草莓psy、pds和zds基因克隆及植物表达载体的构建

设计特异引物,分别克隆草莓类胡萝卜素合成关键基因psy、pds和zds开放阅读框,将psy和pds基因开放阅读框分别插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和Nos终止子之间,构建了植物表达载体pBI121psy和pBI121pds.将psy和zds基因开放阅读框分别插入植物表达载体pCAMBIA1301的CaMV 35S启动子和Nos终止子之间,构建植物表达载体pCAMBIA1301psy和pCAMBIA1301zds.将带有完整启动子和终止子的pds基因引入pCAMBIA1301psy中,最终获得psy和pds的双价植物表达载体pCAMBIA1301psy-pds.经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后,成功将pBI121psy、pBI121pds、pCAMBIA1301psy、pCAMBIA1301zds和pCAMBIA1301psy-pds 5个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中.该研究结果为进一步研究草莓psy、pds和zds基因的功能奠定基础.     

大豆Gy1基因种子特异性表达载体的构建及在玉米中的转化

实验构建了2个大豆贮藏蛋白Gy1基因种子特异性表达载体,并将其分别转入玉米愈伤组织中。载体1以潮霉素为筛选标记,将Gy1基因片段插入到含有种子特异启动子的植物表达载体pCAMBIA1301-7αP上,得到种子特异性表达载体pCAMBIA1301-7αP-Gy1;载体2以BADH为筛选标记,将Gy1基因插入到带有耐盐基因BADH的植物表达载体pCAMBIA1301-BADH上,得到安全性无抗生素选择标记的种子特异性表达载体pCAMBI-A1301-sbeⅡb-Gy1。通过农杆菌介导法将其分别导入玉米自交系H99的愈伤组织中,共获得132株再生植株;经过PCR检测,初步证明获得了34株转基因阳性植株。     

番茄XRN2基因的克隆、表达分析及遗传转化

为了研究番茄XRN2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄各组织混合cDNA中扩增了番茄XRN2基因全长编码序列,并对其进行了表达模式分析。结果表明该基因在番茄根部表达最强烈。通过对番茄叶片进行伤害诱导处理,发现番茄XRN2基因表达呈上升趋势。将该基因在组成型启动子CaMV35S驱动下定向构建至植物表达载体pCambia1301-35S,重组载体命名为pCambia1301-35S-XRN2和pCambia1301-35S-AsXRN2。通过农杆菌介导法转化获得转基因番茄,为进一步阐明XRN2基因在番茄中的功能奠定了基础。     

种子蛋白体靶向表达口服重组胰岛素原载体构建及转化水稻

应用水稻种子生物反应器开发口服重组胰岛素原具有重要应用前景。通过分子设计保证重组胰岛素原在人体肠道内的自主加工成熟,根据水稻密码子偏爱性人工合成了霍乱毒素β亚基和人胰岛素原的融合基因(cholera toxin B subunit fused with human proinsulin,CTBIN),并在C末端添加内质网滞留信号KDEL。通过PCR技术从粳稻品种日本晴全基因组中克隆谷蛋白启动子及其信号肽序列pGluB1sig(GluB1promoter and its signal peptide)用于驱动融合基因CTBIN的表达,插入载体pCAMBIA1302,构建了水稻种子蛋白体靶向表达口服重组胰岛素原的载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBINNos。采用农杆菌介导法转化日本晴,获得了46株转基因水稻植株,Western杂交检测到CTB-人胰岛素原融合蛋白在水稻种子中表达。     

额种子蛋白体靶向表达口服重组胰岛素原载体构建及转化水稻

应用水稻种子生物反应器开发口服重组胰岛素原具有重要应用前景。通过分子设计保证重组胰岛素原在人体肠道内的自主加工成熟,根据水稻密码子偏爱性人工合成了霍乱毒素β亚基和人胰岛素原的融合基因(cholera toxin B subunit fused with human proinsulin,CTBIN),并在C末端添加内质网滞留信号KDEL。通过PCR技术从粳稻品种日本晴全基因组中克隆谷蛋白启动子及其信号肽序列pGluB1sig(GluB1 promoter and its signal peptide)用于驱动融合基因CTBIN的表达,插入载体pCAMBIA1302,构建了水稻种子蛋白体靶向表达口服重组胰岛素原的载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-Nos。采用农杆菌介导法转化日本晴,获得了46株转基因水稻植株,Western杂交检测到CTB-人胰岛素原融合蛋白在水稻种子中表达。     

