黏虫保幼激素结合蛋白基因MsJHBP3生物学功能及对黏虫生长发育的影响

保幼激素结合蛋白（juvenile hormone binding protein,JHBP）是一类载体蛋白,与保幼激素（juvenile hormone,JH）结合形成复合体后将保幼激素运送到靶器官处调控昆虫的生长发育。本试验在黏虫Mythimna separata转录组中获得7条保幼激素结合蛋白基因,筛选获得一条经保幼激素诱导后高表达的保幼激素结合蛋白MsJHBP3(GenBank登录号：MZ577068),c DNA全长为839bp,开放读码框长度729bp,编码242个氨基酸,氨基酸等电点为5.35,分子量为27.02kDa。不同发育阶段研究表明,Ms JHBP3在蛹期表达量最高,2龄表达量最低。RNA干扰处理4龄幼虫后6 h基因抑制效率最好,达79.72%。干扰后虫体内保幼激素含量为对照的1.14倍;羽化率和化蛹率均较对照组显著降低,羽化率下降7.42%,化蛹率下降3.75%;Ms JHBP3干扰后转录组测序数据分析共获得212个差异基因,其中105个上调基因,107个下调基因,其中保幼激素甲基转移酶基因、保幼激素环氧水解酶基因、保幼激素酯酶基因均上调。本研究表明MsJHBP...     

七星瓢虫保幼激素环氧水解酶基因克隆及表达分析

保幼激素(juvenile hormone, JH)可以调控昆虫滞育,保幼激素环氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)是调节保幼激素代谢的关键酶之一。为探索JHEH在七星瓢虫Coccinella septempunctata L.滞育中的调控作用,利用RT-PCR和RACE技术克隆获得七星瓢虫JHEH全长基因,命名为Csjheh(GenBank登录号:MH932586),该基因cDNA全长2 077 bp,开放阅读框(ORF)1 380 bp,编码459个氨基酸,预测蛋白质分子量为51.39 kD,理论等电点(pI)为8.79。疏水性分析结果显示该基因具有典型环氧水解酶的N末端疏水结构。氨基酸序列比对结果表明,Csjheh与中欧山松大小蠹、赤拟谷盗、丽蝇蛹集金小蜂、内华达古白蚁保幼激素环氧水解酶同源性达到64.24%。利用实时荧光定量PCR技术研究其时空表达模式,结果表明Csjheh基因在七星瓢虫成虫初羽化阶段表达量较高,滞育诱导条件下表达量呈先下降后上升的趋势,滞育60 d时与初羽化阶段接近。本研究结果对揭示JHEH参与JH的调控作用,进而调控昆虫滞育提供了理论参考。     

黏虫咽侧体抑制神经肽基因克隆与成虫期表达模式分析

为明确黏虫咽侧体抑制神经肽基因(allatostatin,AST)在调控黏虫Mythimna separata(Walker)保幼激素(juvenile hormone,JH)中的功能,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得的黏虫AST基因cDNA全长序列902bp,开放阅读框378bp,编码125个氨基酸。蛋白分子量为14.33kD,等电点为9.25,具有C型AST典型的PISCF序列。进化树分析表明,黏虫AST氨基酸序列与一点黏虫、草地贪夜蛾、棉铃虫氨基酸序列相似性高达80%以上。实时荧光定量PCR结果表明AST在成虫期的表达有明显组织和时间特异性。AST在飞行肌中表达量最高,头部其次,卵巢最低;黏虫头部AST表达量在7日龄最高,飞行肌中AST基因的表达量在1日龄最高。本研究对进一步揭示黏虫AST基因对JH调控作用,明确黏虫JH调控迁飞和生殖的相关的分子调控机制具有重要意义。     

Met基因在黏虫生殖中的功能分析

保幼激素(juvenile hormone, JH)是由咽侧体分泌的倍半萜类化合物,可以调控昆虫的很多生理过程,如发育、变态、生殖等。作为bHLH-PAS(helix-loop-helix-Per-ARNT-Sim)转录因子家族成员之一的methoprene-tolerant (Met)是JH的受体,在JH的信号传导过程中有非常重要的作用。本研究通过实时荧光定量PCR结合RNAi技术测定了沉默Met基因后黏虫Mythimna separata的Vg基因表达、卵巢发育和生殖行为,旨在探究Met基因在黏虫生殖过程中的功能。结果表明当Met基因沉默后,与卵巢发育密切相关的卵黄原蛋白(vitellogenin, Vg)基因表达量下调了50%,从而显著抑制了卵巢发育,并导致产卵显著延迟、产卵历期显著缩短,产卵量显著下降。结果表明Met基因是黏虫生殖发育过程中的关键受体基因,它通过调节后续Vg的表达和沉积,来达到控制卵巢发育,从而调控生殖作用。     

