奥利亚罗非鱼β-actin基因的克隆与结构分析

β-actin在真核细胞的生理过程中起着重要作用,其序列具有高度保守性,是一种管家基因。通过RT-PCR方法克隆出奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)β-actin的部分cDNA序列,其长度为424 bp,翻译成138个氨基酸,计算的蛋白质分子量为15.5 ku。氨基酸同源性分析显示,奥利亚罗非鱼β-actin与真鲷(Pagrus major)、斑马鱼(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)、龙溪鳉(Rivulus marmoratus)的相似性最高,为99.3%;与鲫(Carassius auratus)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)等其它鱼的相似性也较高,为97.8%～98.6%。此外,还克隆出了奥利亚罗非鱼β-actin相应的DNA序列,共619 bp。cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的奥利亚罗非鱼β-actin含有2个内含子,这为将来设计β-actin荧光定量PCR引物以及测定其在不同组织中的表达量变化打下基础。     

三角帆蚌AMP基因cDNA全序列的克隆及分子特征研究

以三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）为研究材料,根据实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用RACE克隆了三角帆蚌AMP基因的cDNA全序列。该cDNA序列全长为970 bp,5′端非翻译区123 bp,3′端非翻译区526 bp,开放阅读框（ORF）长为300 bp,共编码99个氨基酸,包含一段由27个氨基酸组成的信号肽和72个氨基酸的成熟肽,分子量为10 924.7 u。氨基酸序列分析表明,该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析表明,该基因编码的蛋白与海兔（Aplysia californica）theromacin氨基酸序列的相似度最高为56%,而与贻贝等中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins相似度较低,推测属于抗菌肽theromacin基因家族。Jpred3软件对三角帆蚌AMP蛋白的二级结构预测结果表明,在第2～22、57～62氨基酸残基处存在α螺旋,因此,三角帆蚌的AMP蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。为进一步研究该基因的表达、功能及三角帆蚌病害防御奠定了分子基础。     

青海湖裸鲤TNNI1和TNNI2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究

【目的】克隆青海湖裸鲤慢收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI1)和快收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI2),分析其在不同组织及盐碱胁迫环境下皮肤和腹侧肌肉组织中的表达水平,为揭示青海湖裸鲤生长缓慢及恢复青海湖裸鲤鱼类资源提供基础数据。【方法】以青藏高原特有鱼类青海湖裸鲤为研究材料,利用RACE技术克隆TNNI1和TNNI2基因全长cDNA序列,进行氨基酸序列同源性比对;利用实时荧光定量PCR法检测2个基因在青海湖裸鲤鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮肤、腹侧肌肉组织的表达情况,以及盐碱胁迫下腹侧肌肉和皮肤组织中的表达规律。【结果】青海湖裸鲤TNNI1 cDNA序列全长为1 211 bp,其中开放阅读框540 bp,共编码179个氨基酸;TNNI2 cDNA序列全长为737 bp,其中开放阅读框531 bp,共编码176个氨基酸。序列同源性分析发现,青海湖裸鲤TNNI1氨基酸序列与安水金线鲃的同源性高达92.13%,TNNI2氨基酸序列与鲤鱼的同源性最高为92.61%。系统发育树结果显示,从TNNI1氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与金线鲃属鱼类、鲫鱼、鲤鱼的亲缘关系较近;从TNNI2氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与鲤鱼的亲缘关系最近,其次是鲫鱼和金线鲃属鱼类。TNNI1和TNNI2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,且在腹侧肌肉中相对表达量最高。盐碱胁迫条件下,TNNI1和TNNI2基因在肌肉组织中的相对表达量均显著下调;在皮肤组织中TNNI1的相对表达量极显著下调（P＜0.01）,而TNNI2极显著上调（P＜0.01）。【结论】成功克隆了青海湖裸鲤TNNI1、TNNI2基因全长;TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中高表达,表明其与肌肉组织发育密切相关;盐碱胁迫条件下TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中的表达均显著下调,提示2个基因表达量降低可能是青海湖裸鲤生长缓慢的重要因素。     

稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因全序列的克隆与分析

稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）是我国特有的一种小型鲤科鱼类,目前已作为一种新型模式生物应用于实验研究。运用普通PCR方法克隆得到一段长6 299 bp的序列,序列分析发现编码区与稀有鮈鲫卵黄蛋白原cDNA序列相似性为100%。再参考6 299 bp序列5′端设计两对特异性引物,进行基因组步移,获得长度为1 285 bp的序列。经过序列拼接后得到7 573 bp的序列,分析发现其中含卵黄蛋白原基因全序列长度为 6 595 bp卵黄蛋白原基因上游调控序列长度为978 bp。进一步分析开放性阅读框得知：稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因含有26个外显子和25个内含子,编码1 299个氨基酸序列,CDS长3 900 bp。经BLAST比对发现,稀有鮈鲫卵黄蛋白原上游调控序列中220～838 bp区间与朝鲜（Acheilognathus yamatsutae）卵黄蛋白原基因启动子序列2 857～3 469 bp 区间有80 %相似性。     

七彩神仙鱼Vasa基因cDNA的克隆及表达分析

源自DEAD-box家族的Vasa基因是生殖细胞的分子标记之一。本研究克隆了七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi） Vasa基因的全长序列,并进行了不同组织的表达分析。结果表明：七彩神仙鱼Vasa 基因cDNA序列共2 370 bp,其中5''UTR占123 bp,3''UTR为279 bp,ORF编码655个氨基酸,长1 968 bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的Vasa基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的同源性最高。半定量分析表明,Vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达,在其它组织中无表达信号。qRT-PCR结果显示,Vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及出膜后50日内均有表达。在受精卵至囊胚期阶段,Vasa基因表达持续增加,在囊胚期至孵化期阶段,表达持续降低。在仔鱼阶段,Vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量。繁殖前后比较发现,繁殖前的精巢组织中Vasa表达量比繁殖后的表达量低,而卵巢恰好相反。本研究结果可为研究七彩神仙鱼的性分化、生殖细胞分子标记及其发育提供参考。     

尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交后代微卫星标记鉴别和种质纯度分析

从罗非鱼微卫星遗传图谱前6个连锁群上随机选取43个微卫星位点,对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、尼罗罗非鱼吉富品系(GIFT)、奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)以及尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼杂交后代的DNA进行PCR扩增,筛选出7个位点（UNH995、GM066、GM166、UNH162、GM017、GM440、UNH948）在不同罗非鱼中扩增的条带差别明显,具有特异性,可作为罗非鱼鉴定的分子标记,用其中任意一个位点都可以将尼罗罗非鱼或吉富罗非鱼、奥利亚罗非鱼、杂交罗非鱼区别开来。这7个标记位点在尼罗罗非鱼、吉富罗非鱼和奥利亚罗非鱼中平均每个位点检测到等位基因个数分别为3.1、2.3、1.7,等位基因大小在130～316 bp。这7个标记位点上,尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼PCR扩增的条带大小相差在20 bp以上,对其中2个位点扩增的条带进行测序分析,结果表明是由于微卫星重复次数的差异而造成的。用这7个位点对尼罗罗非鱼、吉富罗非鱼和奥利亚罗非鱼群体的种质纯度进行检测,结果表明,这3个罗非鱼群体中分别有8%、4%、4%的个体在有些位点上的谱带与杂交罗非鱼的相似,可能存在基因污染。     

团头鲂形态发育相关基因HoxB1b的克隆及功能研究

脊椎动物Hox族基因是一类重要的生长和发育调控基因,它编码具有螺旋—转角—螺旋结构的转录因子,能与下游靶基因特定区域结合并激活表达,从而调节脊椎动物胚胎发育过程中前后轴的形态建成。利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala) HoxB1b基因的全长cDNA序列,并研究了该基因的表达模式。结果表明：（1）团头鲂HoxB1b基因cDNA全长为1 479 bp,其中包括一个编码306个氨基酸残基的921 bp阅读框,聚类分析结果表明,该基因与斑马鱼、红鳍东方鲀、青鳉的相似度分别为89%、45%、40%,在脊椎动物中具有一定的保守性;（2）RT-PCR分析结果显示,HoxB1b在团头鲂胚胎发育过程的各时期均有稳定表达,但在成熟卵中未检测到该基因的表达,表明该基因属非母源表达类型。进一步的整胚原位杂交结果显示,HoxB1b在团头鲂不同时期胚胎存在明显的空间表达差异,受精后20 h（20 hours post fertilization, 20hpf)胚胎主要在后脑表达,受精后40 h（40hpf)胚胎除了在后脑表达外,在胸鳍也检测到表达;（3）HoxB1b基因在团头鲂成鱼部分组织或器官中有表达,且在雌雄鱼中基因表达量有一定差别。综上所述,团头鲂HoxB1b基因的功能与胚胎前后轴上的后脑和胸鳍发育密切相关,并在团头鲂成鱼相关组织中具有重要生理功能。     