Patatin、Wun1启动子驱动的PPO反义基因植物表达载体的构建

以植物表达载体PC3-ASPPOty为基础,分别构建了由Patatin、Wun1启动子调控的PPO反义基因植物表达载体pCP-ASPPOty、pCW-ASPPOty,并通过直接导入法将重组质粒分别导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为获得地上部分PPO活性正常、块茎损伤低褐化的马铃薯加工型改良品种奠定了基础。     

Cry2A基因植物表达载体构建及其转化子生长曲线的建立

根据定向克隆原则,以pCAMBIA2301为载体骨架,Cry2A基因为目的基因,构建了大小为15354 bp的植物表达载体p2AST2301。新载体带有抗虫基因Cry2A和筛选标记基因NPTⅡ,适合通过农杆菌进行遗传转化,并以抗生素G418为筛选底物。同时将新载体转化根癌农杆菌EHA105,获得了用于植物遗传转化的工程菌,并且明确了工程菌D600 nm值在1.0-1.6之间活力最强。     

外源木聚糖酶基因atx在水稻中的表达

 为通过在转基因植株中表达木聚糖酶来提高木聚糖酶的生产效率,将具有较高热稳定性和催化活性的杂合木聚糖酶基因atx连接到双元表达载体pCAMBIA1301上,成功构建了木聚糖酶植物表达载体atx Ru3ep 1301。然后以水稻成熟胚的愈伤组织作为转化受体,采用农杆菌介导法将木聚糖酶基因导入水稻(中花11)中。经过潮霉素抗性检测和PCR鉴定,证实目的基因已经整合到转基因水稻基因组中。RT PCR分析结果显示,外源木聚糖酶基因能够在CaMV 35S启动子的引导下在转基因水稻中正常转录。转基因水稻能够正常生长和繁殖。木聚糖酶活性分析表明,转基因植株最高木聚糖酶活性约为4.37 U/g（鲜叶片）。因此,利用转基因水稻生产木聚糖酶将会是一种经济、有效的方法。     

木薯淀粉分支酶基因双价块根特异性反义表达载体的构建

淀粉分支酶(starch branthing enzyme,SBE)是高等植物淀粉生物合成的关键酶之一,包括分支酶I(SBEI)和分支酶II(SBEII)两种类型,调控着支链淀粉的合成.利用DNA重组技术,将这两种分支酶反义基因片段构建在一个植物表达载体中,形成双价反义表达载体p1301-SBEII-Spo-SBEI,其中SBEI反义基因置于CaMV35S启动子之后,SBEI反义基因置于块根特异型启动子.Sporamin之后,两者具有各自的Nos终止子.通过反复冻融法,将双价表达载体转入农杆菌EHA105,并采用PCR技术对所构建的农杆菌工程菌株进行了鉴定分析.     

香蕉Maasr1基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定

以香蕉Maasr1基因为目的基因,载体pBS为中间载体,pBBB、pBI121为表达载体,分别构建含有Maasr1基因的RNAi植物表达载体DBBB-S-I-A和含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBl121-S,并通过农杆菌介导的方式对构建的该RNAi载体沉默效果进行鉴定.结果表明:(1)利用中间载体pBS和植物表达载体pBBB成功构建了香蕉Maasr1基因的RNAi植物表达载体pBBB-S-I-A;(2)利用载体pBI121成功构建了1个含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBI121-S:(3)构建的RNAi载体pBBB-S-I-A可以抑制Maasr1基因的表达,具有较好的沉默效果.     

美洲商陆抗真菌蛋白转化玉米的研究和抗病性检测

研究美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因转入玉米中对玉米纹枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转化玉米获得了大量再生转基因植株。PCR、PCR-southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明,目的基因已经整合到玉米基因组中,并且已经得到转译。     

大豆11S球蛋白Gy5(A3B4)cDNA的克隆及植物表达载体的构建

从大豆(花生豆1号)未成熟种子中提取总RNA,逆转录形成cDNA第一条链.根据genebank中大豆11S球蛋白Gy5的cDNA序列设计引物,用PCR方法扩增Gy5的cDNA序列,克隆到pUC19质粒载体上,并测定其全序列.用限制性内切酶PstI和EcoRI酶切重组质粒,将目的片段与质粒pCAMBIA1301连接,构建成植物表述载体并转化到农杆菌中,以便于以后的研究利用.     

