KDM2B在小鼠卵母细胞及早期胚胎发育过程中的表达分析

本研究旨在分析KDM2B在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达规律,为KDM2B在卵母细胞减数分裂及胚胎发育过程中的生物学作用奠定基础。选择20只6～8周龄小鼠为试验动物,收集GV期、MⅡ期卵母细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、囊胚各阶段胚胎,根据GenBank上已公布的小鼠(Mus musculus)KDM2B序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测KDM2B在胚胎各阶段mRNA的表达水平;通过免疫荧光染色定位KDM2B蛋白在胚胎各阶段的分布。结果显示,GV期卵母细胞KDM2B mRNA的表达量极显著高于MⅡ期(P<0.01);在2-细胞、4-细胞和8-细胞mRNA表达量较低,囊胚期其表达量极显著升高(P<0.01);卵母细胞成熟过程中,KDM2B在GV期主要表达于细胞核中,MⅡ期卵母细胞核中的荧光信号极显著减弱(P<0.01),早期胚胎发育过程中,KDM2B蛋白在2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎中均不表达,囊胚期重新表达于细胞核。综上表明,本研究成功建立KDM2B在小鼠卵母细胞及胚胎细胞中的时空及时序表达模式,关于KDM2B参与调控减数分裂与胚胎发育过程具体的作用机制有待进一步研究。     

BoLA-Ⅰ类基因在牛体细胞克隆胚早期发育中的表达

体外培养成熟的卵母细胞,通过核移植(Nuclear transfer,NT)技术,构建体细胞克隆(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎,以体外受精胚胎作为对照组。收集MⅡ期卵母细胞、2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚,采用实时荧光定量PCR的方法检测经典BoLA-I基因和非经典BoLA-I基因在MⅡ期卵母细胞及各期胚胎中的相对表达量。结果显示,BoLA-I类基因在在牛MⅡ期卵母细胞中的相对表达量显著高于其在其他各时期胚胎的相对表达量(P0.05);BoLA-I类基因在牛SCNT胚和IVF胚中相对表达量随胚胎发育的变化趋势类似,随着第1次及随后的卵裂,经典BoLA-I、NC1、NC2基因mRNA的表达下降到极微的水平;NC3、NC4在整个发育阶段均表达很低甚至难以检测到它们表达。结果表明,本试验通过在体外制备及培养SCNT胚胎,初步建立BoLA-I类基因在其的表达模式,为BoLA-I类基因参与母胎免疫机制的研究奠定基础,为进一步寻找评估胚胎质量的标志物提供依据。     

黄牛卵母细胞和早期胚胎组蛋白乙酰化转移酶1表达模式研究

为探讨卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中组蛋白乙酰基转移酶(HAT1)的表达规律,研究应用实时定量PCR技术,检测了广西本地黄牛卵母细胞和附植前胚胎HAT1基因的表达情况。结果表明:HAT1基因在黄牛生发泡期(GV)卵母细胞、第2次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞、体外受精(IVF)胚胎2～4细胞、8～16细胞、桑葚胚和囊胚中的相对表达量分别为1.00、0.56、0.08、0.55、0.43和0.31,在孤雌激活(PA)胚胎的2～4细胞、8～16细胞、桑葚胚和囊胚中的相对表达量分别为0.55、0.55、0.48和0.46。HAT1在GV期相对表达量最高,在IVF胚胎中2～4细胞表达量最少(P<0.05)。由此可见,HAT1基因在黄牛卵母细胞成熟和早期胚胎阶段均有表达,GV期HAT1基因的表达最高,PA胚胎HAT1基因的表达较稳定。     

