间接酶联免疫吸附试验诊断牛贝诺孢子虫病的试验研究

由贝诺孢子虫病牛皮肤组织包囊内分离滋养体制备抗原。然后,通过正交试验筛选影响ELISA敏感性的几种主要因素,建立了诊断牛贝诺孢子虫病的问接酶联免疫吸附试验方法。对已知阳性和阴性血清各30头份进行检测,其符合率均为100％;对疫区244头份血清进行检测,其阳性检出率为34.8％,面临床通过巩膜险查的阳性检出率仅为4.5％;对巴贝贝西虫、双芽巴西虫、瑟氏泰勒虫、环形泰勒虫、伊氏锥虫、肉孢子虫等感染牛血清68头份进行检测,除22头份肉孢子虫惑染牛血清中有5头份判为阳性外,其余均为阴性。初步尝试可以全血于纸片代替血清进行检测,其检测结果与血清一致。对ELISA检测结果以肉眼判定,与OD值测定结果间的误差不超过3.?％。     

酶联免疫吸附试验诊断环形泰勒虫感染牛的研究

用层析法制备的牛环形泰勒虫抗原用于ＥＬＩＳＡ试验，检测６２头份带虫牛血清，阳性符合率９６．６７％；在疫区检测１５０头份牛血清，阳性率８０．４３％；在瑟氏泰勒虫流行区检测４５４头份牛血清，有交叉反应，阳性率２８．１９％；检测８９头份安全区牛血阴性符合率１００％。用正常红细胞抗原和环形泰勒虫抗原分别对人工感染和自然感染牛作了特异性试验，结果ＥＬＩＳＡ前者ＯＤ值为阴性，后者ＯＤ值来阳性。２头人工感染牛于     

羧化胶乳凝集试验检测边缘无形体血清抗体的研究

利用边缘无形体可溶性抗原，以化学交联的方式致敏羧化胶乳制成胶乳抗原，成功地建立了一种检测牛边缘无形体血清抗体的胶乳凝集试验(LAT)诊断方法。用制备的胶乳抗原分别检测瑟氏泰勒虫、双芽巴贝虫、衣原体、附红细胞体阳性血清，结果均为阴性；与边缘无形体标准阳性血清、免疫牛血清、流行区血清样品均呈明显的凝集反应。研究结果表明，LAT方法具有操作简单、快速、敏感性高、特异性强、成本低廉等优点，是一种特别适合于基层现场检测边缘无形体血清抗体的新方法。     

用微量间接血凝法诊断牛贝诺孢子虫病的研究

本试验是在1983年研制成功牛贝诺孢子虫抗原及初步应用于临床的基础上,进一步用-20℃条件下保存30个月的病牛皮肤制备牛贝诺孢子虫抗原,对应用微量间接血凝试验诊断牛贝诺孢子虫病进行了扩大复试。结果表明,15份健康牛血清全部为阴性;140头(份)带虫牛血清有133头(份)呈阳性反应,阳性符合率达95.0％;49头类症病牛血清,除1份肉孢子虫血清效价为1:40外,其余均为阴性;对疫区的496头被检牛,通过临床、组织学以及眼巩膜包囊等检查,检出阳性牛33头,检出率为6.65％,通过间接血凝试验检出阳性牛84头,检出率达16.94％,后者检出率明显高于前者。由此认为,间接血凝试验对牛贝诺孢子虫病有很高的检出率和特异性,可用于临床诊断和疫区普查。     

瑟氏泰勒虫裂殖子侵入红细胞实验系统的研究

瑟氏泰勒虫裂殖子侵入红细胞实验系统的研究顾有方摘译卞正勤校本研究检测了在体外瑟氏泰勒虫裂殖子侵入红细胞内的适宜条件，同时也检测了有蛋白酶抑制因子时裂殖子侵入红细胞内的情况，以研究酶对瑟氏泰勒虫裂殖子入侵的影响。其方法如下：在一头４月龄摘除脾脏的荷斯坦...     

