农杆枪法基因遗传转化技术初报

为提高遗传转化的效率,克服受体范围的限制,采用农杆枪法进行基因的遗传转化。根据已报导的VirD1和VirD2基因的序列设计特异引物,以农杆菌C58菌株的质粒为模板进行PCR扩增．对VirD1和VirD2基因进行克隆。将序列正确的VirD1和VirD2基因连接到植物表达载体PBI121启动子CaMV35S和终止子nos之间,构建VirDl和VirD2基因的表达载体pB-VirD1及pB-VirD2。经PCR及酶切鉴定,基因已成功构建到表达载体上,为农杆枪法进行目的基因转化的研究奠定了基础。     

玉米穗三叶叶面积主基因+多基因遗传模型分析

以玉米组合PH6WC/7873的六世代P1、P2、F1、B1、B2、F2为材料,在春播和夏播条件下,研究了玉米穗三叶叶面积的主基因+多基因遗传规律,旨在为玉米株型、高光效育种提供理论基础。结果表明,春播和夏播环境下,穗三叶叶面积均检测到主基因,穗三叶叶面积在春播环境下符合D-2模型,夏播环境下符合E-1模型。春播环境下,穗三叶叶面积的多基因遗传率在B1、B2、F2世代分别为87.22%、83.64%、49.38%,以多基因遗传为主。夏播环境下,穗三叶叶面积在F2世代存在较大的主基因遗传率(75.82%),以主基因遗传为主。由此可见,叶面积在夏播和春播环境下,受主基因和多基因的控制表现并不一致,因此要注意在不同的环境下,选择不同的方法对叶面积进行改良。     

Bar基因转化豆科牧草百脉根的研究

以豆科植物百脉根子叶为转化受体,通过根癌农杆菌介导方法将外源目的基因Bar基因和Gus基因导入,经筛选分化、再生,得到具有Basta抗性的转基因植株。在Basta浓度的选择中,2mg/L是百脉根较为适宜的筛选浓度。试管苗叶片筛选剔除假转体和嵌合体植株,转基因植物移栽大田后生长良好。PCR检测证明外源目的基因已整合到百脉根基因组中。     

玉米叶夹角、叶向值主基因+多基因遗传模型分析

为探讨玉米叶夹角、叶向值的遗传规律,以7873/PH6WC的六世代P1、P2、F1、B1、B2、F2为材料,在春播和夏播环境下,田间分穗上、穗下调查叶夹角和叶向值,对其主基因+多基因遗传模型进行分析。结果表明,在春播和夏播环境下,穗上叶夹角和穗上叶向值最适模型均为E-1模型,存在2对主基因。穗下叶向值在春播和夏播环境中都符合D-2模型,存在1对主基因。穗下叶夹角在春播环境中符合D-2模型,但在夏播环境中没有检测到主基因,属于多基因遗传模型(即C-0模型)。夏播环境中,穗上叶夹角、叶向值、穗下叶夹角均检测到较高的主基因贡献率。夏播环境中,穗上叶夹角F2世代的主基因遗传率为85.60%,穗上叶向值主基因遗传率在B2和F2世代分别为88.92%、88.69%,穗下叶向值在B2世代的主基因遗传率为82.43%。但春播环境中,只有穗上叶向值在F2世代有较高的主基因遗传率(90.27%)。玉米叶夹角和叶向值存在较大的主基因遗传率,可以采用单交重组或简单回交转育的方法进行遗传改良。     

几丁质酶基因转化番茄的研究

以金丰一号亲本JM、JF为转化材料，建立了以子叶为外植体的离体再生体系，其芽分化培养基为MS ZT 2．0mg/L IAA0．2mg／L，生根培养基为MS。借助植物双元表达载体pROK，用农杆菌(LBA4404)与番茄子叶外植体共培养，把几丁质酶基因和抗除草剂BAR基因转化到番茄上。经过卡那霉紊和Basta的筛选和再生培养，获得转化再生植株。采用浓度为1000mg/L的Basta除草剂溶液涂抹再生植株后代叶片，表现明显抗性。对转化再生植株进行了PCR检测、Southern检测，表明上述基因已整合进番茄基因组中。     

黄瓜果糖含量的主基因-多基因遗传分析

以黄瓜自交系EP326(P1)、KP2(P2)及其配制的F1、BC1、BC2、F2共6个世代为材料,运用主基因-多基因混合遗传模型研究露地和大棚栽培环境下黄瓜果实果糖含量遗传效应的差异。结果表明:黄瓜果实果糖含量的遗传符合1对加性-显性主基因+加性-显性多基因遗传模型;主基因的加性效应大于显性效应,而多基因的显性效应大于加性效应;在2种栽培环境下,BC1、BC2、F2的主基因和多基因的遗传率均存在差异;环境方差占表型方差的比率较高,表明环境变异对黄瓜果实果糖含量遗传效应的影响较大,生产上可通过改善栽培环境提高黄瓜果糖含量、改良果实品质。     