HSPA9B在牦牛体外受精胚胎中的表达

本试验旨在研究热休克蛋白70-9B(heat shock 70 000protein-9B,HSPA9B)在牦牛早期体外受精胚胎中的表达差异及其与体外受精胚胎发育的关系。在正常生理条件下,采集青海高原牦牛卵巢,捡取质量良好的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs),进行体外受精和体外培养,采取实时荧光定量(RT-qPCR)和间接免疫荧光技术,检测HSPA9B在不同时期体外受精胚胎中的表达差异及其蛋白分布。实时荧光定量结果表明,HSPA9B在2~4细胞期胚胎中的相对表达量,分别是在桑椹胚和囊胚中的6.693 4、5.227 4倍,HSPA9B在4~8细胞期胚胎中的相对表达量分别是在2~4细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚中的1.136 8、9.089 7和5.937 2倍。间接免疫荧光染色结果表明,在2~4细胞期胚胎、4~8细胞期胚胎和桑椹胚中,胞核HSPA9B的相对表达量较胞质弱,在囊胚中胞核HSPA9B的相对表达量较胞质强。由此得出结论:通过基因水平研究,发现HSPA9B在牦牛早期各时期的体外受精胚胎中存在表达差异,HSPA9B在2~4、4~8细胞期胚胎中的相对表达量与其在桑椹胚和囊胚中的相对表达量差异性极显著(P0.01),提示:可能是HSPA9B在胚胎早期发育中发挥重要作用;通过蛋白水平研究,发现HSPA9B在2~4细胞期胚胎、4~8细胞期胚胎和桑椹胚中,胞核HSPA9B的表达量较胞质的表达弱,在囊胚中胞核HSPA9B的表达量较胞质的表达强,结果表明,在体外培养的环境应激条件下,牦牛体外受精胚胎发育至囊胚时,HSPA9B蛋白的分布可能发生了移位。     

体外生产的牛胚胎超微结构的研究

利用两种常规体外培养系统研究了体外培养及不同培养条件对牛体外受精胚胎早期发育各时期超微结构的影响。结果显示：体外发育的牛胚胎在发育的各个时期（从原核期到囊胚）胞质中均含有丰富的脂滴，胚胎中特别是在桑椹胚及囊胚阶段可见到一些异常细胞。两系统下发育的胚胎中脂滴形态不同，从桑椹胚阶段开始，胚胎线粒体的发育在M199-BOEC-FCS培养系统中明显滞后于其在SOFaa-BSA培养系统中的对照。     

水牛卵母细胞和体外受精早期胚胎端粒酶活性测定

为了解水牛卵母细胞和体外受精（IVF）胚胎早期发育过程中端粒酶的活性变化,本研究利用端粒重复序列扩增法（TRAP）进行了水牛未成熟卵母细胞,成熟卵母细胞和2～4细胞,8～16细胞,桑椹胚以及囊胚各阶段的早期胚胎端粒酶活性的测定。依据电泳条带在成像系统下的光密度值,计算端粒酶的相对活性（RTA）。结果发现,未成熟卵母细胞端粒酶活性比成熟卵母细胞高（P〈0.05）,受精后2～4和8～16细胞胚胎端粒酶活性相对较低,桑椹胚端粒酶活性明显升高（P〈0.05）,囊胚阶段达到最高水平。通过对水牛不同发育阶段胚胎细胞数计数及单细胞相对端粒酶活性的分析比较结果显示,卵母细胞的单细胞端粒酶活性最高,囊胚阶段的最低。单细胞端粒酶活性从未成熟卵母细胞到IVF囊胚阶段呈逐渐降低的趋势。这些结果表明,水牛卵母细胞及早期胚胎的端粒酶活性变化与其成熟、发育阻断及全能性的逐步降低有关。     

体外生产的牛胚胎超微结构研究

利用两种常规体外培养系统研究了体外培养及不同培养条件对牛体外受精胚胎早期发育各时期超微结构的影响。结果显示:体外发育的牛胚胎在发育的各个时期(从原核期到囊胚)胞质中均含有丰富的脂滴,胚胎中特别是在桑椹胚及囊胚阶段可见到一些异常细胞。两系统下发育的胚胎中脂滴形态不同,从桑椹胚阶段开始,胚胎线粒体的发育在M199 BOEC FCS培养系统中明显滞后于其在SOFaa BSA培养系统中的对照。     