斑点免疫吸附试验诊断羊脑多头蚴病的研究

以原头节可溶性粗抗原经Sephadex G-200层析纯化抗原为包被抗原，兔抗羊IgG-HRP结合物为显色剂，建立检测羊脑多头蚴病血清抗体的Dot-ELISA，并以ELISA作平行对照。结果，粗抗原和层析纯化抗原检测86头份羊脑多头蚴病阳性血清，其敏感性分别为94．18％和93．02％，两种抗原的敏感性无显著差异；检测122头份绦虫蚴病阴性血清，18头份棘球蚴病阳性血清，35头份细颈囊尾蚴病阳性血清，其特异性分别为90．29％和95．43％。两种抗原的特异性差异显著。Dot-ELISA和ELISA两种方法的符合率为100％。层析纯化抗原比粗抗原的特异性有了明显提高，而敏感性没有降低。层析纯化抗原和操作术式都具有良好的重复性，Dot-ELISA和ELISA对比试验结果相近，且具简便、快速及不需要复杂设备等优点，是一种检测羊脑多头蚴病血清抗体的理想方法。     

江西省高安地区牛泰勒虫病的流行病学调查

本研究用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)结合聚合酶链式反应(PCR)对我国江西省60头肉牛样品(包括血清和血液基因组)进行了牛泰勒虫病的初步调查。结果显示,该省泰勒虫血清阳性率为100%,PCR检测阳性率28.3%。其中,环形泰勒虫(Ta)阳性率为26.7%,瑟氏泰勒虫(Tser)阳性率为15%,中华泰勒虫(Tsin)阳性率为3.3%,环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫共同感染率为13.3%,环形泰勒虫和中华泰勒虫共同感染率为3.3%。结果表明,江西省牛泰勒虫病感染较为严重,本研究为该地区牛泰勒虫病的综合防治提供了数据参考。     

牛泰勒虫的分离鉴定及进化分析

牛泰勒虫病是严重危害养牛业可持续发展的血液原虫病,本试验采用血涂片镜检和特异性PCR检测技术,对中国某种牛场的18份血样进行了泰勒虫检测,然后分别用ITS基因通用引物和4种MPSP等位基因特异性引物自阳性样品中扩增出对应的基因,克隆测序后,进行序列比对和进化分析,确定泰勒虫基因型。结果显示,自18份牛血样中检出3份阳性样品,且全为瑟氏泰勒虫感染;3个阳性样品的瑟氏泰勒虫MPSP等位基因扩增结果显示,1个阳性样品为I (Ikeda) 和C (Chitose)型的混合感染,另2个样品为I型单一感染,而均无B (Buffeli)和Thai型;用扩增的MPSP基因测序,构建进化树,确认其感染的瑟氏泰勒虫存在MPSP 1型和2型。这些结果表明,该种牛场存在瑟氏泰勒虫感染,且同时存在2种MPSP等位基因型;MPSP等位基因的复杂性可能使该病的免疫防控更加困难。本试验结果为深入研究瑟氏泰勒虫感染情况及免疫防控提供了数据支持,并为养防一体做好监控。     

ESAT-6及PPD ELISA检测疫区和非疫区牛结核病的比较研究

本实验克隆、表达了牛结核早期分泌靶抗原蛋白6（ESAT-61抗原,建立了ESAT-6酶联免疫吸附检测方法（ELISA）。同时应用牛结核提纯菌素（PPD）ELISA和ESAT-6-ELISA对采自疫区的641头牛和非疫区的324头牛进行检测,其中PPD-ELISA检测中,疫区有581头阳性牛,阳性率为90．64％,非疫区有2头阳性牛,阳性率为0、62％;ESAT-6-ELISA检测中,疫区有567头阳性牛,阳性率为88．45％,非疫区没有阳性牛。对采自疫区的23例变态反应阳性牛和非疫区的7例变态反应阳性牛进行检测,其中PPD-ELISA检测中,疫区有20头为阳性。与变态反应的符合率为86．90％,非疫区有1头为阳性,与变态反应的符合率为14％;在ESAT-6-ELISA检测中,疫区有18头为阳性,与变态反应的符合率为78．30％,非疫区没有阳性。这些结果表明：ESAT-6-ELISA的敏感性要低于PPD-ELISA;牛结核ELISA在非疫区应用效果较差,在疫区更具有应用价值。     