山羊Eda基因的克隆、序列分析及表达

【目的】克隆山羊Eda基因CDS区全序列,并对其进行序列分析,研究Eda基因在毛囊生长周期不同阶段皮肤组织中的表达规律。【方法】以太行黑山羊为研究对象,采集其毛囊生长休止期、生长期和退行期背部皮肤组织,采用RT-PCR技术克隆山羊Eda基因,通过在线软件Blastn进行基因cDNA序列分析,用SMART进行氨基酸序列分析,利用SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构分析;以β-actin为看家基因,采用实时荧光定量PCR技术对 mRNA在毛囊生长不同时期皮肤组织中的表达规律进行分析。【结果】太行黑山羊Eda-A1基因CDS区全长1 176 bp,编码391个氨基酸;Eda-A2比Eda-A1少6个碱基（nt1161-1166）,编码389个氨基酸;山羊Eda蛋白氨基酸序列相似性在不同物种间均大于90%。SMART分析表明,CDS编码的蛋白质包含了TNF、跨膜区以及胶原等结构域。SWISS-MODEL软件预测结果表明,Eda-A2与Eda-A1在蛋白质表面结构上存在明显差异。毛囊退行期的皮肤组织中,Eda mRNA表达量最高,且极显著高于毛囊休止期和毛囊生长期（P＜0.01）,毛囊生长期的表达量中等且显著高于休止期（P＜0.05）,毛囊休止期的表达量较低。【结论】Eda基因CDS区在物种间保守性较强,Eda mRNA在毛囊生长周期不同阶段表达量有差异,推测Eda基因对毛囊生长周期的调控有一定影响。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

苹果蠹蛾β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及mRNA表达稳定性检测

【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67bp、3′非编码区268bp和开放阅读框1 131bp,编码一个由376个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的蛋白质相对分子质量为41.793 7ku,等电点为5.29,含有3个actin蛋白家族的典型识别特征以及6种类型的特定功能位点,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达99%。实时定量PCR和半定量PCR结果表明,β-actin基因在苹果蠹蛾发育不同时期以及杀虫剂处理后表达量无显著差异(P0.05)。【结论】苹果蠹蛾β-actin基因可作为可靠的内参基因应用于基因mRNA的表达定量研究。     

凡纳滨对虾繁育相关基因Allatostatin-AR的克隆与表达分析

咽侧体抑制素主要抑制昆虫咽侧体保幼激素的分泌,是昆虫体内重要的神经肽,在甲壳动物体内可能参与繁殖发育的调节。本研究利用RACE PCR技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)A型咽侧体抑制素受体(Allatostatin-A receptor,AST-AR)基因进行克隆,获得全长为2 650 bp的cDNA,包括1 425 bp的开放阅读框,1 170 bp 5''非编码区,55 bp 3''非编码区,编码474个氨基酸,形成具有7个跨膜区的不稳定亲水性蛋白。同源性和系统发育分析结果表明凡纳滨对虾AST-AR基因与斑节对虾(Penaeus monodon)、美洲龙虾(Homarus americanus)同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示AST-AR氨基酸TM7后C末端精氨酸在不同物种之间高度保守。实时荧光定量PCR结果显示,AST-AR基因在雌、雄凡纳滨对虾多个组织(眼柄、脑、胃、肝胰腺、鳃、性腺、肠、肌肉)中均有表达,除脑组织外AST-AR基因在雌性凡纳滨对虾中相对表达量高于雄性。在幼体发育中,AST-AR基因的相对表达量随发育阶段上升,同时该基因在不同群体仔虾生长对比实验中表达量差异显著。据此推测AST-AR基因参与凡纳滨对虾的繁殖、幼体发育、幼虾生长到成虾,基因表达基本贯穿凡纳滨对虾的一生。     