水稻HGO基因启动子的克隆及转化鉴定

HGO是编码酪氨酸降解途径中尿黑酸1,2双加氧酶的基因。探讨了水稻HGO基因的表达特征,构建了水稻HGO基因启动子与GUS表达载体,采用农杆菌介导的浸花法将该表达载体转入拟南芥中,获得转基因植株。通过GUS组织化学染色法检测,发现水稻HGO基因启动子在拟南芥根、下胚轴、叶柄和子叶中高度表达,在真叶中只有叶脉和叶尖上有微弱的表达。     

水稻HGO基因启动子的克隆及转化鉴定

HGO是编码酪氨酸降解途径中尿黑酸1,2双加氧酶的基因。探讨了水稻HGO基因的表达特征,构建了水稻HGO基因启动子与GUS表达载体,采用农杆菌介导的浸花法将该表达载体转入拟南芥中,获得转基因植株。通过GUS组织化学染色法检测,发现水稻HGO基因启动子在拟南芥根、下胚轴、叶柄和子叶中高度表达,在真叶中只有叶脉和叶尖上有微弱的表达。     

玉米茎粗主基因+多基因遗传模型分析

以玉米杂交组合PH4CV×昌7-2(组合I)和PH6WC×7873(组合Ⅱ)的6个群体P1、P2、F1、B1、B2、F2为材料,研究了春播和夏播条件下玉米茎粗的主基因+多基因遗传规律。结果显示,组合Ⅰ的茎粗在2种环境下均受D-2模型控制。组合Ⅱ的茎粗在春播环境下符合E-1模型,在夏播环境下符合D-2模型。在春播环境下,组合Ⅰ和组合Ⅱ的茎粗均以主基因遗传为主,可以采用单交重组或简单回交转育的方法来提高育种的效率。在夏播环境下,组合Ⅰ和组合Ⅱ的茎粗均表现为多基因遗传,可以采用聚合回交或轮回选择来累积微效基因,从而提高育种效率。     

粳稻孕穗期耐冷性的主基因加多基因遗传分析

用昆明小白谷培育的近等基因系(NIL)的不同单株(BC4F6)与轮回亲本杂交再自交的2个F2群体,2002年在海拔1 916 m的昆明(水温18～21℃)和2003年在海拔2 150 m的阿子营乡用冷泉水(19℃)灌溉种植,利用主基因-多基因混合遗传模型分析了2种冷害条件下的F2群体的耐冷基因效应.结果表明耐冷基因是受2对主效基因+多基因相互配合遗传控制的,其主效基因的遗传率为80.64%～85.55%,多基因遗传率为4.65%～7.17%,孕穗期耐冷性以主基因利用为主;主基因中加性效应明显,2对主基因基因效应不等,以第1对主基因的加性效应为主;在孕穗期耐冷性遗传中,主基因的加性、显性及主基因之间的相互作用普遍存在.     

小麦基因枪高效转化体系的建立

以小麦幼胚为基因枪转化受体 ,用含GUS和bar基因的质粒pDM80 3对小麦幼胚进行转化 ,并对幼胚大小、轰击距离、质粒和金粉用量等参数对GUS瞬时表达率及表达量的影响进行了研究。幼胚以 1 0～ 1 5mm最为适宜 ,6cm和 9cm各轰击一次、质粒 0 .5μg/枪及金粉 30 0 μg/枪 ,GUS瞬时表达率及表达量最高。通过对以上参数的优化 ,建立了一个高效的小麦基因枪转化体系。     

基因枪法获得Phs-r转基因小麦植株的研究

实验以普通小麦豫麦18-64品种为供试材料,采用基因枪法对报告基因(Bar基因)和目的基因(PHS-r基因)两个重组质粒进行了共转化,获得了再生植株,并对转化植株进行了检测。结果表明:以预培养15d的幼胚愈伤组织作为受体材料其转化频率明显高于当天剥取和预培养3～4d的幼胚;在基因枪轰击前6h和轰击后18h,用0.5moL/L的甘露醇进行渗透处理,其转化频率会有明显的提高;实验通过基因枪转化与再生培养,共获得了12株再生植株,PPT检测且均表现出抗性,其中6株经PCR检测呈阳性,表明PHS-r基因已整合到小麦基因组中并正常表达。     

基因枪转化小麦悬浮细胞参数的优化

小麦是我国的重要粮食作物,其遗传工程因受转基因技术的限制而进展缓慢。国际上,自１９９２年Ｖａｓｉｌ等〔７〕用基因枪技术首次得到转基因小麦以来,现在又有几例成功的报道〔３,４,８,９〕。国内成功的报道极少,有的即使得到了转基因植株,其频率也很低。导致小...     