卵母细胞质移植对兔原核胚体外发育的影响

卵母细胞胞质中存在着大量的母源性信息，正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由这些母源性信息所控制。为了评估卵胞质含量对早期胚胎发育的影响，以假显微注射兔原核胚为对照，采用显微注射技术将兔原核期胚胎去除或增加一定量的细胞质：试验一，增加5％和20％的细胞质；试验二，移入5％小鼠MⅡ期卵母细胞胞质。胚胎经显微操作后进行R1／R2序贯培养。结果显示，（1）增量5％组胚胎的2细胞胚（72．00％）、8细胞胚（60．00％）、桑椹胚（58．00％）和囊胚（54．00％）的发育率均显著（P〈0．05）高于增量20％组胚胎（分别为47．62％、35．71％、33．33％和30．95％），但与对照组之间无显著差异（P〉0．05）；囊胚细胞数在2个增量组和对照组3者之间也无显著差异（P〉0．05）。（2）将5％小鼠MⅡ期卵胞质移入兔原核胚后，各阶段胚胎发育率和囊胚细胞数与增量5％组、对照组相比均无显著差异；早期胚胎经PCR检测，在2细胞胚（5／5）、8细胞胚（5／5）和桑椹胚（5／5）均全部检测到了供体小鼠mtDNA的D—loop区3’端片段，而在囊胚却仅有1枚（1／5）能够检测到。结果表明，增加少量细胞质不会对兔原核胚的体外发育造成显著影响，但胚胎发育率随着细胞质体积的增加有下降趋势，而异种卵胞质对兔原核胚的发育没有明显影响，在囊胚期虽仍能检测到异种卵胞质中mtDNA的存在，但异种mtDNA会随胚胎发育而逐渐减少。     

β-巯基乙醇或牛磺酸对牛体外受精后早期胚胎的影响

对屠宰黄牛的卵母细胞经体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)后的早期胚胎,在β-巯基乙醇(-βME)或牛磺酸等添加物的胚胎培养液中的后续发育进行了研究,并探讨了其影响因素,以期筛选出最佳的体外培养条件。试验结果表明:4~8细胞期添加-βME可显著提高胚胎桑椹胚、囊胚发育率和囊胚细胞数,但不能改善孵化囊胚的质量。在体外发育培养液中添加7mM牛磺酸可显著提高桑椹胚率和囊胚率(P<0.05),并且在4~8细胞期添加牛磺酸最为合适。     

犏牛体外受精胚胎的发育转录组分析

本研究旨在探讨犏牛早期胚胎发育调控机制,为提高犏牛胚胎体外生产效率提供理论基础。以娟珊牛精子体外受精(IVF)牦牛卵母细胞获得的2-、4-、8-细胞、桑椹胚和囊胚5个阶段的杂种胚胎分别提取总RNA,采用Smart-Seq2扩增、构建测序文库,应用RNA-Seq技术进行高通量测序分析。对HiSeqTM2500测序所得的Raw Reads进行数据过滤后,得到5个发育阶段的犏牛早期胚胎的Clean Reads为47 791 850~63 332 216条,有80.00%~91.13%比对上参考基因的序列。4-细胞期表达的基因数最多(15 400),而桑椹胚表达的基因数最少(9 604)。以log2ratio≥1,Q-value0.05为阈值,获得2-~4-细胞、4-~8-细胞、8-细胞~桑椹胚及桑椹胚~囊胚4个发育阶段的差异表达基因(DEGs)分别为3 690、6 332、8 965和10 298个。GO分析表明,4个发育阶段的DEGs归类注释都涉及生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)3大类67个二级条目。KEGG分析表明,牦牛早期胚胎发育过程中DEGs富集的主要通路有剪接体(Spliceosome)、神经活性配体-受体互作(Neuroactive ligand-receptor interaction)、细胞因子及其受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interactions)、泛素介导的蛋白水解(Ubiquitin mediated proteolysis)、RNA转运(RNA transport)等通路。本研究利用RNA-Seq技术对犏牛体外受精胚胎在发育不同阶段转录组进行了分析,获得了众多差异基因和有关通路的富集,为完善犏牛胚胎体外生产技术提供了理论基础。     