牙鲆ras-2基因cDNA全长的克隆和变态时期的表达分析

Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。采用末端快速扩增法获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)ras-2基因全长2 384 bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽(Paralichthys olivaceus)ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量RT PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初相对表达量较高,随着变态进行,表达水平显著降低。牙鲆变态阶段的RNA整体原位杂交结果显示ras-2基因主要在鳍条、眼眶周围、颌、鳃、鼻孔、侧线等部位的表皮组织中表达,变态前在鳍褶和体侧线表达信号最强,变态阶段E期的信号稍微减弱,主要分布在支鳍骨和鳃,变态高峰期（F期和G期）信号主要集中在支鳍骨、鳃和颌,H期表达信号主要集中在鳃和支鳍骨。ras-2基因表达式型表明其可以通过调控细胞分裂的方式,参与牙鲆变态过程中眼睛移动、冠状幼鳍发育、侧线发育等多种器官的发育调控。     

巨魾鱼细胞色素氧化酶基因多态性及系统进化研究

采用PCR技术克隆得到12尾巨魾(Bagarius yarrelli)的细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)、细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)和细胞色素氧化酶Ⅲ(COⅢ)的基因序列。结果显示:巨魾COⅠ基因序列全长1 551 bp, 12个个体共出现9个单倍型,13个突变位点;COⅡ基因序列全长691 bp,12个个体共出现5个单倍型,5个突变位点;COⅢ基因序列全长784 bp,12个个体出现7个单倍型,8个突变位点。通过最小进化法Minimum Evolution(ME)构建系统发育树分析显示,巨魾与14种鮡科鱼在序列上有一定的同源性,并且COⅠ、COⅡ和COⅢ都与中华纹胸鮡(Glyptothorax sinense)、福建纹胸鮡(Glyptothorax fukiensis)、三线纹胸鮡(Glyptothorax trilineatus)和长丝黑鮡(Gagata dolichonema)在同一个分支,表明巨魾与纹胸鮡属和黑鮡属有较近的亲缘关系。     

普通小麦供体种穗发芽抗性相关基因 AIP2的克隆与进化研究

克隆普通小麦3个基因组供体种的穗发芽抗性相关基因 AIP2（ABI3 interacting protein 2）,预测、分析其功能,阐明其保守区域在不同材料间的变异,为其进化研究提供理论依据,同时为普通小麦 AIP2基因的研究以及利用该基因改良穗发芽性状奠定基础。以野生一粒小麦（Triticum boeoticum,AA,2n=14）、拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops speltoides,SS,2n=14）、节节麦（Aegilops tauschii, DD, 2n=14）为材料,采用同源克隆的方法克隆 AIP2基因,利用生物信息学软件分析其基因结构及功能,并进行遗传进化分析。结果表明,从小麦3个供体种材料中成功克隆 AIP2基因,该基因开放阅读框非常保守,均为969 bp,编码323个氨基酸残基。3个供体材料间 AIP2氨基酸序列仅存在7个氨基酸残基的差异,结构域预测结果显示,AIP2蛋白含有锌指环家族典型的锌指环结构域,进化分析发现, AIP2基因在植物中非常保守,推测该基因在禾谷类作物中可能具有相似的功能。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用，利用RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）克隆了其cDNA全长，使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织（性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜）、早期发育阶段（1~8月龄）性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异，运用RNA干扰（RNAi）对其功能进行初步探究。结果显示KLHL10基因cDNA全长为2 361 bp，其中5''非编码区长93 bp，3''非编码区长447 bp，开放阅读框（ORF区）长1 821 bp，编码606个氨基酸；qRT-PCR结果显示KLHL10基因在精巢中高表达；早期发育阶段在6月龄时表达量最高；12、24、36月龄的表达结果显示，KLHL10基因在精巢中的表达量均高于同时期在卵巢中的表达量（P<0.05）。同时，设计KLHL10基因的3条dsRNA干扰链，结果显示RNA干扰能有效减少KLHL10基因在性腺组织的表达量。根据以上结果推测KLHL10基因在三角帆蚌中是雄性相关基因，其可能参与三角帆蚌的性别分化与精巢发育。     