Bar表达框基因载体高频转化栽培小麦

    为探讨无载体主干序列(细菌DNA)的表达框基因直接转化栽培小麦的可行性和有效性,对栽培小麦(Triticum aestivum L.)进行了bar表达框基因的基因枪转化.通过试材培养、外植体分离、bar表达框基因分离提取和纯化、基因枪轰击、诱导分化与再生培养、再生苗核酸抽提、转基因检测及除草剂涂抹试验等方法,筛选到23株全部来自幼胚愈伤的独立再生苗,其中18株显示bar表达框基因的整合,且均表现抗除草剂效应.基因型鄂麦12号的转化频率(1.55%)高于鄂恩1号(0.87%),两基因型在1100 psi轰击压下的转化频率均高于900 psi,其中鄂麦12号达到3.51%,明显优于鄂恩1号,且高于常规小麦基因枪的平均转化频率0.50%～1.00%.鄂麦12号幼胚在1100 psi轰击压下转化bar表达框基因可获高转化效应.表明受体基因型、外植体类型、轰击压等因素在优化表达框基因转化体系中具重要作用.推断表达框基因转化方法具有片段小、环境安全、转化效率高、整合模式简单、表达高效等优势,在作物遗传转化中具有广泛应用前景.     

Study on the Obtaining of Transgenic Wheat with GNA Alien Gene by Biolistic Particle

The immature embryos of wheat plants, cv. Jing 411, 12 - 14 days after pollination, were cultured on SD2 medium for callus induction. After 10 days culture, 800 wheat calli were bombarded by biolistic particle coated with theDNA of plasmid pBI121-2 harboring both Galanthus nivalis agglutinin gene and bar gene. 67 green plants were finally regenerated from the bombardment calli on selection medium containing 4mg/L Basta. The results of bioassay by both inoculating wheat aphids onto the plants and applying Basta solution of 50 mg/L and 75 mg/L onto the wheat leaves in the field, and the molecular analysis, such as PCR and Southern blotting, indicated that 8 T2 plants contaning the target genes were obtained.     

用基因枪法将抗除草剂bar基因导入小麦的研究

用基因枪法将含有抗除草剂bar基因的植物表达载体导入优良品种小麦幼胚愈伤组织,并通过GUS瞬时表达对沉淀剂、轰击距离、金粉用量等轰击参数进行了优化。用除草剂对轰击后的材料进行分化生根筛选,共获得33株再生苗。通过PCR检测和涂叶检测,初步证明其中4株已将bar。基因整合到小麦基因组中,平均转化率为0．33％。     

GUS基因瞬时表达检测小麦1Ay基因启动子功能

本试验以pAyGUS为转化质粒,该质粒为小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因1Ay的启动子和β-葡糖苷酸酶(GUS)基因的重组质粒,利用基因枪法将该质粒导入小麦胚乳及胚中,检测其表达活性。通过X-gluc染色检测表明,GUS基因在该启动子的驱动下能在小麦种子中特异表达,可见小麦1Ay基因的启动子具有在小麦胚乳中特异表达的活性,这为小麦品种改良及转基因研究奠定了基础。     

玉米自交系幼胚培养与基因枪转化研究

玉米自交系幼胚在添加 1～ 2mg/L 2 ,4-D的N6培养基上能够诱导形成不同类型的胚性愈伤组织。愈伤组织的诱导率与基因型和 2 ,4-D浓度有关 ,6个自交系的诱导率在 5 2 %～ 89%。将淡黄色颗粒状结构致密型愈伤组织在N6诱导培养基上继代培养 2 0个月 ,仍具有较强的分化能力。在附加 2mg/L 6 -BA和0 .2mg/LNAA的N6分化培养基上 ,有 2 7%～ 41%的愈伤组织分化成苗。通过基因枪轰击成功地将 pbarGUS基因转入玉米细胞 ,获得了大量的转化胚性愈伤组织。用 0 .4mol/L的甘露醇高渗处理幼胚 ,能显著提高pbarGUS基因在细胞中的表达 ,高渗处理转化率较对照提高了 3倍     

受体生长状态对小麦基因枪转化效率的影响

以生产上大面积推广的小麦品种豫麦18-64、豫麦34号和豫麦70号为供试材料,用基因枪介导法进行了抗除草剂基因(Bar)的转化,研究了幼胚不同的预培养时间和渗透处理对转化效果的影响。结果表明,幼胚以诱导培养10～15d的转化效果最好,在此基础上结合用0.4mol/L的甘露醇在轰击前6h和轰击后18h进行甘露醇处理,可明显提高转化效率。     

DREB1A基因植物表达载体的构建

以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将 DREB1A基因导入植物奠定基础