模拟高温制粒过程中酶活损失的快速评定方法

试验采用湿热法,并用水浴和烘箱2种加热方式,模拟在制粒过程中,温度变化对植酸酶酶活损失的变化情况的影响.从市场上收集到A、B、C、D和E5种耐高温植酸酶产品,分别经85℃烘箱处理和85℃水浴处理后,发现烘箱处理组酶A和B活性损失率显著低于水浴处理组,酶D活性损失率显著小于水浴处理组；酶C和E组间活性损失率差异不显著.5种植酸酶分别经85、90和95℃水浴处理后,植酸酶A的活性损失率分别为50.39％、65.64％和71.15％；植酸酶B的活性损失率分别为47.66％、69.90％和73.65％；植酸酶C的活性损失率分别为2.96％和15.46％和29.83％；植酸酶D的活性损失率分别为4.68％、40.45％和47.18％,植酸酶E的活性损失率分别为28.29％、69.11％和71.89％.试验结果表明植酸酶C具有最好的耐热性；采用水浴加热方式的湿热法更适用于试验.     

植酸酶包埋后酶活和热稳定性的变化规律研究

为了了解植酸酶在包埋状态下酶活及酶性的变化,分别对酶的释放情况和热稳定性进行了研究。结果表明,随着时间的延长,包埋酶释放出的酶活逐渐上升(P<0.01),60min时达到最大值;而未包埋酶释放出的酶活逐渐下降(P<0.01),60min时达到最小值。包埋酶和未包埋酶在30、40、50、60、70、80、90和100℃的条件下,随着温度的升高,残留的植酸酶活力下降(P<0.01)。对于包埋酶,当温度升高到70℃时,植酸酶相对酶活仍保持在93%(P>0.05);当温度升高到80℃时,植酸酶的相对酶活才明显下降(P<0.01),不过在100℃时,仍能保持67%的酶活(P<0.01)。对于未包埋酶,当温度升高到60℃时,植酸酶相对酶活明显下降(P<0.01);当温度升高到100℃时,植酸酶相对酶活仅有23%(P<0.01)。通过在统一温度条件下,对包埋酶和未包埋酶处理组的相对酶活的对比发现,在50℃以下时,二者差异不显著,当温度超过60℃时,包埋酶的相对酶活极显著高于未包埋酶。     

植酸酶包埋后酶活和热稳定性变化的规律研究

为了了解植酸酶在包埋状态下酶活及酶性的变化,分别对酶的释放情况和热稳定性进行了研究.结果表明,随着时间的延长,包埋酶释放出的酶活逐渐上升(P＜0.01),60min时达到最大值;而未包埋酶释放出的酶活逐渐下降(P＜0.01),60 min时达到最小值.包埋酶和未包埋酶在30、40、50、60、70、80、90和100℃的条件下,随着温度的升高,残留的植酸酶活力下降(P＜0.01).对于包埋酶,当温度升高到70℃时,植酸酶相对酶活仍保持在93%(P＞0.05);当温度升高到80℃时,植酸酶的相对酶活才明显下降(P＜0.01),不过在100℃时,仍能保持67%的酶活(P＜0.01).对于未包埋酶,当温度升高到60℃时,植酸酶相对酶活明显下降(P＜0.01);当温度升高到100℃时,植酸酶相对酶活仅有23%(P＜0.01).通过在统一温度条件下,对包埋酶和未包埋酶处理组的相对酶活的对比发现,在50℃以下时,二者差异不显著,当温度超过60℃时,包埋酶的相对酶活极显著高于未包埋酶.     

