大麦醇溶蛋白启动子HorD的克隆及其种子特异性表达分析

种子特异性启动子的克隆和功能分析不仅有助于阐明作物种子发育和胚乳特异性基因的表达调控机制，也是进行作物品质改良和种子生物反应器在内的植物基因工程改造的基础。本研究从大麦品种Golden pormise中克隆到大麦胚乳特异性启动子HorD，生物信息学分析表明，其具备启动子的基本元件，如A-box、TATA-box、CAAT-box等，此外还含有胚乳特异性表达所需要的元件Prolamin-box。为验证HorD启动子的表达特性，以pU1300载体为骨架，将HorD启动子和新型冠状病毒（SARA-CoV-2）刺突蛋白基因LPS通过双酶切连接的方式构建表达载体phorD-LPS，并利用农杆菌介导的遗传转化试验验证其种子表达特性。结果表明，HorD启动子能驱动LPS基因在转基因大麦各组织中表达，但在根、茎、叶及颖壳中表达量较低，在种子中表达量较高。这说明HorD启动子可以驱动外源目的基因在大麦种子中特异高效表达。     

酸性蛋白酶pepB基因植物表达载体的构建及在玉米中的转化

以黑曲霉基因组DNA为模板, 利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了酸性蛋白酶pepB基因序列,并将其克隆到pMD18-T Vector上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析并测序。DNA序列分析表明：克隆片段长为1 340 bp,与已发表的pepB基因序列同源性达99.85%。将pepB基因片段插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH上,构建了无抗生素选择标记的重组质粒pB-pepB-35S,从而得到了植物表达载体,该载体利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株,并得到了转化植株的种子。     

耐盐碱基因eIF1A对玉米遗传转化研究

以来自柽柳的耐盐碱基因eIF1A为研究对象,构建其单子叶植物表达载体,并利用农杆菌介导法转化极早熟玉米自交系加2和M1的胚性愈伤组织,创制转eIF1A基因玉米新材料,为耐盐碱转基因玉米育种提供技术和材料支持。结果表明,成功构建eIF1A基因的单子叶植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-eIF1A,共获得33株除草剂抗性植株,其中,12株目的基因和筛选标记基因PCR呈阳性反应,RT-PCR检测表明,目的基因正常转录表达。     

刺葡萄DFR基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究

本研究以从刺葡萄克隆获得的DFR基因为目的基因，同时从质粒pCAMBIA1302中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，并利用双酶切法构建由CaMV35S启动子驱动DFR基因且带有NOS终止子的表达载体，验证测序结果显示成功构建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表达载体，并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达，经鉴定，转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织，经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织，经PCR鉴定，茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和DFR基因等的存在，初步证明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立，验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。     

玉米隐性核不育保持系表达载体构建

在Genebank中搜索花粉致死基因Zm AA1、花粉育性恢复基因Ms45、粉质胚乳突变基因Mucronate及各基因特异调控因子和终止子序列,并在目的片段的上下游设计增加同尾酶Spe I(Nhe I、Xba I)和酶切后具有各种类型的DNA片段的Esp3I酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,命名为puc-Zm AA1、puc-Ms45、puc-Mc。采用传统酶切连接的方法将目的片段构建到植物表达载体p CAMBIA3300上,并用热击法将重组质粒导入农杆菌LBA4404及EHA105中,酶切、PCR检测及核苷酸序列测定证明,植物表达载体构建成功。     

农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因的研究初报

为了研究以小麦茎尖为受体进行农杆菌转化的可行性,选用小麦品种H6756,以茎尖为受体进行了农杆菌转化.构建了含有拟南芥逆境诱导转录因子DREB1A及除草剂bar基因的表达载体pC3300IS-DREB1A,酶切鉴定此载体,结果证明其连接完全正确,具有转录和表达的功能.农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因,共获得247株转化苗.转化苗经除草剂筛选,获得66株抗性苗,对抗性苗进一步进行PCR检测,有30株抗性苗扩增出特异性片段,转化率达到12.1%,初步说明本试验中以小麦茎尖为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的.     

玉米大斑病菌非核糖体肽合成酶NPS6 基因ATMT 敲除载体的构建

载体构建是利用农杆菌介导建立真菌遗传转化体系的基础。以双元载体pPZP100为骨架,通过限制性内切酶酶切、连接以及去磷酸化将标记基因NptⅡ及StNPS6基因侧翼序列导入目标载体pPZP100中,构建玉米大斑病菌非核糖体肽合成酶6基因敲除载体,并采用冻融法将pPZP100NptⅡNPS6转入农杆菌菌株AGL-1。     

耐除草剂转基因玉米CM8401的获得及功能性状鉴定

耐草甘膦和耐草铵膦是转基因作物育种重要的目标性状。将耐草甘膦基因MC1-EPSPS构建到含有bar基因的植物表达载体pTF101.1中，通过农杆菌介导法转入玉米材料Hi-II中，从而获得兼具耐受草甘膦和草铵膦性状的转基因玉米材料 CM8401。目的基因PCR检测显示，MC1-EPSPS和bar基因稳定整合到玉米基因组中。目的蛋白试纸条检测结果显示，MC1-EPSPS蛋白和PAT蛋白在转基因玉米世代间中表达稳定。田间除草剂耐受性鉴定试验表明，转基因玉米CM8401对草甘膦和草铵膦都具有良好耐受性，可耐受4倍推荐中剂量的草甘膦和草铵膦。     