Leptin和ITS对牛卵母细胞体外培养和胚胎生产的影响

利用Leptin和ITS促进体外成熟和体外培养的牛卵母细胞的发育和质量,探讨提高胚胎体外生产的质量和数量的方法和技术。试验1：体外受精胚胎的培养液：添加BSA的KSOM中添加10mL/L浓度的ITS,结果使胚胎的桑椹胚率和囊胚率显著（P〈0.05）高于培养液中不加ITS的对照组（桑椹胚率：43.48%vs29.07%,囊胚率：22.83%vs11.63%）,卵裂率、正常分裂率和8细胞率与对照组差异不显著（P〉0.05）。试验2：在卵母细胞的体外成熟液中添加10μg/L具有生物学活性的重组鸡Leptin成熟肽融合蛋白,Leptin处理组和对照组卵母细胞经体外成熟、受精后转入加有10mL/LITS的KSOM培养液进行体外培养。试验组卵裂率和正常分裂率极显著（P〈0.01）高于对照组（88.96%vs66.81%和61.11%vs29.36%）,8细胞率显著（P〈0.05）高于对照组（84.84%vs69.57%）。Leptin处理的卵母细胞在受精后的桑椹胚率和囊胚率与对照组差异不显著,但最后的囊胚数量较对照组增加1倍多,分别为IVF卵母细胞总数的14.8%和6.4%（P〈0.01）。这说明,添加Leptin对牛卵母细胞体外成熟有促进作用,可显著提高卵母细胞受精后早期胚胎的卵裂率、正常分裂率和8细胞率;加入ITS则能提高桑椹胚率和囊胚率;而Leptin和ITS的按顺序结合使用,则能大大增加体外生产胚胎的桑椹胚和囊胚的数量,从而提高胚胎体外生产的效率。     

牛体外受精胚胎早期发育过程中基因差异表达的研究

本研究旨在筛选牛体外受精胚胎早期发育差异表达基因,并进行差异表达分析。选取牛卵母细胞、体外受精8细胞期和囊胚期胚胎为试验材料,进行mRNA差异表达研究。初步克隆出4个牛卵母细胞和早期胚胎发育不同阶段差异表达的基因,同源性分析显示,它们分别与高移动样蛋白盒结构域4基因(HMGXB4)、热休克蛋白40亚家族C成员8基因(Dnajc8)、突触膜胞吐调节2基因(RI MS2)和核糖体蛋白L31基因(RPL31)高度同源。RT-PCR检测验证,HMGXB4、Dnajc8、RI MS2和RPL31在牛卵母细胞和早期胚胎发育过程中mRNA表达量存在时间性差异,可能与其参与不同的生理活动有关。     

牛磺酸对牛体外受精早期胚胎发育的影响

研究了牛体外受精后早期胚胎体外发育时向其基础培养液中加入牛磺酸对胚胎桑椹胚率、囊胚率和孵化囊胚率的影响.试验1:以TCM-199 10?S为基础培养液(对照组),再加入7、14 mmol/L的牛磺酸(试验组),试验组与对照组的桑椹胚率分别为48.1%、47.4%和43.2%;囊胚率分别为26.4%、22.3%和21.0%;孵化囊胚率分别为21.8%、18.7%和0.试验2:IVF后2细胞、4～8细胞及8～16细胞期,在基础培养液中分别添加7 mmol/L的牛磺酸时,桑椹胚率分别为48.7%、57.1%和52.0%,囊胚率分别为25.1%、30.7%和27.9%,孵化囊胚率分别为25.9%、28.6%和25.0%;而添加14 mmol/L牛磺酸时,桑椹胚率分别为50.4%、56.4%和55.4%,囊胚率分别为26.5%、31.3%和27.7%,孵化囊胚率分别为27.5%、31.1%和29.9%.结果表明,体外发育培养液中添加7 mmol/L牛磺酸可显著提高桑椹胚率和囊胚率(P＜0.05),并且在4～8细胞期添加14 mmol/L牛磺酸最为合适.     

