禽传染性支气管炎病毒nsp4蛋白多克隆抗体制备及其生物学功能研究

【目的】筛选出禽传染性支气管炎病毒（IBV）非结构蛋白4(nsp4)抗原性较好的氨基酸区域并制备多克隆抗体,为进一步研究nsp4蛋白在IBV复制过程中的功能提供物质基础,也为研发IBV新型诊断试剂盒与疫苗打下基础。【方法】对IBV Beaudette株nsp4蛋白进行原核表达,以融合蛋白nsp4作为免疫原免疫健康日本大耳白兔和健康阴性鸡,制备相应的兔多克隆抗体和鸡多克隆抗体,并通过间接ELISA检测、Western blotting检测及IFA验证等对制备获得的多克隆抗体进行生物学功能研究。【结果】选取nsp4蛋白第408～514位氨基酸作为原核表达序列,成功构建了nsp4蛋白原核表达载体pCZN-1-HIS-nsp4和nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA。原核表达的融合蛋白nsp4为13.6 kD,与预期结果相符,能与IBV GX-YL5株和M41株全病毒阳性血清反应。制备的兔、鸡多克隆抗体血清效价分别为1∶128000和1∶6400,均能与融合蛋白nsp4和IBV全病毒反应,且与IBV GX-YL5株、Beaudette株和M41株感染鸡胚肾细胞（CEK）表达的nsp...     

鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。     

小鼠IL-1β原核表达及其与在布鲁氏杆菌侵染巨噬细胞中差异表达的初步研究

为研究IL-1β在布鲁氏杆菌（Brucella）侵染小鼠巨噬细胞过程中的表达情况，首先构建重组小鼠IL-1β原核稳定表达系统，免疫新西兰兔获得多克隆抗体，通过ELISA检测血清效价，并通过Western blot分析其活性，再以感染复数（multiplicity of infection,MOI）为1∶100（细菌∶细胞）建立猪种布鲁氏杆菌S2株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型，利用RT-PCR检测细菌侵染过程中IL-1β和MyD88 mRNA的变化水平；Western blot分析IL-1β在蛋白水平的变化。结果表明，重组蛋白IL-1β分子质量31 ku，多克隆抗体效价为1∶256 000，并且具有良好的特异性；与对照组相比，感染后IL-1β mRNA和IL-1β蛋白表达上调，胞内细菌数减少。猪种布鲁氏杆菌S2株侵染巨噬细胞IL-1β的表达量随时间变化并影响胞内活菌数。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达及其免疫学原性分析

根据对山东IBV流行株的遗传变异分析,选取流行代表株LC2,扩增其S1基因,将其S1基因克隆到pPIC9K载体中,构建了真核表达质粒pPIC9K-S1,经SacⅠ线性化后,通过电转化到毕赤酵母GS115中,经MD/MM及G418筛选,PCR鉴定,获得多拷贝阳性重组菌pPIC9K-S1-GS115。将重组菌在0.5％甲醇中进行诱导分泌表达,对表达产物进行SDS-PAGE,Western blot分析。结果显示,在酵母培养基上清中检测到分子量为90 ku为目的蛋白,与鸡IBV阳性血清发生特异性反应。将表达上清及其重组菌菌体饲喂SPF鸡,40 ｄ后采血,可检测到IBV保护性抗体。结果表明:表达的IBV的S1蛋白具有很好的免疫原性,为ELISA诊断试剂盒的研制及IBV疫苗的研制奠定基础。     

猪丁型冠状病毒S基因的原核表达及多克隆抗体的制备

纤突（Spike, S）蛋白是猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）诱导机体产生抗体的主要抗原,为制备其重组蛋白和多克隆抗体,本实验对分离株CHN/20GXNN-1/2020的S基因进行序列分析,选择抗原指数较高的b区S1b,克隆至表达载体p ET-32a进行原核表达,重组蛋白S1b主要以包涵体形式表达,大小约为34.1 k Da。利用Ni-NTA琼脂糖树脂纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。通过间接ELISA测定多克隆抗体的效价高于1∶128 000,Western blot和IFA均证明其可以与病毒S蛋白特异性结合。本研究制备的多克隆抗体特异性良好,为进一步研发PDCoV的检测方法和研究S蛋白的功能奠定了基础。     

绵羊肺炎支原体HSP70基因的克隆、表达及免疫原性分析

根据GenBank登录的MO HSP70基因序列,设计特异性引物对MO新疆分离株HSP70基因进行扩增,克隆入T载体中测序。将HSP70基因亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体pGEX4T-1-HSP70,并转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为53ku;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组HSP70具有良好的反应原性。重组HSP70蛋白免疫小鼠后可诱导机体产生特异性抗体,证实该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

