奥利亚罗非鱼β-actin基因的克隆与结构分析

β-actin在真核细胞的生理过程中起着重要作用,其序列具有高度保守性,是一种管家基因。通过RT-PCR方法克隆出奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)β-actin的部分cDNA序列,其长度为424 bp,翻译成138个氨基酸,计算的蛋白质分子量为15.5 ku。氨基酸同源性分析显示,奥利亚罗非鱼β-actin与真鲷(Pagrus major)、斑马鱼（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipes）、龙溪鳉（Rivulus marmoratus）的相似性最高,为99.3%;与鲫（Carassius auratus）、红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）等其它鱼的相似性也较高,为97.8%~98.6%。此外,还克隆出了奥利亚罗非鱼β-actin〖WTBZ〗相应的DNA序列,共619 bp。cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的奥利亚罗非鱼β-actin含有2个内含子,这为将来设计βactin〖WTBZ〗荧光定量PCR引物以及测定其在不同组织中的表达量变化打下基础。     

建鲤内参基因β-actin的实时荧光定量PCR方法的建立

β-actin在真核细胞的生理过程中起着重要的作用,其表达范围广、表达量恒定,常作为内参基因应用于real time PCR中。本文通过RT-PCR克隆出建鲤(Cyprinus carpio var.jian)β-actin的部分cDNA序列,其长度为424 bp,翻译成138个氨基酸,计算的蛋白质分子量为15.4 ku。氨基酸同源性分析显示,建鲤β-actin与斑马鱼(Danio rerio)相似性最高,为99.3%。与其他鱼的相似性也较高,为97.8%～98.6%。同时也克隆出了建鲤β-actin相应的DNA序列,其长度为590 bp。cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的建鲤β-actin含有2个内含子,设计一对跨越内含子的引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了real time PCR方法。以肝脏cDNA为标准品,建立了标准曲线,并进行了溶解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有特异性强、相关系数高、线性范围广等优点,可应用于建鲤的功能基因表达研究。     

尼罗罗非鱼Dmrt基因的序列分析

参照不同物种DM结构域设计了1对兼并引物,扩增出1条带,长约150 bp.对扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP 分析筛选不同基因片段,进一步对筛选的不同基因进行了 DNA 测序.结果获得2个不同的DmDmrt基因,采用 BLAST 方法与人类相应DmDmrt基因进行序列比对,发现其与人类相应的DmDmrt基因的氨基酸序列一致性分别为89.1% 和100.0%.根据尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的拉丁文名,按习惯将其命名为OnDmDmrt1和OnDmDmrt2.根据扩增出的DmDmrt1 DM-domain的序列设计上游引物,用3′RACE(rapid amplification of cDNA ends) 法分离和测定了DmDmrt1 cDNA的3′序列,得到1 108 bp的片段,共编码262个氨基酸,与奥利亚罗非鱼、虹鳟、新月鱼、青鳉等动物的DmDmrt1的氨基酸序列进行比较,同源性分别为99%、62%、73%和41%.     

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼几种谷胱甘肽S-转移酶基因克隆与分析

通过RT-PCR法和RACE法,分别从奥利亚罗非鱼(Oreochromisco aureus)肝脏获得alpha、rho1、rho2型GST(GSTA、GSTR1、GSTR2)基因cDNA全序列,从尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)肝脏获得GSTR1、GSTR2基因cDNA全序列。结果表明:奥利亚罗非鱼GSTA基因cDNA全序列为933bp,5′非翻译区(5′-UTR)为98bp,3′非翻译区(3′-UTR)为166bp,开放阅读框(ORF)为669bp,编码222个氨基酸。奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR1基因ORF均为681bp、均编码226个氨基酸;奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR2基因ORF均为693bp,均编码230个氨基酸。氨基酸序列同源性比较和系统进化分析均表明,罗非鱼GST基因与鱼类GST同源性较高,与哺乳类、鸟类、两栖类GST同源性较低。     