水浴法测定饲用植酸酶耐热性方法的研究

试验研究不同条件对植酸酶水浴耐热性的影响。分别稀释4种植酸酶酶活力40、20、10、2 U/mL,测定80℃和85℃水浴5 min的耐热性。结果表明,稳定性强的植酸酶受酶浓度的影响较小,稳定性较差的植酸酶受影响较大,当处理液酶活力低时,耐热性结果较高。取3种植酸酶样品,分别使用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、水为耐温稀释缓冲液,测定85℃水浴5 min耐热性,结果表明:缓冲液Ⅰ作为稀释缓冲液测定的耐热性结果最高,其次是缓冲液Ⅱ,水作为稀释缓冲液时测定的耐热性结果最低。取3种植酸酶样品,分别在pH值5.5和5.0缓冲体系中测定85℃水浴5 min耐热性,结果表明,植酸酶在与最适pH值相近的条件下进行耐热性处理,测定的耐热性结果相对较高。研究表明,本试验的3种条件对水浴法测定植酸酶耐热性的结果均有影响,制定检测标准时需要明确测定条件。     

植酸酶基因在嗜酸乳杆菌中的表达

植酸酶和嗜酸乳杆菌是重要的饲料添加剂,为获得产植酸酶的嗜酸乳杆菌菌株,克隆了大肠杆菌植酸酶基因,构建表达载体并转化嗜酸乳杆菌,对重组嗜酸乳杆菌进行发酵产酶并测定所产酶液的酶学性质,进一步研究重组嗜酸乳杆菌的耐酸性及植酸酶液的抗蛋白酶活性。结果表明：重组嗜酸乳杆菌发酵24 h植酸酶活性为984 U/mL,植酸酶的最适催化pH为4.5,最适催化温度为60℃。重组嗜酸乳杆菌在pH 2.0～4.5有一定的耐酸性,在pH 2.0条件下2 h的存活率为76.4%。植酸酶液用胃蛋白酶处理160 min后植酸酶液剩余85%的相对酶活,用胰蛋白酶处理160 min后剩余29%的相对酶活。上述研究结果为重组嗜酸乳杆菌后续应用研究提供了重要依据。     

耐热植酸酶的酶学性质研宽

采用钒钼酸铵法对耐热植酸酶的酶学性质进行研究,结果表明,该酶的最适反应温度为65℃;最适反应pH 4.0,pH 2.0～5.5之间有较大的活性区间;有较强的耐酸性,pH 2.0～6.5之间处理1 h仍有超过90%的活性;具有很强的耐热性,干热处理对酶活没有影响;经湿热试验箱85℃和95%RH处理5 min,酶活能保存约80%;金属离子和螯合剂对酶活没有明显的激活或抑制作用;该酶抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力较强;该酶的米氏常数Km=1.737 mmol/L,最大反应速度V<,max>=52.632μmol/(mg·min).     

耐热植酸酶的酶学性质研究

采用钒钼酸铵法对耐热植酸酶的酶学性质进行研究,结果表明,该酶的最适反应温度为65℃;最适反应pH4.0,pH2.0～5.5之间有较大的活性区间;有较强的耐酸性,pH2.0～6.5之间处理1h仍有超过90%的活性;具有很强的耐热性,干热处理对酶活没有影响;经湿热试验箱85℃和95%RH处理5min,酶活能保存约80%;金属离子和螯合剂对酶活没有明显的激活或抑制作用;该酶抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力较强;该酶的米氏常数Km=1.737mmol/L,最大反应速度Vmax=52.632μmol/（mg.min）。     

转植酸酶基因玉米植酸酶稳定性的研究

试验以转植酸酶基因玉米(PTC)为原料,通过烘箱高温处理,研究PTC的耐热性能;通过在不同挤压温度(60、80和100℃)和不同物料(750 U/kg PTC组和6 500 U/kg PTC组)组合下,研究PTC在制粒加工工艺中的稳定性。结果表明:PTC具有较好的耐热性能,120℃烘箱处理5 min,其植酸酶酶活损失率为13.38%;但在制粒温度上升时,植酸酶酶活损失率呈明显上升趋势,当制粒温度达到100℃时,PTC的植酸酶酶活损失率在90%以上。     