弓形虫棒状体蛋白15的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

【目的】克隆弓形虫（Toxoplasma gondii）RH虫株速殖子的棒状体蛋白15(ROP15)基因,原核表达、纯化重组蛋白,并制备多克隆抗体。【方法】根据GenBank登录的弓形虫RH株ROP15(DQ096561.1)基因序列设计了1对引物,以提取的弓形虫RH虫株速殖子RNA为模板,通过RT-PCR获得该虫株的ROP15基因,将该基因连接至原核表达载体pGEX-4T-1上,获得重组质粒pGEX-4T-ROP15,测序结果与预期结果一致;转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导获得重组融合蛋白,运用亲和层析法纯化可溶性ROP15重组蛋白,SDS-PAGE对表达和纯化的目的蛋白进行分析。用纯化的ROP15重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,运用Western blot分析特异性。【结果】成功克隆了弓形虫RH虫株速殖子ROP15基因,大小为924 bp;菌液PCR和酶切鉴定表明重组质粒pGEX-4T-ROP15构建成功,获得了约59 ku的可溶性融合蛋白表达产物;以纯化的可溶性ROP15重组表达蛋白为抗原制备兔源性抗血清,Western blot显示该多克隆抗体与ROP...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NJ-a株ORF6基因的表达及特异性抗体的制备

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332 株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a( )上,构建原核表达载体pET-ORF6.阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSV ORF6基因获得表达.以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体.经Western-blotting证明,该多克隆抗体既能与原核表达的重组M蛋白发生反应,又能与PRRSV发生特异性反应;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与表达PRRSV M蛋白的293T细胞及感染PRRSV的Marc-145细胞发生反应.兔抗PRRSV NJ-a株M蛋白特异性抗体的获得,为进一步研究PRRSV M蛋白的表达和功能奠定了基础.     

猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立

【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。     

猪流行性腹泻病毒安徽分离株N基因的克隆与表达

[目的]克隆和表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因。[方法]采用RT-PCR方法对PEDV FD株的N基因进行扩增,将扩增产物连接pET-28B载体,阳性质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达目的蛋白。[结果]PEDV FD株N基因序列全长为1 326个核苷酸,编码441个氨基酸;重组N蛋白为可溶性表达,大小约58 ku;Western blot检测结果表明,重组N蛋白与PEDV抗体阳性血清发生特异性反应。[结论]该试验制备的PEDV重组N蛋白具有较好的免疫原性,可用于PEDV诊断方法的开发及相关研究。     

高致病性猪蓝耳病疫苗对猪瘟和蓝耳病抗体水平的影响

[目的]研究高致病性猪蓝耳病(High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)疫苗对猪瘟(Classical swine fever,CSF)和猪蓝耳病(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)抗体水平的影响。[方法]采用ELISA方法检测3个猪场248份血清的猪瘟(CSF)和猪蓝耳病(PRRS)抗体,并对CSF抗体阻断率和PRRS抗体的S/P值进行多重比较。[结果]猪场A(没有免疫HP-PRRS疫苗)、猪场B和猪场C(都免疫HP-PRRS毒株JXA-1R疫苗)全群猪的CSF抗体阳性率分别为94.29%、53.93%和66.29%,其PRRS抗体阳性率分别为42.86%、91.01%和82.02%。猪场A、C母猪和全群猪的CSF抗体阻断率极显著高于猪场B(P0.01);猪场A的育肥猪和全群猪的CSF抗体阻断率显著高于猪场C。猪场B的母猪、后备母猪、育肥猪、全群猪PRRS抗体S/P值极显著高于猪场A、C(P0.01),猪场C的育肥猪、全群猪PRRS抗体S/P值显著高于猪场A(P0.05)。[结论]免疫HP-PRRS毒株JXA-1R疫苗可能引起猪群CSF抗体水平降低,PRRS抗体水平提高。     

抗磷酸酪氨酸抗体的制备

目的；制备抗磷酸酪氨酸抗体。方法：以EDC（碳化二亚胺）交联法合成磷酸酪氨酸牛血清白蛋白（P－Tyr－BSA）；以P－Tyr－BSA免疫新西兰免，抗血清经硫酸该盐析和DEAE纤维素柱层析纯化；以琼脂糖双扩法测定抗体效价。结果：得到抗血清效价为1：32，抗血清与牛血清蛋白（BSA）交叉反应的效价为1：2。纯化的抗体与磷酸酪氨酸牛血清白蛋白、磷酸酪氨酸卵清蛋白、磷酸丝氨酸牛血清白蛋白、磷酸苏氨酸牛血清白蛋白反应效价分别为1：32、1：16、1：2、1：2，所得抗体蛋白量为120mg。纯化的抗体在醋酸纤维素薄膜上电泳为单一区带。结论：用此法制备得的抗体专一性高，交叉反应低，抗体量大。     

抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展

通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物,已经成为生物制药领域的一个重要方面,特别是对抗肿瘤单克隆抗体药物的研究已获得了重要进展。多年来,许多研究证实了抗肿瘤单克隆抗体药物的作用,为其应用于肿瘤治疗提供了重要依据。文章就抗肿瘤单克隆抗体药物的种类、制备、应用及存在问题进行了综述,并对其应用前景进行了展望。     

抗鸡法氏囊病和新城疫高免蛋黄液的研制与应用

本文报道了用鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)和新城疫病毒(NDV)经多次、高度免疫的健康蛋鸡,从其所生产的蛋中,提取蛋黄,制成抗IBDV和NDV二联高免蛋黄液。其抗NDV的HI抗体和抗IBDV的中和抗体、沉淀抗体均达到较高的水平。经室内人工发病治疗试验及大田生产应用证明:鸡只注射二联高免蛋黄液之后,在短时间内对IBD及ND有预防作用;对刚发病的鸡群,及时用其注射治疗,效果显著。     

抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌鼠源化噬菌体抗体库的构建及筛选

用灭活的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌免疫小鼠后,取出小鼠脾脏提取总RNA,以RT-PCR扩增小鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,以重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将VH和VL拼接成ScFv基因,克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中,转化大肠杆菌E.coli TG1,构建鼠源抗金黄色葡萄天然噬菌体抗体库。研究结果表明,构建的鼠源性抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抗体库库容为3.2×106,多样性良好,共筛选出8个阳性克隆。说明已成功构建抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抗体库,为筛选有效治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌奠定了基础。     

抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。     

卵黄抗体三种提取工艺的比较

The experiment mainly compares three different methods of extracting antibodies: octanoic acid method, water dilution method and poloxamol method,by observing the physical properties of the antibody, detecting the protein content of the extract, and using the hemagglutination test and the hemagglutination inhibition test to detect the antibody titer, select the best process of the yolk antibody.The results showed that the protein content of the three different extraction methods was the highest by poloxamol method and the lowest by octylic acid method;The contents of Newcastle disease and avian influenza were the highest by water dilution method and the lowest by octanoic acid method;The volume of antibody solution was the highest by water dilution method and the lowest by poloxamu method.Comprehensive comparison of experimental results finally determined that water dilution method is the best effect, using this method to extract yolk antibody titer is the highest, easy to operate, can achieve large-scale production workshop.     

复方中药合剂对肉仔鸡疫苗免疫抗体效价的影响

为探讨自拟复方中药合剂对疫苗免疫后抗体效价的影响。以AA肉仔鸡为研究对象,重点考察复方中药合剂分别与新城疫(ND)Clone-30疫苗、ND油乳剂灭活苗和传染性法氏囊病(IBD)冻干苗联用后,肉仔鸡血清中ND、IBD抗体效价的变化规律。结果显示,试验组鸡血清中的ND和IBD抗体效价均高于对照组。说明,该复方中药合剂可增强肉仔鸡的疫苗免疫效果,具有显著的免疫增强作用。     

抗氯霉素单克隆抗体的制备及直接竞争ELISA方法的建立

用人工合成的氯霉素-卵清蛋白(CAP-OVA)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选出1株能稳定传代并分泌抗氯霉素(CAP)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞4C9,并以此制备腹水单抗.经间接竞争ELISA(ciELISA)检测,该单抗亚类重链类型是IgG1,轻链为κ类型,单抗腹水效价为1∶1×106,与甲砜霉素、氟甲砜霉素以及其他常见抗生素的交叉反应率小于0.01%.用过碘酸钠氧化法合成CAP酶标记单抗,建立了CAP直接竞争ELISA(cdELISA)方法.此法检测的线性范围为0.1~100 ng·mL-1,半数抑制浓度(IC50)为5.81 ng?L-1.添加回收实验表明所建立的CAP cdELISA方法检测限达到0.1 ng·L-1,对比试验表明其检测灵敏度与商品试剂CAP ELISA基本相当.     

利用羊抗鸡抗体检测鹅血浆中的抗体水平

利用商品供应的山羊抗鸡抗体ELISA检测鹅血液中抗体水平的可行性.在相同条件下,以羊抗鸡抗体作为第2抗体,在ELISA分析中检测利用同一抗原免疫后鸡和鹅血浆样品中抗体水平.经过相同倍数梯度稀释的鸡和鹅血浆样品中,所测到的鹅血样的D450 nm值曲线在处理组和对照组均与鸡的D450 nm值曲线变化趋势相同,只是随血样的稀释倍数上升,鹅血样D450 nm值的下降速度较慢.结果表明只要反应条件适当,抗鸡抗体可以作为第2抗体用于ELISA检测鹅血液中的抗体.通过抗原/血浆浓度梯度交叉试验,ELISA中抗原的最适包被质量浓度为100 μg/mL(150 μL/孔),血样最佳稀释比为1:12 800.ELISA测定所得鹅免疫试验中的抗体变化与理论预计结果一致,与在鸡上的变化也类似.