自噬调节因子Atg5和Beclin1在不同来源小鼠胚胎早期发育过程中的表达分析

旨在探究自噬调节因子Atg5和Beclin1在胚胎早期发育过程中的表达模式及胚胎的不同生产方式对两种因子表达的影响。本研究将6~8周龄雌性小鼠进行超数排卵,分为2组,一组收集小鼠卵母细胞,孤雌激活处理后进行体外培养;另一组超排小鼠与公鼠1：1合笼,第2天收集小鼠受精卵进行体外培养;分别在2细胞期、4~8细胞期、桑葚胚期和囊胚期收集不同阶段小鼠孤雌激活胚胎和自然受精胚胎。提取RNA和蛋白,通过实时荧光定量PCR、Western blot等方法检测自噬关键因子Atg5和Beclin1的表达,通过间接免疫荧光法检测Atg5和Beclin1在小鼠囊胚中的表达定位。结果显示,小鼠自然受精和孤雌激活胚胎在发育各时期均可表达Atg5和Beclin1,表达量在胚胎发育的早期呈现出较高的水平,其中二者的表达在小鼠自然受精胚胎中从2细胞期起逐渐降低,而在孤雌激活胚胎的4~8细胞阶段表达量最高,与同期自然受精胚胎差异极显著（P<0.01）;从4细胞期开始,各时期孤雌激活胚胎中Atg5和Beclin1蛋白表达水平均高于自然受精胚胎,差异极显著（P<0.01）;在囊胚中,滋养层细胞和内细胞团中均可检测到Atg5和Beclin1蛋白的荧光,但内细胞团中的荧光强度高于滋养层细胞,且Beclin1蛋白在孤雌激活胚胎囊胚内细胞团中荧光强度高于自然受精胚胎。自噬关键因子Atg5和Beclin1在不同来源小鼠胚胎早期发育各时期均有不同程度的表达,提示自噬对早期胚胎发育的调控作用与胚胎的生产方式存在一定关联,研究结果为进一步探索细胞自噬参与哺乳动物胚胎发育的生理调控提供理论依据。     

小鼠孤雌激活胚胎早期发育过程中胞吞作用相关蛋白的动态表达分析

为探索哺乳动物孤雌激活胚胎早期发育过程中胞吞作用相关蛋白的动态表达,通过体外生产小鼠孤雌激活胚胎,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测不同发育时期小鼠孤雌激活胚胎胞吞作用相关蛋白Cav1、Cav2基因和蛋白相对表达水平,并采用免疫荧光技术进行不同发育时期小鼠孤雌激活胚胎中Cav1、Cav2表达定位分析。结果表明,在小鼠孤雌激活胚胎不同时期均可检测到Cav1、Cav2基因及其蛋白的表达,其中囊胚和桑椹胚中该2个基因的表达水平最高,4-8细胞时期次之,2细胞最低;各发育时期孤雌激活胚胎中Cav1、Cav2蛋白主要定位在胚胎细胞胞质内;囊胚中内细胞团(ICM)细胞中Cav1的荧光强度高于滋养层细胞。说明胞吞作用相关蛋白Cav1、Cav2可能参与小鼠早期胚胎发育的生理调控,桑椹胚和囊胚时期可能是其发挥生理功能的重要时期,并且在囊胚时期对内细胞团发育的调控作用更为显著。研究结果可为探索胞吞作用参与哺乳动物胚胎早期发育的调控机制提供重要参考。     

