓首蛔虫abcg-5基因的克隆及序列分析

研究犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters, ABC)亚家族G5基因(abcg-5)的分子特征.根据犬弓首蛔虫基因组数据库中的Tc-abcg-5基因序列设计引物,通过PCR技术克隆Tc-abcg-5全长基因,并进行多重序列比对和种系发育进化树分析.结果表明:该基因全长为1 902 bp,编码633个氨基酸.功能结构域分析发现TcABCG5蛋白包含1个ABC转运蛋白结构域和6个跨膜区,同时发现了高度保守的Walker A和Walker B模体. GO分析显示ABCG5具有ATP结合和ATP酶活性.种系发育进化树分析显示TcABCG5与猪蛔虫进化关系较近,与哺乳动物进化关系较远.     

三角帆蚌AMP基因cDNA全序列的克隆及分子特征研究

以三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)为研究材料,根据实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列,利用RACE克隆了三角帆蚌AMP基因的cDNA全序列。该cDNA序列全长为970 bp,5′端非翻译区123 bp,3′端非翻译区526 bp,开放阅读框(ORF)长为300 bp,共编码99个氨基酸,包含一段由27个氨基酸组成的信号肽和72个氨基酸的成熟肽,分子量为10 924.7 u。氨基酸序列分析表明,该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析表明,该基因编码的蛋白与海兔(Aplysia californica)theromacin氨基酸序列的相似度最高为56%,而与贻贝等中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins相似度较低,推测属于抗菌肽theromacin基因家族。Jpred3软件对三角帆蚌AMP蛋白的二级结构预测结果表明,在第2~22、57~62氨基酸残基处存在α螺旋,因此,三角帆蚌的AMP蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。为进一步研究该基因的表达、功能及三角帆蚌病害防御奠定了分子基础。研究亮点:theromacin不属于常见的抗菌肽基...     

家蚕中Brown候选基因的克隆及序列分析

Brown是一种色素运输载体基因(ABC transporters),与色素颗粒形成与转运相关,对昆虫的眼色形成有着重要影响.根据果蝇中Brown蛋白氨基酸序列,在家蚕数据库Silk DB中进行相似性搜索,并结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得家蚕brown候选基因的cDNA序列,全长1887 bp,开放阅读框(ORF)大小为1797 bp,编码598个氨基酸残基,该基因组DNA含有外显子11个,且起始密码子在第1个外显子内.预测蛋白序列有典型的ABC_ trans和ABC2_ membrane结构域,同源性分析表明,编码的蛋白序列归类至ABC_trans家族中的Brown蛋白亚族.     

基于高通量测序的菟丝子生防菌“鲁保一号”转录组学研究

“鲁保一号”是对菟丝子具有良好防效的生防菌,由于其致病力退化和分子遗传信息的匮乏,对于该菌的深入研究受到了限制。为进一步挖掘“鲁保一号”菌株的遗传资源,获得致病力退化相关的功能基因,本研究运用新一代高通量测序技术(Illumina Hiseq 2500)对“鲁保一号”菌株进行转录组测序分析。结果表明,获得了总长度为31 126 662 bp的unigene序列信息;对序列进行组装拼接后获得17 031条单基因簇(unigene),平均长度为1 827. 65 bp。序列同源性比较表明,86. 04%的序列与已知炭疽菌序列有不同程度的同源性。将unigene与KOG数据库进行比对,根据其功能大致分为25类,其中注释最多的是一般功能预测类基因,其次是翻译后修饰、蛋白折叠和分子伴侣类基因。针对测序得到的基因信息,筛选获得6个CDC相关基因,分为3个亚组。本研究通过对“鲁保一号”菌株进行高通量测序,获得了丰富的转录组信息,为新基因的挖掘和基因组学的研究奠定了基础。     

固氮施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501同化硝酸盐代谢基因簇分布及调控研究

固氮施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501在有氧条件下能够利用硝酸盐/亚硝酸盐为唯一氮源生长,表明该菌除了具有固氮和反硝化等氮循环系统外还有同化硝酸盐/亚硝酸盐系统。为进一步阐明该菌同化硝酸盐的代谢机制,利用生物信息学手段分析了硝酸盐同化相关基因的组成及分布情况,并初步研究了同化硝酸盐途径特异性调控关系。结果表明, P. stutzeri A1501中存在两个硝酸盐同化基因簇nasST-nasA-nirBDnasBcobA和nasR-nasFED,分布于基因组不同部位。第一个基因簇中nasS-nasT编码二元抗转录终止因子,nasA编码NarK/NasA家族硝酸盐转运蛋白,nirBD编码亚硝酸盐还原酶,nasB编码同化硝酸盐还原酶,cobA编码参与西罗血红素合成的尿卟啉-Ⅲ C-甲基转移酶;第二个基因簇中nasR编码单一组分抗转录终止因子,nasFED编码ABC型（ATP依赖）硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白。NasS-NasT双组分蛋白调控硝酸盐/亚硝酸盐还原酶基因的转录,NasR调控硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白基因的转录。