牛贝诺孢子虫抗原制备及间接血凝试验诊断牛贝诺孢子虫病的研究

本文报道了直接用贝氏贝诺孢子虫病牛皮肤制备诊断抗原,并用所制抗原通过微量间接血凝法(间接血凝)对吉林、内蒙、河北以及黑龙江等省(区)1086头(份)牛血清进行诊断研究的结果。 所制抗原为蛋白类抗原,其蛋白含量为1.26～1.48毫克/毫升。间接血凝试验表明,207头(份)带虫牛血清检出阳性反应牛196头(份),阳性符合率为94.68％,血凝效价达1∶40～5120;56头健康牛血清均为阴性反应;67头类症病牛血清除2头肉孢子虫牛血清血凝效价为1∶40外,其余均为阴性;3头人工感染牛(18份血清)最早于接种后10天出现阳性反应,比眼巩膜出现虫体包囊早40～50天;来自上述疫区的738头被检牛,通过临床、组织学以及眼巩膜包囊等检查,检出带虫病牛55头(7.45％),而间接血凝法检出阳性牛150头(20.33％),两者相差非常显著。血清学诊断进一步证实了上述地区发生的牛“厚皮病”就是牛贝诺孢子虫病。     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原，建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件：抗原包被浓度为1μg／mL，酶标二抗稀释度为1：1600，血清稀释度为1：60，抗原和血清、血清和二抗均在37C反应30min，底物在37℃显色15min，D655nm阴性、阳性临界值为0．5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验，表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测，结果显示，阳性血清的符合率为27．8％，阴性血清的符合率为91．7％。     

猪附红细胞体环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立猪附红细胞体的快速实用分子生物学检测方法,试验采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法,用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试,同时对新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫病原体进行检测以验证LAMP技术的特异性。结果表明:利用LAMP技术成功检测到猪附红细胞体基因区,此方法的灵敏度可达到5×105倍稀释的DNA分子水平,并且特异性强,对新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫病原体检测均为阴性。     

ELISA间接法诊断牛环形泰勒虫病

我校军事兽医研究所二室,在宁夏畜牧兽医研究所的协助下,应用体外培养的环形泰勒虫裂殖体,制备出ELISA诊断抗原。通过ELISA间接法,测得80头份健牛血清的光密度值(O.D)。以其95％可信限的上限(?+1.96 S)为临界值,凡所测血清     

牛结核ELISA及其抗原的比较研究

作者采用4种抗原建立了ELISA检测牛结核血清抗体的方法,并对其进行了比较。以结核清净声场1026头牛血清建立了ELISA阴性平均值(X),以X±3SD为临界值检测了结核菌素变态反应阳性牛118头,各抗原ELISA阳性率分别为:PPD53％,KCl浸出抗原64％,Triton X-100浸出抗原60％,聚合OT56％。在屠宰牛中对6头变态反应阳性,39头变态反应阴性牛进行了符合试验,ELISA与病变及细菌培养有高的符合率。通过对其它疾病和分枝杆菌免疫血清的检测,证明ELISA法检测牛结核有较好的特异性。4种抗原中以Triton x-100浸出抗原最佳。     

新疆伊犁部分地区奶牛新孢子虫病血清学调查

用新孢子虫地方虫株SRS2重组抗原作为ELISA诊断抗原,对新疆伊犁部分地区奶牛新孢子虫病进行了血清学调查。结果表明,从101份奶牛血清样品中检出牛新孢子虫抗体阳性血清12份,阳性率为11.9%,各种年龄段的奶牛均可感染,经统计学分析,差异不显著(P0.05)。本次血清学调查为新疆伊犁地区有效地控制该病的发生和蔓延提供了重要的理论依据。     