植酸酶的特性及稳定性效果的对比研究

试验就植酸酶的相关特性及其在此基础上的应用选择功效进行研究,并对市场上占有率较高的三个国产知名企业生产的植酸酶产品(P1、P2、P3)进行稳定性研究,比较这三种植酸酶产品在不同pH值、不同温度下(室温、80℃水浴、90℃常湿)和不同储存时间的酶活,为生产实践中合理选择使用植酸酶提供参考依据。结果表明,P2在酶活高峰pH值4.5～5.0表现出的酶活显著高于P1和P3(P0.05)。高温稳定性效果P3显著优于P1和P2(P0.05)。     

中性植酸酶的酶学性质研究

采用钒钼酸铵法对中性植酸酶的酶学性质进行了研究,并对酶活的测定条件进行了摸索。研究结果表明,该酶的最适反应温度为48℃;最适反应pH值为6.0;在pH值5.0～6.5之间有较大的活性区间;有较强的耐酸性,在pH值2.0～9.0之间处理1h仍有90%以上的活性;具有很强的耐热性,经湿热试验箱85℃、95%RH处理5min酶活能保存70%左右;Zn2+离子对酶活有一定的抑制作用,Mn2+离子对酶活有一定的激活作用;该酶抵抗胃蛋白酶的能力比较强,抵抗胰蛋白酶的能力较弱;该酶的米氏常数Km=0.563mmol/l,最大反应速度Vmax=6.250μmol/(mg·min)。     

植酸酶在肉仔鸡消化道内环境下活性变化的体外研究

本研究在体外条件下对肉仔鸡消化道内pH环境以及蛋白质水解酶对黑曲霉植酸酶活性的影响进行了研究。结果表明,该植酸酶为酸性植酸酶,最适pH为5.5。该植酸酶对pH环境和蛋白质水解酶较为敏感。当环境pH远离其最适pH时其活性迅速下降,且大部分酶活损失发生在30 min内,然后趋于稳定。在pH3.0和pH6.0条件下,加入胃蛋白酶和胰酶后,植酸酶活性亦进一步迅速降低,然后趋于稳定,但与胃蛋白酶相比,胰酶对植酸酶活性的影响更大。从植酸酶在14、28和42日龄肉仔鸡胃和小肠稳定性的研究可以看出,植酸酶在胃存留率分别为42%、40%和49%,在小肠内的存留率仅19%。植酸酶在胃内的稳定性好于小肠,小肠内环境不利于植酸酶存活。植酸酶活性受肉仔鸡消化道pH和蛋白酶的影响较大,这可能是影响植酸酶作用效果的主要因素之一。     

6种不同品牌植酸酶耐热性能的评价

植酸酶对于有效释放饲料中的植酸磷有着重要的意义,目前国内外对植酸酶的研究已经从基础的理论研究向应用研究发展,从天然获取向基因工程发展,通过对目前市面上销售的6个品牌的耐高温植酸酶进行实验室湿热试验和饲料制粒试验,研究这6个经过高温处理后植酸酶的湿热酶活存留率和制粒酶活存留率。结果表明:国外品牌F耐温效果最优,国内品牌A可与之媲美,85℃饲料制粒仍可保留85.92%,显著高于除国外品牌F的其他各品牌植酸酶;另外,实验室湿热法对于饲料实际制粒耐热结果具有一定指导意义。     

植酸酶转基因猪成纤维细胞系的构建

本研究旨在获得对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有耐受性的植酸酶转基因猪成纤维细胞系.本研究首先检测了转植酸酶基因的酵母发酵液分别经不同浓度、pH2.0的胃蛋白酶和不同浓度、pH7.0的胰蛋白酶处理后的酶活残余量；然后采用流式细胞术筛选了慢病毒转染的阳性猪成纤维细胞,并进行鉴定.结果表明,酵母粗酶液经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,残留酶活分别保持在70％和80％以上；包装后的慢病毒滴度为3.75×107,经流式细胞术筛选的转基因细胞阳性率为1.2％,PCR和RT-PCR结果表明,植酸酶基因已整合到基因组上,且该基因在转录水平上表达.本研究为制备植酸酶转基因细胞系提供了一种快速有效的方法,为转基因猪的培育奠定了基础.     