黏虫几丁质酶MsCHT7基因的克隆、表达及蜕皮激素的调控

几丁质酶是几丁质水解的关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用。本试验通过高通量转录组测序获得黏虫几丁质酶基因cDNA序列MsCHT7（GenBank登录号MG551526）。cDNA全长3360 bp,包含一个长度为2970 bp的开放阅读框,编码989个氨基酸,具有1个糖苷水解酶18家族高度保守序列,2个Glyco_18催化结构域和1个几丁质结合结构域ChtBD2。通过基因表达水平研究发现,黏虫MsCHT7基因在不同发育阶段和不同组织中均有表达,且具有差异性。预蛹期和表皮MsCHT7基因表达量最大,蛹期最后1 d和成虫表达量较高,且幼虫各龄期最后1 d表达量均高于第1 d表达量。20E（20-羟基蜕皮酮）处理幼虫后,不同时间点MsCHT7基因表达量存在显著差异,在1～24 h基因表达量随时间逐渐升高,24 h时最高,之后表达量迅速降低。4种不同浓度20E处理后,MsCHT7基因表达量存在一定差异,当浓度为10 μg/μL时,MsCHT7基因表达量最大。通过生物学观察发现,不同浓度20E处理后5龄幼虫蜕皮时间均提前。由于MsCHT7基因表达量受蜕皮激素调控,MsCHT7可能在黏虫蜕皮过程中发挥一定作用。     

禾谷缢管蚜体内保幼激素的变化趋势

为明确禾谷缢管蚜Rjopalosiphum padi 不同发育阶段体内保幼激素(ju-venile hormone,JH)的变化趋势,借助高效液相色谱(HPLC),确定了蚜虫JH测试方法,并对其JH进行了测定.结果表明:在若蚜阶段存在三种JH即JHⅠ、JHⅡ和JHⅢ;在成蚜阶段只能检测到JHⅢ.在整个发育过程中,JH变化趋势为虫龄越高,JH滴度越低,无翅3、4龄若蚜体内三种JH均极显著高于同期有翅若蚜.母代翅型对子代不同龄期若蚜JH滴度有明显影响.无翅成蚜后代1龄JH滴度极显著高于同期有翅成蚜的后代;2龄时,有翅成蚜的后代JH滴度骤然上升;有翅成蚜后代在2、3龄时JH滴度极显著高于同期无翅成蚜的后代.2龄之前是两种翅型母代的后代滴度变化的转折点,表明1～2龄若蚜期是禾谷缢管蚜翅型分化的关键时期和JH影响翅型分化的敏感龄期.     

RNAi沉默HvFTZ-F1对茄二十八星瓢虫幼虫存活及发育的影响

茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata是茄科植物上的一种重要害虫,对我国的作物生产造成了严重的经济损失。RNAi（RNA inteference）被认为是防控这种害虫的一种新策略。FTZ-F1是昆虫生长发育过程中重要的调控基因。本研究通过饲喂茄二十八星瓢虫1龄幼虫5 ng/μL dsHvFTZ-F1处理过的茄子叶片,发现幼虫中HvFTZ-F1表达水平显著降低了63.69%,抑制1龄幼虫蜕皮进入2龄,致死率高达65.00%。同时,沉默HvFTZ-F1使得20E相关基因（HvDIB、HvSPOOK、HvSHADOW、HvSHADE、HvE75）表达水平分别降低了85.36%、66.32%、52.74%、31.12%和20.76%;色素沉积相关基因（HvDDC、HvTH、Hvebony）表达水平分别降低了88.74%、91.97%、86.15%;20E滴度和多巴胺滴度分别降低了15.97%和21.38%。综上,HvFTZ-F1在茄二十八星瓢虫的存活和生长发育中起重要作用。HvFTZ-F1可作为一种高效靶标基因用于开发基于RNAi技术的RNA生物农药,用于茄二十八星瓢虫的生物防治。     