Bt基因表达载体的构建及对茶树遗传转化的研究

用限制性内切酶HindⅢ和BglⅡ从pGA4 71质粒中切取Bt基因并转入载体pCAMBIA2 30 1中 ,构建后的质粒含Bt基因、intron -GUS基因和NPTⅡ基因。将构建后的质粒转化大肠杆菌 ,通过三亲交配法分别导入农杆菌菌株LBA4 4 0 4、EHA10 5、pRi15834中。以茶树叶片、愈伤组织为转化的受体材料 ,用农杆菌介导法将其转入茶树中 ,获得了GUS瞬间表达。以潮霉素作为愈伤组织筛选的选择性试剂 ,效果明显优于卡那霉素 ,适宜浓度为 2 0 μ/ml;以卡那霉素作为茶树叶片材料的筛选试剂 ,50 μ/ml为宜。     

大豆11S球蛋白Gy5(A3B4)cDNA的克隆及植物表达载体的构建

从大豆(花生豆1号)未成熟种子中提取总RNA,逆转录形成cDNA第一条链.根据genebank中大豆11S球蛋白Gy5的cDNA序列设计引物,用PCR方法扩增Gy5的cDNA序列,克隆到pUC19质粒载体上,并测定其全序列.用限制性内切酶PstI和EcoRI酶切重组质粒,将目的片段与质粒pCAMBIA1301连接,构建成植物表述载体并转化到农杆菌中,以便于以后的研究利用.     

美洲商陆抗真菌蛋白转化玉米的研究和抗病性检测

研究美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因转入玉米中对玉米纹枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转化玉米获得了大量再生转基因植株。PCR、PCR-southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明,目的基因已经整合到玉米基因组中,并且已经得到转译。     

Patatin、Wun1启动子驱动的PPO反义基因植物表达载体的构建

以植物表达载体PC3-ASPPOty为基础,分别构建了由Patatin、Wun1启动子调控的PPO反义基因植物表达载体pCP-ASPPOty、pCW-ASPPOty,并通过直接导入法将重组质粒分别导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为获得地上部分PPO活性正常、块茎损伤低褐化的马铃薯加工型改良品种奠定了基础。     

Patatin启动子驱动的人胰岛素原基因的植物表达载体的构建

使用马铃薯的偏爱密码子设计合成人胰岛素原基因,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,构建由patatin启动子调控的人胰岛素原基因植物表达载体p1301Ph,并将导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为日后转基因工作奠定了基础。     

花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建

从花生的幼嫩叶片中提取总DNA,应用PCR方法分离到了两个FAD2基因片段,分别命名为FAD2-1和FAD2-2,将反向的FAD2-1和FAD2-2片段分别与所克隆的大豆油体蛋白基因启动子片段oleosin-a与oleosin-b相连,在中间表达载体pSPROK中构建了三个带T-nos的融合基因,进而把融合基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300中,酶切鉴定后进行测序,结果表明,所构建的三个植物表达载体均分别带有Oleosin启动子和反义FAD2基因序列,FAD2-2的长度为593bps,与引用序列的同源性达到97%,包含一个起始密码子;FAD2-1的长度为1175bp,与引用序列的同源性达到99%,包含一个起始密码子与一个终止密码子。将构建好的植物表达载体已经转化农杆菌LBA4404并用于侵染花生外植体。     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX具有抑菌、抗褐变和保鲜功能。以短短芽胞杆菌菌株FJAT-0809-GLX总DNA为模板,采用PCR扩增超氧化物歧化酶(Supseroxide dismutase,SOD)基因,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行序列测定,结果显示SOD基因序列长度为609 bp(Gen Bank登录号:KM255665),编码202个氨基酸残基。将SOD基因片段与同样酶切的表达载体p ET-28a连接,构建重组表达载体p ET-28a-SOD,转入大肠杆菌BL-21,采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在菌体中存在约25 ku的蛋白表达产物,与该基因ORF预期大小接近。以上结果为进一步研究该酶的生理生化特性奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9系统的OsbHLH116基因编辑及其脱靶效应分析

以水稻OsbHLH116基因为编辑对象,根据基因编码区序列(CDS)在第一外显子区域设计长度为19bp的sgRNA,化学合成sgRNA的寡核苷酸序列,然后与CRISPR/Cas9系统表达载体pBUN411连接,再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系,最后利用酶切和测序相结合的方法对OsbHLH116突变体进行了筛选鉴定和脱靶效应分析。结果表明,所构建的pBUN411-gRNA载体成功实现了对基因OsbHLH116的定向编辑。酶切分析表明在选取的10株T0代转基因苗中得到了6个OsbHLH116突变单株。对6个突变单株进行了TA克隆测序分析,发现了纯合突变、双等位突变和杂合突变3种类型。酶切分析表明2个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应。