不同来源植酸酶抗逆性的研究

本试验通过模拟饲料制粒过程及动物胃环境,对不同来源的植酸酶在经过高温和酸处理后酶活变化情况进行了对比分析,为植酸酶的实际应用提供理论依据。(方法)搜集到11种市售的植酸酶产品,编号为1~11采用湿热法,温度分别设置为75℃、80℃和85℃,处理时间为2.5min,p H处理值设定为4.0、3.0和2.5,处理时间为2h。结果表明,不同来源的植酸酶耐温性和耐酸性存在很大差异,从耐温性看,温度在75℃~80℃时,1号样相对酶活最高,而继续升至85℃时,11号样稳定性最好,10号样次之;从耐酸性看,p H值从4.0降至3.0时,10号样相对酶活最高,11号样次之,其他稳定性均比较差。因此,综合考虑,在模拟饲料制粒条件和动物胃环境下评定酶的作用效果,以10、11号样耐受性最好,4、5号样酶活稳定性最差。     

产β-葡萄糖醛酸苷酶菌株胃肠道耐受性与酶学特性研究

为发酵转化黄芩苷生产活性产物黄芩素、研发益生菌和中草药黄芩协同联用绿色混合型饲料添加剂产品奠定基础,试验采用酶解底物显色法和薄层层析法,从健康鸡肠道内容物中分离筛选出一株产β-葡萄糖醛酸苷酶的JY24菌株,经菌落形态、生理生化及16SrDNA序列分析,鉴定为枯草芽孢杆菌。结果表明:(1)JY24菌株对人工胃液、人工肠液均有一定耐受能力,胆盐最高耐受浓度为0.3%～0.5%;(2)JY24菌株所产β-葡萄糖醛酸苷酶的最适温度为35℃,40℃、50℃和60℃处理1 h相对酶活分别为72.96%、31.63%和0;(3)最适pH 6.5,在pH 6.0和7.0环境下,酶活相对稳定,处理1 h相对酶活分别为73.54%和73.63%;(4)浓度为2.5 mmol/L的Ca~(2+)、Fe~(3+)和Zn~(2+)可使酶活升高11.48%～21.05%,对该酶有激活作用,Fe~(2+)和Cu~(2+)可使酶活性下降15.84%～18.28%,对酶活有抑制作用,K~+、Na~+、Mg~(2+)和Mn~(2+)对酶活无明显影响。     

产纤维素酶芽孢杆菌的诱变和酶学性质研究

为提高芽孢杆菌产纤维素酶的活性,以实验室保存的产纤维素酶枯草芽孢杆菌作为出发菌株,利用紫外线对其进行诱变处理,采用刚果红染色法初筛和3,5-二硝基水杨酸法进行复筛,并对其酶学性质进行初步研究.结果表明:诱变后突变株的纤维素酶活力较出发菌株提高4.476倍.该纤维素酶的最适pH为6.0,且在pH 5.0～7.0酶活力较稳定;该酶的最适酶促反应温度为60 ℃,在无底物保护且水浴30 min的条件下,酶活力在30～65 ℃保持稳定;此外,金属离子K+和Ba2+对酶活力有激活作用,相对酶活分别为108.11％和105.43％,而金属离子Ca2+和Cu2+对酶活性有抑制作用,二者的相对酶活分别为93.80％和89.08 ％.     