沉默蜕皮激素受体对雌性中黑盲蝽生殖力的影响

中黑盲蝽Adelphocoris suturalis是一种重要的农业害虫,主要为害棉花、果树和牧草等作物。昆虫保幼激素(juvenile hormone, JH)与蜕皮激素(molting hormone, 20E)是调控昆虫生殖的主要因素。本研究运用基因克隆、基因沉默(RNAi)、实时荧光定量PCR(qPCR)等技术研究蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)、超气门蛋白(ultraspiracle protein, USP)在中黑盲蝽生殖调控中的作用。结果表明,中黑盲蝽EcR基因的ORF全长1 413 bp,编码470个氨基酸。预测蛋白质分子量为53.65 kD,pI值为7.79。中黑盲蝽USP基因ORF全长1 209 bp,编码402个氨基酸。预测蛋白质分子量为44.99 kD, pI值为7.94。与对照相比,注射dsEcR、dsUSP后6～18 d的中黑盲蝽体内EcR基因、USP基因在转录水平分别被显著抑制;卵巢的挂卵量分别仅有对照组的31.5%、86.6%;单雌产卵量减少36.0%～80.4%,显著低于对照。EcR和USP基因沉默后,产卵前期与对照相比无显...     

多杀菌素对小菜蛾体内多功能氧化酶和保幼激素酯酶活力的影响

采用生化分析方法,测定了不同浓度多杀菌素(spinosad)处理后小菜蛾体内多功能氧化酶(mixed-function oxidases/,MFO s)和保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase,JHE)的活性,分析了酶活性的变化动态。结果表明,小菜蛾体内MFO s和JHE活性变化趋势受多杀菌素浓度影响。用LC50浓度处理后其保幼激素滴度变化趋势与对照相似,用LC80浓度处理后保幼激素滴度降低,并且滴度高峰出现时间比对照有所提前。不同浓度多杀菌素对氧化酶O-脱甲基活力的影响具有时间效应,用LC20浓度处理后的活力曲线上升拐点出现在24h,LC50浓度处理的则出现在12h。除LC80浓度处理在36h时活力值高于对照外,多杀菌素各处理都能抑制氧化酶N-脱甲基活力。高剂量(LC50、LC80)作用后小菜蛾体内保幼激素降解率与氧化酶N-或O-脱甲基活力有相似的变化趋势。     

褐飞虱两个酚氧化酶原基因的特性及细菌诱导后的表达分析

为探讨褐飞虱Nilaparvata lugens（Stål）酚氧化酶原基因的发育表达模式及生物学功能,利用转录组数据和RACE方法获得两条褐飞虱酚氧化酶原基因NlPPO1（GenBank No.：ALE32751）和NlPPO2（GenBank No.：ALE32752）全长序列,褐飞虱NlPPO1全长为2316 bp,CDS编码区为2073 bp,编码690氨基酸;NlPPO2全长为2738 bp,CDS编码区为2100 bp,编码699氨基酸。通过实时荧光定量PCR方法检测NlPPO的发育表达模式及注射细菌诱导后NlPPO的表达量变化。发育表达模式结果显示,NlPPO1和NlPPO2在肠中都有较高的表达水平,而NlPPO1在表皮细胞表达量最低,NlPPO2在脂肪体表达量最低;在5龄幼虫阶段NlPPO1随时间增加表达量增加,NlPPO2表达量则维持相对较高水平;在成虫阶段NlPPO1表达量维持在较低水平,NlPPO2随时间增加表达量降低。注射大肠杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1表达量显著升高,NlPPO2表达量变化差异不显著;注射枯草芽胞杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1和NlPPO2表达量都显著升高。研究结果显示褐飞虱NlPPO1和NlPPO2的发育表达模式存在差异,对不同菌诱导免疫应答也存在差异,暗示二者具有不同的生物学功能。该结果为进一步探索酚氧化酶原在褐飞虱对病原菌的免疫响应机制奠定基础。     