应用ELISA间接法检测猪流行性腹泻抗体的研究

应用猪流行性腹泻病毒(PEDV)吉(J)毒株猪胎肠单层细胞培养物,以冻融法制备抗原,建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法检测PED抗体的方法。对30头份经直接免疫荧光技术证实的PED病猪群血清测定,97％为阳性;检测32头份无PED猪场猪血清,93％为阴性。对1份PED“华毒株”,1份“川毒株”以及3头份“吉毒株”PED免疫血清测定,均为阳性。对猪传染性胃肠炎血清、猪轮状病毒病血清、疑似猪血球凝集性脑脊髓炎血清、鸡传染性支气管炎血清及猪梭菌性肠炎血清共16头份检测均为阴性,证明PEDV不与TGEV等其它3种冠状病毒血清发生交叉反应。89头份疫区猪血清的区域性试验阳性率为75％(67/89);对82头份屠宰猪血清测定,53％阳性。抗原包被板保存期试验表明,包被板在-20℃可保存2个月。     

牛瑟氏泰勒虫对昆明小白鼠的人工感染试验

瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)病是一种经蜱传播,对牛危害严重,流行较广的血液寄生原虫病,其发生与流行在我国呈明显上升趋势[1]。为了开展对动物体内瑟氏泰勒虫的形态、生理、生化及增殖的研究,揭示其生物学特性,筛选治疗药物,观察疫苗预防效果,提供血清学诊断用抗原,张守发     

地方株马驽巴贝斯虫Bc48截短体单克隆抗体的制备及应用

本研究旨在建立马驽巴贝斯虫抗体的快速、准确检测方法。以纯化的马驽巴贝斯虫Bc48基因片段的原核表达产物免疫6周龄雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并利用重组抗原与单克隆抗体建立间接竞争ELISA(CI-ELISA)方法检测马驽巴贝斯虫抗体。结果显示:制备出3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1H2、7F4、11F4,通过对CI-ELISA条件筛选得出,抗原最佳包被浓度为0.19μg·mL~(-1),单克隆抗体11F4的最佳工作浓度为1∶3.2×10~5,通过检测30份马驽巴贝斯虫阴性血清及20份阳性血清,确定该检测方法临界值为45%;特异性试验发现,该CI-ELISA方法不与感染马泰勒虫病的阳性血清发生反应,具有特异性;用所建立的CI-ELISA检测临床血清90份,与标准c-ELISA试剂盒总符合率为92.2%、阳性符合率92.1%、阴性符合率94.1%。试验结果表明,该CI-ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便。基于单克隆抗体(11F4)与重组蛋白(HIS-Bc48)所建立的CI-ELISA特异性、重复性好,可为新疆马驽巴贝斯虫的检测、监控提供有效手段。     

牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

以纯化的原核表达的牛轮状病毒VP7蛋白为包被抗原,建立了检测牛轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法。特异性试验表明,该抗原与其他5种常见牛病病毒(IBRV、BCV、BRSV、ETEC、Cj)的阳性血清无交叉反应,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%;对来自不同牛场的血清样本检测结果显示,该检测方法与病毒中和试验检测结果符合率达87.2%。本试验建立的ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为BRV的快速诊断、免疫牛群血清抗体监测及轮状病毒流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立弓形虫的快速检测方法,本研究建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——环介导等温扩增技术(LAMP)。用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试,同时通过对扩增产物做内切酶验证;为证明LAMP技术的特异性,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体进行检测。结果显示:利用LAMP技术成功检测到弓形虫基因区,此方法的灵敏度可达到能检测5个拷贝DNA分子水平,酶切分析结果正确,并且特异性强,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体检测均为阴性。说明LAMP技术可应用于弓形虫的快速检测。