奥尼杂交罗非鱼及其亲本热休克蛋白Hsp70基因cDNA序列克隆与比较分析

为探讨杂交罗非鱼抗应激遗传能力及其与亲本之间关系,采用RT-PCR方法克隆了奥尼杂交罗非鱼及其亲本热休克蛋白Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)的cDNA序列.序列分析结果表明:杂交奥尼罗非鱼及其父本奥利亚罗非鱼和母本尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsp70基因CDS均为1923 bp,编码640个氨基酸,含有84个碱性氨基酸,95个酸性氨基酸,理论等电点为5.462.通过antheprot分析发现Hsp70家族的3个签名序列分别为 IDLGTTYS,IFDLGGGTFD,VVLVGGSTRIPKIQK,核定位信号标签:KRKHKKDISQNKRALRR,Dank特征基序DLGTT-S-V,胞质Hsp70特征基序EEVD,靠近C端的GGMP4肽序列,另有2个糖基化位点NKSI和NVSA.奥尼杂交罗非鱼与其亲本Hsp70的序列比对发现,奥尼杂交罗非鱼Hsp70的核苷酸(100%)和氨基酸序列(99.8%)与父本奥利亚罗非鱼基本一致,与母本尼罗罗非鱼有2个氨基酸不同,5个核苷酸突变位点;与母本尼罗罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、青鳉、牙鲆氨基酸序列同源性分别为99.5%、99.4%、93.1%、83.9%.系统发育树分析表明奥尼杂交罗非鱼与父本奥利亚罗非鱼距离最近,与母本尼罗罗非鱼距离远,该结果与传统杂交罗非鱼偏父本遗传结论相符.     

奥利亚罗非鱼SOX9基因cDNA全长的克隆及分析

SOX9基因是重要的转录调控因子,与性别分化形成密切相关.以奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了奥利亚罗非鱼卵巢中SOX9基因cDNA的全长序列.序列全长1 582 bp,其中5'端非翻译区长71 bp,3'端非翻译区长75 bp,开放性阅读框长1 437 bp,编码478个氨基酸.其中第98位开始共81个氨基酸为HMG保守盒.将奥利亚罗非鱼SOX9基因与虹鳟等八种动物的氨基酸序列相比较发现,它们同源性达75%左右,表明SOX9基因在进化中较保守.     

奥利亚罗非鱼SOX9基因cDNA全长的克隆及分析

SOX9基因是重要的转录调控因子,与性别分化形成密切相关.以奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了奥利亚罗非鱼卵巢中SOX9基因cDNA的全长序列.序列全长1 582 bp,其中5'端非翻译区长71 bp,3'端非翻译区长75 bp,开放性阅读框长1 437 bp,编码478个氨基酸.其中第98位开始共81个氨基酸为HMG保守盒.将奥利亚罗非鱼SOX9基因与虹鳟等八种动物的氨基酸序列相比较发现,它们同源性达75%左右,表明SOX9基因在进化中较保守.     

罗非鱼胰蛋白酶Ⅱ cDNA克隆与序列分析

应用3‘-RACE方法对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)和奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)胰蛋白酶Ⅱ cDNA进行了克隆并进行序列测定和分析.结果表明,胰蛋白酶Ⅱ序列中均具有催化活性必需的高度保守的催化三联体氨基酸残基(His、Asp、Ser)和构成二硫键的10个半胱氨酸残基,以及决定底物特异性的保守性氨基酸残基--天冬氨酸残基和S1结合袋.奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼胰蛋白酶Ⅱ mRNA序列以及氨基酸序列同源性分别为96.4%和97.5%.     

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆、序列分析和结构预测

采用RT-PCR和RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法分离出奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶(P450aromA)的全序列,得到1784 bp的全长cDNA,包括38 bp 5'非翻译区,1566 bp阅读框以及含Poly(A)信号(AATAAA)的167 bp 3'非翻译区[不包括Poly(A)].阅读框共编码521个氨基酸,计算的蛋白质分子量为59 ku.同源性分析显示,奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其它鱼性腺P450arom具有70%以上的同源性,与其它鱼脑P450arom为60%左右同源,但芳香化酶高保守区包括I-螺旋区,芳香化酶特异保守区II和血红素结合区III和其它鱼芳香化酶的同源性分别高达83%～96%, 78%～86% 和 85～100%.系统发育分析表明奥利亚罗非鱼P450aromA与鱼类性腺P450arom属于同一分支的.生物信息学分析显示:奥利亚罗非鱼P450A基因编码的蛋白无信号肽,无跨膜区域,为非分泌蛋白,同时含有多个酪蛋白激酶II磷酸化位点, N-糖激化位点,N-肉豆蔻酰化位点,蛋白激酶C磷酸化位点.     