芽孢杆菌中性植酸酶基因的原核表达及酶学性质分析

植酸酶作为饲料添加剂能够有效提高动物对饲料中磷的利用率及减少粪便中磷排放对环境的污染,并降低植酸的抗营养作用。为了获得性能稳定的高活性植酸酶,采用PCR扩增芽孢杆菌(Bacillus sp.)中性植酸酶基因phyC(GenBank登录号:FJ986327)的成熟肽编码序列,将其克隆进原核表达载体pET-28a(+),并转化E.coli BL21(DE3)进行表达。在37℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导4 h能够获得大量包涵体蛋白,在25℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导6 h有利于可溶性蛋白的获得。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组植酸酶产物,获得的中性植酸酶的部分酶学特性为:耐热性较好,最适反应温度55℃,在70℃处理10 min可保持20%以上的酶活性;耐酸、碱能力较强,最适pH 6.0～7.0,pH 5.5～9.0时能保持80%以上的酶活性,pH 5.0～10.0时处理60 min仍能保持70%以上的酶活性,在pH 2.0～4.0时能保持40%以上的酶活性。利用构建的切除芽孢杆菌中性植酸酶基因phyC信号肽编码序列的原核表达载体及优化的诱导表达条件,能够在大肠杆菌中高量表达性能稳定的芽孢杆菌中性植酸酶。     

不同植酸酶对植物性饲料中钙和磷体外透析率的影响

本试验旨在探讨中性、酸性及复合植酸酶对植物性饲料磷和钙体外透析率的影响，为实际生产中有效选择适宜的植酸酶提供参考依据。试验选取1种酸性植酸酶和1种中性植酸酶，并在此基础上配制复合植酸酶。其中，酸性植酸酶pH=2.5～5.5时，相对酶活保持在70％以上，中性植酸酶pH=4.0～6.0时，相对酶活保持在80％以上，两种复合植酸酶酸性、中性的配伍分别为1：1和2：1。在体外设定条件下，用透析袋法分剐测定豆粕、莱籽粕、花生饼、红高梁、养麦中磷和钙的体外透析率。结果表明：在设定的酶促反应条件下，添加植酸酶可提高豆粕、菜籽粕、花生饼、红高粱、荞麦中磷和钙的体外消化透析率。其中，酸性植酸酶对磷透析率的影响最大，而复合植酸酶2：1对钙透析率的影响最大。     

多种碱性蛋白酶酶学性质的比较研究

试验旨在探究不同碱性蛋白酶的酶学性质差异,评估多种碱性蛋白酶在不同条件下的酶活性。结果表明,酶D的最适反应温度为50℃,其余为60℃;酶D的耐热性最好;所有酶最适反应pH值均为10.5;酶活性均受到Cu2+的显著抑制,相对酶活低于30%;酶活受化学试剂影响较小;均对胰-胃蛋白酶耐受性较差,相对酶活低于14%;Km值在3.45～33.33之间,νmax值在0.05～1.75 g/min之间。研究表明,不同来源的碱性蛋白酶有不同的酶特性。     

温度对鲤鱼复合酶制剂中3种酶活性的影响

试验研究了温度对鲤鱼复合酶制剂中蛋白酶、淀粉酶和β-葡聚糖酶3种酶活性的影响。结果表明,蛋白酶、淀粉酶和β-葡聚糖酶的最适pH分别为3.0、6.0和5.0;粗酶液在4℃时放置72h,3种酶出现活性峰值;在4、25和40℃时保存10、20和30d,复合酶制剂中蛋白酶和淀粉酶的活性随温度的升高和保存时间的延长而降低,酶活损失率分别为1.91%~36.91%和5.17%~19.57%,酶活受温度的影响显著,受时间的影响不显著。相反,β-葡聚糖酶的活性随温度的升高和保存时间的延长而升高,酶活损失率为10.19%~48.46%,酶活受温度及时间的影响显著。在30d内,复合酶制剂中各种酶对低温的稳定性由强至弱依次为淀粉酶>蛋白酶>β-葡聚糖酶;在60、80、100和120℃时处理5、10和15min,蛋白酶和淀粉酶的最大活性分别出现在100和80℃,最大酶活分别为原酶活的78.95%~82.99%和85.72%~91.89%;β-葡聚糖酶的活性随温度的升高和处理时间的延长而降低,最大酶活分别为原酶活的82.45%~90.73%,酶活受温度的影响显著,受时间的影响不显著。在15min内,复合酶制剂中各种酶耐干热高温的稳定性由强至弱依次为淀粉酶>β-葡聚糖酶>蛋白酶。