抗菌肽B、D双基因表达载体的构建及转化广藿香的研究

将人工合成的柞蚕抗菌肽D基因和天蚕抗菌肽B基因分别接上启动子和终止于，克隆到双元表达载体PBin19上，构建成双价抗菌肽基因表达载体pTBD。用三亲交配的方法将pTBD导入根癌农杆菌菌株LBA4404，再通过农杆菌将抗菌肽B、D基因导入广藿香，获27个转基因植株。Southern杂交结果表明，抗菌肽B、D基因已同时整合进3个株系染色体组中。与病原细菌Pseudomonassolanacearum试管共培养结果表明，转基因植株获得较强抗病性。盆栽接菌试验结果也表明．转基因植株具有较强抗病性。     

玉米特异启动子驱动下结核hsp65基因植物表达载体构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-Hsp65联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中。结果表明：成功构建了pC1300GHsp65质粒,酶切鉴定得到3 Kb和8.6 Kb两条带,测序分析表明,克隆的Hsp65与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒条带大小与预期结果相符合。结果显示,已成功构建和转化了pC1300GHsp65质粒,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础。     

Mineirao柱花草MSRA基因的克隆及其植物表达载体的构建

根据抗病柱花草中的1个AFLP特异片段SG2950-1设计引物,利用RACE技术从Mineirao柱花草中克隆到一个MSRA基因:经测序比对,该序列与细胞色素氧化酶系基因有较高的相似性.构建了植物表达载体,通过冻融法将该载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404,为进行该基因的功能分析奠定了基础.     

Bt基因表达载体的构建及对茶树遗传转化的研究

用限制性内切酶HindⅢ和BglⅡ从pGA4 71质粒中切取Bt基因并转入载体pCAMBIA2 30 1中 ,构建后的质粒含Bt基因、intron -GUS基因和NPTⅡ基因。将构建后的质粒转化大肠杆菌 ,通过三亲交配法分别导入农杆菌菌株LBA4 4 0 4、EHA10 5、pRi15834中。以茶树叶片、愈伤组织为转化的受体材料 ,用农杆菌介导法将其转入茶树中 ,获得了GUS瞬间表达。以潮霉素作为愈伤组织筛选的选择性试剂 ,效果明显优于卡那霉素 ,适宜浓度为 2 0 μ/ml;以卡那霉素作为茶树叶片材料的筛选试剂 ,50 μ/ml为宜。     

玉米隐性核不育保持系表达载体构建

在Genebank中搜索花粉致死基因Zm AA1、花粉育性恢复基因Ms45、粉质胚乳突变基因Mucronate及各基因特异调控因子和终止子序列,并在目的片段的上下游设计增加同尾酶Spe I(Nhe I、Xba I)和酶切后具有各种类型的DNA片段的Esp3I酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,命名为puc-Zm AA1、puc-Ms45、puc-Mc。采用传统酶切连接的方法将目的片段构建到植物表达载体p CAMBIA3300上,并用热击法将重组质粒导入农杆菌LBA4404及EHA105中,酶切、PCR检测及核苷酸序列测定证明,植物表达载体构建成功。     

农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素

为了研究农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素,以6个小麦品种成熟胚为外植体进行离体培养,以EHA105和LBA4404农杆菌为供体(含有pCAMBIA1305双元载体)材料,研究了诱导培养基、分化培养基、农杆菌菌株、愈伤组织诱导培养时间、农杆菌菌液浓度和侵染时间对小麦成熟胚愈伤组织诱导、分化、再生的影响。结果表明:(1)以小麦品种小偃22的成熟胚为材料,获得最佳的诱导培养基方案(MS+2mg.L-1 2,4-D+0.5mg.L-1 KT+500mg.L-1水解酪蛋白+150mg.L-1天门冬酰胺)和分化培养基方案(MS+2mg.L-1 ZT+0.5mg.L-1 KT);(2)6个小麦品种中,洛阳8176和张掖春小麦具有较强的再生能力,筛选培养后较多的愈伤组织分化出小绿点;(3)洛阳8716和张掖春小麦的成熟胚,经愈伤组织诱导培养6-7d,农杆菌侵染后愈伤组织再生能力强;(4)农杆菌侵染后愈伤组织的再生能力与农杆菌菌株的关系不明显,而与小麦品种基因型、侵染时间和菌液浓度有较明显的关系;(5)以小麦洛阳8716和张掖春小麦成熟胚愈伤组织为受体,黑暗条件下诱导培养6-7d,在24±1℃黑暗条件下共培养3d和500mg.L-1羧苄青霉素(Cb)除菌及10mg.L-1潮霉素筛选处理后,共得到分化植株23株,其中以洛阳8716为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为11株和4株,植株分化率分别为3.57%和1.31%;以张掖春小麦为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为5株和3株,植株分化率分别为1.57%和1.14%。