不同发育阶段小鼠胚胎S、M—期卵裂球的检测以及低温对胚胎细胞DNA合成的影响

利用放射自显影技术检测了小鼠着床前胚胎(4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚)不同发育阶段(早、中、晚)S期和M期卵裂球的比率，并研究了低温(4℃)对小鼠胚胎发育及DNA合成的影响。结果显示，早期和中期4-细胞胚胎S期卵裂球比率较高，分别是75%、92%，没有M期卵裂球，晚期4-细胞胚胎S期卵裂球比率较低(30%)，M期卵裂球比率为11%；早期和中期8-细胞胚胎S期卵裂球比率仍很高，分别是73%、80%，M期卵裂球分别为0、2.5%，晚期8-细胞胚胎S期卵裂球比率增至64%，M期卵裂球减少至9%；早、中、晚期桑葚胚的S期卵裂球比率分别是77%、72%和79%，M期卵裂球的比率分别是5%、3%和3%；早、中、晚期囊胚的S期卵裂球比率分别是78%、74%和77%，M期卵裂球的比率分别是4%、3%和4%。4℃的低温对小鼠早期胚胎的发育和DNA合成都没有明显影响；4-细胞、8-细胞胚胎和桑葚胚经低温处理及培养后其囊胚形成率和平均卵裂球数分别是62%和(26±6)个、54%和(25±7)个、87%和(34±8)个；4-细胞、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚经低温处理后S期卵裂球比率分别是97%、77%、70%和74%。     

热应激对小鼠胚胎细胞HSP70表达和超微结构的影响

本研究旨在确定体外培养的小鼠胚胎细胞合成HSP70的时期,研究热应激对该阶段胚胎细胞超微结构的影响.将合子和体外发育至2-细胞、4-细胞、8～16-细胞及囊胚阶段的胚胎分别进行37、39和41℃的热应激处理,用免疫荧光细胞化学法检测胚胎细胞中HSP70的诱导表达;将体外培养至早期囊胚的小鼠胚胎分别施以39℃2h和41℃2h处理,分别在热应激后0和2h时收集胚胎,制作超薄切片,用电子显微镜观察胚胎细胞的超微结构变化.在各细胞期胚胎中,37℃组胚胎HSP70表达阴性(一);39℃组胚胎,从8～16-细胞开始呈现弱表达(+),囊胚呈阳性表达(++);41℃组的胚胎从4-细胞开始呈现弱阳性表达(+),8～16-细胞胚胎和囊胚呈阳性表达(++).39和41℃热应激处理的小鼠早期囊胚超微结构和对照组均发生明显的变化,但经37℃恢复培养2h后,39℃组胚胎的各细胞器超微结构恢复正常,而41℃组胚胎未能恢复.结果表明,小鼠胚胎从4-细胞期有HSP70的诱导合成,在囊胚期诱导合成最多;热应激使胚胎亚细胞结构出现退行性变化,轻度退行性变化是可逆的.     

牛体外受精早期胚胎发育基因差异表达的研究

应用mRNA差异显示技术,对牛卵母细胞、体外培养的牛早期8细胞期和囊胚期胚胎的基因表达进行了研究。选取4条mRNA表达量存在差异的基因条带进行测序和同源性分析,并利用RT-PCR技术粗略检测其在卵母细胞、8细胞和囊胚中的表达水平。结果表明:4个基因分别与核糖体蛋白S4,Y连接1(RPS4Y1)、末端脱氧核苷酰转移酶作用因子2(DNTTIP2)、剪接和多聚腺苷酸化特异因子3(CPSF3)和转录因子AP-2γ(TFAP2C)高度同源。RPS4Y1、DNTTIP2、CPSF3和TFAP2C在牛卵母细胞和早期胚胎发育过程中mRNA表达量存在时间性差异,可能与其参与不同的生理活动有关。     

hTERT永生化牛乳腺上皮细胞核移植胚胎的早期发育

为了研究供核细胞端粒酶基因的激活是否影响核移植胚胎的早期发育,试验采用转染端粒酶基因的牛乳腺上皮细胞与正常乳腺上皮细胞分别作为供核细胞进行核移植,检测重构胚卵裂率、囊胚发育率和孵化胚发育率及囊胚细胞数的差异。结果表明:2种细胞都可被牛卵母细胞重编程,各项指标差异均不显著。说明供核细胞人端粒酶催化亚基水平的高低对植入前阶段的核移植胚胎发育无显著影响,推测牛早期核移植胚胎可以调节端粒酶基因的表达和端粒的延伸,无需外源人端粒酶催化亚基活性。