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆、序列分析和结构预测

采用RT-PCR和RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法分离出奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶(P450aromA)的全序列,得到1784 bp的全长cDNA,包括38 bp 5'非翻译区,1566 bp阅读框以及含Poly(A)信号(AATAAA)的167 bp 3'非翻译区[不包括Poly(A)].阅读框共编码521个氨基酸,计算的蛋白质分子量为59 ku.同源性分析显示,奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其它鱼性腺P450arom具有70%以上的同源性,与其它鱼脑P450arom为60%左右同源,但芳香化酶高保守区包括I-螺旋区,芳香化酶特异保守区II和血红素结合区III和其它鱼芳香化酶的同源性分别高达83%～96%, 78%～86% 和 85～100%.系统发育分析表明奥利亚罗非鱼P450aromA与鱼类性腺P450arom属于同一分支的.生物信息学分析显示:奥利亚罗非鱼P450A基因编码的蛋白无信号肽,无跨膜区域,为非分泌蛋白,同时含有多个酪蛋白激酶II磷酸化位点, N-糖激化位点,N-肉豆蔻酰化位点,蛋白激酶C磷酸化位点.     

异育银鲫促甲状腺激素β亚基基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR、RACE及克隆等方法获得了异育银鲫促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因全长cDNA序列。该cDNA全长926 bp,5’端非编码区68 bp;3’端非编码区372 bp;开放阅读框(ORF)486 bp,编码161个氨基酸。经序列分析显示,其编码的氨基酸序列与金鱼[Carassius auratus(goldfish)]、鲤(Cyprinus carpio)、鳙(Aristichthysnobilis)、斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟(Salmo gaidnerii)、鲑(Salmo salar)、鳗鲡(Anguilla anguilla)具有较高的相似性,其相似性分别为91.3%、87.6%、83.2%、77%、58.6%、56.1%、43.55%,同源性较高,这说明TSHβ亚基在长期的进化中具有较高保守性。而且在比较中还发现:异育银鲫和其它7种鱼类相比在5’端多11个氨基酸序列,并且都含有定位保守的12个半胱氨酸残基和一个N糖基化位点。     

异育银鲫促甲状腺激素β亚基基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR、RACE及克隆等方法获得了异育银鲫促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因全长cDNA序列。该cDNA全长926 bp,5’端非编码区68 bp;3’端非编码区372 bp;开放阅读框(ORF)486 bp,编码161个氨基酸。经序列分析显示,其编码的氨基酸序列与金鱼[Carassius auratus(goldfish)]、鲤(Cyprinus carpio)、鳙(Aristichthysnobilis)、斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟(Salmo gaidnerii)、鲑(Salmo salar)、鳗鲡(Anguilla anguilla)具有较高的相似性,其相似性分别为91.3%、87.6%、83.2%、77%、58.6%、56.1%、43.55%,同源性较高,这说明TSHβ亚基在长期的进化中具有较高保守性。而且在比较中还发现:异育银鲫和其它7种鱼类相比在5’端多11个氨基酸序列,并且都含有定位保守的12个半胱氨酸残基和一个N糖基化位点。     

青鳉DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析

[目的]为了进行青鳉DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析的试验。[方法]利用生物信息学手段克隆了青鳉DNA聚合酶β（OlPolβ）基因全长cDNA序列,并对其启动子和编码蛋白结构进行分析。[结果]该cDNA序列的全长1716by,编码含338个氨基酸残基的蛋白。OlPolβ具有14个外显子和13个内含子。OlPolβ启动子上发现了SP1等一些转录因子的潜在结合位点。[结论]OlPolβ蛋白序列与其他脊椎动物的蛋白序列具有高度一致性。     

5个品系罗非鱼热休克蛋白Hsp70基因序列比对分析

采用RT-PCR技术,对美国尼罗、埃及尼罗、美国奥利亚、中国奥利亚、奥尼杂交罗非鱼(埃及尼罗♀×美国奥利亚♂)5个品系罗非鱼热休克蛋白Hsp70基因进行扩增并克隆测序,最终获得5个品系罗非鱼Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)cDNA序列,全长均为1923 bp,编码640个氨基酸,含有Hsp70家族3个签名序列IDLGTTYS、IFDLGGGTFD和VVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端保守序列EEVD,核定位信号标签KRKHKKDISQNKRALRR;Dank特征基序DLGTT-S-V;胞质Hsp70特征基序EEVD;靠近C末端的GGMP4肽序列;2个糖基化位点NKSI和NVSA.对5个品系罗非鱼Hsp70基因序列比较分析发现,它们之间共有12个核苷酸位点发生转换,但氨基酸序列完全一致.研究结果为深入研究不同品系罗非鱼的抗逆机理以及指导罗非鱼抗性育种奠定了可行性支撑基础.     