梭梭VHA B基因克隆及序列分析

采用RT PCR和RACE法从超旱生、耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中扩增出VHA B基因cDNA序列，其开放阅读框为1 413 bp，推测编码全长为471个氨基酸残基的氨基酸序列，该蛋白分子量约为52.304 ku，等电点为5.08。运用SMART、DNAMAN、GOR4、TMPred等生物信息学软件对梭梭VHA B功能域、跨膜结构进行分析显示，梭梭VHA B含有3个ATP synt_ab_N 、ATP synt_ab、ATP synt_ab_C结构域，但是不含跨膜结构域和信号肽。氨基酸序列同源性结果显示，HaVHA B与盐爪爪、盐穗木、碱蓬等同源性高达89.68%。说明VHA B基因是一个高度保守基因。     

瓯江彩鲤体色调控相关因子MC1R的克隆与表达分析

黑素皮质素1受体（melanocortin 1 receptor, MC1R）是动物黑色素合成通路中的关键基因之一,对动物的体色和毛色有重要影响。瓯江彩鲤（Cyprinus carpio var．color）具有5种基本体色类型（“全红”、“粉玉”、“大花”、“粉花”和“麻花”）,其中后3种带有黑色斑点或斑块,是研究动物黑色素合成机制的良好材料之一。克隆了瓯江彩鲤的MC1R基因,并进行了“全红”、“大花”、“粉玉”、“粉花”4种体色间的表达差异分析。研究发现,瓯江彩鲤的MC1R基因的全长cDNA序列为1 914 bp,包括637 bp 5′-UTR（非转录区）、311 bp 3′-UTR及966 bp ORF （开放阅读框）。该基因由一个外显子编码（321个氨基酸）,有7个跨膜结构域。瓯江彩鲤与鲫的编码区核苷酸同源性达98%,与斑马鱼达93%;不同体色间的编码区只存在一个核苷酸无义突变（C/G）,因而氨基酸序列完全相同。qRT PCR表明,MC1R基因在眼睛的表达量显著高于皮肤、肌肉、鳃、肾脏、鳔、心、肝等组织（P<0.05）;但在4种体色间不存在显著的表达差异（P＞0.05）。研究结果表明：瓯江彩鲤体色类型中的黑色斑块不是由MC1R基因直接决定,还有待对其它体色相关基因或调控因子的研究。     

建鲤内参基因β-actin的实时荧光定量PCR方法的建立

β-actin在真核细胞的生理过程中起着重要的作用,其表达范围广、表达量恒定,常作为内参基因应用于real time PCR中。本文通过RT-PCR克隆出建鲤(Cyprinus carpio var.jian)β-actin的部分cDNA序列,其长度为424 bp,翻译成138个氨基酸,计算的蛋白质分子量为15.4 ku。氨基酸同源性分析显示,建鲤β-actin与斑马鱼(Danio rerio)相似性最高,为99.3%。与其他鱼的相似性也较高,为97.8%～98.6%。同时也克隆出了建鲤β-actin相应的DNA序列,其长度为590 bp。cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的建鲤β-actin含有2个内含子,设计一对跨越内含子的引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了real time PCR方法。以肝脏cDNA为标准品,建立了标准曲线,并进行了溶解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有特异性强、相关系数高、线性范围广等优点,可应用于建鲤的功能基因表达研究。     

拟穴青蟹14-3-3ζ基因cDNA的克隆和表达分析

利用SMART RACE技术克隆得到拟穴青蟹ERK信号通路的酪氨酸3 加单氧酶/色氨酸5 加单氧酶激活蛋白ζ（14-3-3ζ蛋白）基因。其cDNA全长1 092 bp,编码248个氨基酸。实时定量PCR结果显示14-3-3ζ基因在各组织器官均有表达,但在卵巢中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,在卵黄发生中期14-3-3ζ的表达量显著高于增殖期（P<0.05）,推测其在青蟹卵巢中发挥重要作用。