建鲤内参基因EF-1α的实时荧光定量PCR方法的建立

真核生物延伸因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,常作为内参基因应用于real time PCR中。通过RT-PCR克隆出建鲤(Cyprinus carpio var.jian)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425 bp,翻译成140个氨基酸,Blast结果显示与其它鱼类leptin的相似性为98%。同时也克隆出建鲤EF-1α相应的DNA序列,共506 bp。cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的建鲤EF-1α含有1个相位为0的内含子,在此基础上设计一对跨越内含子的引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了real time PCR方法。以肝脏cDNA为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有特异性强、相关系数高、线性范围广等优点,可应用于建鲤的功能基因表达研究。     

罗非鱼胰蛋白酶Ⅱ cDNA克隆与序列分析

应用3′-RACE方法对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)和奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)胰蛋白酶Ⅱ cDNA进行了克隆并进行序列测定和分析。结果表明，胰蛋白酶Ⅱ序列中均具有催化活性必需的高度保守的催化三联体氨基酸残基(His、Asp、Ser)和构成二硫键的10个半胱氨酸残基，以及决定底物特异性的保守性氨基酸残基——天冬氨酸残基和S1结合袋。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼胰蛋白酶ⅡmRNA序列以及氨基酸序列同源性分别为96．4％和97．5％。     

苹果蠹蛾β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及mRNA表达稳定性检测

【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67bp、3′非编码区268bp和开放阅读框1 131bp,编码一个由376个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的蛋白质相对分子质量为41.793 7ku,等电点为5.29,含有3个actin蛋白家族的典型识别特征以及6种类型的特定功能位点,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达99%。实时定量PCR和半定量PCR结果表明,β-actin基因在苹果蠹蛾发育不同时期以及杀虫剂处理后表达量无显著差异(P0.05)。【结论】苹果蠹蛾β-actin基因可作为可靠的内参基因应用于基因mRNA的表达定量研究。     

中华豆芫菁β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

【目的】克隆中华豆芫菁(Epicauta chinensis Laporte)β-actin基因全长cDNA序列,并检测其在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。【方法】采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cD-NA序列,利用生物信息学软件对其进行序列分析;并用实时定量PCR方法检测在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种不同组织中及注射刺激和非刺激条件下β-actin基因的表达量。【结果】中华豆芫菁β-actin基因全长1 673bp,其中5′非编码区88bp,3′非编码区455bp,开放阅读框为1 120bp,编码376个氨基酸,推测其编码蛋白分子质量约为93.6ku,理论等电点为5.09,富含6类特定功能位点,其氨基酸序列与其他昆虫的β-actin序列一致性可达97%～99%;实时定量PCR结果显示,该基因在中华豆芫菁不同组织、注射刺激与非刺激情况下表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】中华豆芫菁β-actin基因可作为基因表达定量研究中的可靠内参。该基因的cDNA序列已递交GenBank,获得登录号为JQ764814。     

猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶和脱氢抗坏血酸还原酶cDNA片段的克隆与序列分析

克隆猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,可为揭示猕猴桃高抗坏血酸(AsA)含量的分子机制奠定基础。研究以猕猴桃果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出L-GalLDH基因的cDNA片段857 bp和DHAR基因的cDNA片段594 bp并测序,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因和DHAR基因氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,猕猴桃GalLDH基因氨基酸序列和核苷酸序列与刺梨的相似性高达88%,其在同源基因进化关系树中单独聚为一类;DHAR基因氨基酸序列和核苷酸序列与苹果的相似性高达98%和99%,两者在进化关系上聚为一类。可知克隆到的2个核苷酸片段确为猕猴桃L-GalLDH和DHAR基因cDNA片段,同源基因植物亲缘关系聚类与传统的形态分类有一定的差异。     

5个罗非鱼品种(系)线粒体DNA 16S rRNA和Cyt b基因片段序列分析

对3个尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)品系(埃及、无锡、吉富)和奥利亚罗非鱼(Oreochromis au-reus)以及杂交种奥吉(奥利亚♀×吉富♂)的线粒体16SrRNA和细胞色素b(Cytb)的部分序列进行了PCR扩增和序列测定,并分析了其序列差异。结果表明:PCR产物纯化后测序,16S rRNA扩增产物得到长度为596bp的基因片段,其碱基组成G+C平均含量为47.5%,序列比对分析显示变异位点13个,没有碱基的插入/缺失变异,转换/颠换比率为3.33;Cytb扩增产物测序得到659bp的同源片段,其碱基组成G+C含量平均为45.2%,无插入/缺失变异,变异位点共2个,都为转换,2处变异都发生在密码子第3位上,编码的氨基酸未发生变异。序列分析表明,尼罗罗非鱼3品系的序列完全相同,奥利亚的序列则与奥吉相同。这表明在罗非鱼线粒体DNA中,16S rRNA进化速率相对较快,而Cytb基因则高度保守,不适于研究罗非鱼种内和种间的亲缘关系和种类鉴别标记。