黏虫CYP9A134基因的克隆及其解毒功能

昆虫体内的细胞色素P450酶系统在昆虫解毒过程中发挥着重要作用。本次试验通过转录组测序获得一条新的黏虫P450基因,经国际委员会命名为CYP9A134（登录号为MT990973）。该序列全长为1801 bp,开放序列长度为1596 bp,编码531个氨基酸,分子质量为61.42 kDa,等电点为4.90。在黏虫幼虫阶段用2.5%高效氯氟氰菊酯和20%氯虫苯甲酰胺诱导时该基因表达量会有不同程度上升,最高的可分别达对照组的2.6倍和6.5倍。RNA干扰后,该基因表达量最低下降了70%,以上2种杀虫剂LD30杀虫效果分别提高了13%和25%;在黏虫成虫阶段用20%氯虫苯甲酰胺LD30诱导时,该基因表达量最高可达7.8倍。RNA干扰后,该基因表达量最低下降了61%,LD30剂量的氯虫苯甲酰胺杀虫效果提高26%。结果表明,该基因可能在杀虫剂诱导的解毒代谢过程中发挥重要作用。     

三株球孢白僵菌的分离鉴定与其对粘虫的室内毒力

通过黄粉虫虫饵法从河北省采集的土样中分离得到三株昆虫病原真菌,结合形态学特征和rDNA序列分析对菌株进行了鉴定,结果表明：三株均为球孢白僵菌Beauveria bassiana,编号依次为Z-G2-5、M-G4、M-G3。通过生测发现3株球孢白僵菌菌株均能有效感染粘虫幼虫,三株球孢白僵菌对粘虫3龄幼虫的毒力不同：在5×10⁸孢子/mL剂量下,菌株Z-G2-5第6 d时对粘虫的累计校正死亡率达到96.77%,LT₅₀为3.02 d,LC₅₀为4.95×10⁶个孢子/mL。而菌株M-G3、M-G4的累计死亡率分别为66.67%、71.11%;LT₅₀分别为4.89 d、3.97 d;LC₅₀分别为1.18×10⁸个孢子/mL、1.13×10⁷个孢子/mL。上述结果表明,相比其他两株菌,菌株Z-G2-5对粘虫的致病力更强,致死速度更快,具有较大的应用价值,可作为粘虫幼虫生物防治的候选菌株。     

三种猎物对蠋蝽生长发育和繁殖的影响

为比较黏虫幼虫、米蛾幼虫、柞蚕蛹3种替代猎物对于饲喂蠋蝽的营养适合性,在室内测定了3种猎物的营养组成以及蠋蝽取食3种猎物后的发育历期、体重、体长、繁殖力等生物学参数,为扩繁蠋蝽提供依据。结果表明,蠋蝽取食3种猎物均能正常完成世代发育。体重、体长、性比不受食物处理的影响。蠋蝽在取食黏虫和柞蚕蛹时,其发育历期、存活率、产卵量、卵孵化率等指标无显著差异。蠋蝽取食米蛾时,卵孵化至成虫的发育历期为29.88 d,明显长于取食黏虫和柞蚕蛹的蠋蝽,历期分别为25.57和26.15 d;世代单雌平均产卵量为231.44粒,显著低于取食黏虫与柞蚕的360.00和441.00粒;成虫获得率为23.78%,极显著低于取食黏虫与柞蚕的获得率60.00%和60.56%;然而雌、雄虫寿命均较取食黏虫与柞蚕有所延长。综上所述,黏虫幼虫可作为室内扩繁蠋蝽的猎物。     

粘虫过氧化物酶MsPOD基因的克隆及不同温度胁迫的诱导效应

过氧化物酶（POD）是昆虫体内一种很关键的抗氧化酶，在维持昆虫体内氧化还原的动态平衡及保护昆虫免受氧化损伤方面起到重要的作用。本试验通过转录组测序方法获得一条粘虫过氧化物酶基因的cDNA序列，该序列命名为MsPOD（GenBank登录号：MH606240）。该序列全长2433 bp，开放阅读框长度为2061 bp，编码686个氨基酸组成的多肽，分子量约76.1 ku，等电点5.68，具有1个标志性的动物亚铁血红素过氧化物酶细胞粘附蛋白结构域。氨基酸序列比对表明，MsPOD的氨基酸序列与鳞翅目夜蛾科其他昆虫亲缘关系较近，其中与棉铃虫POD氨基酸序列同源性最高，达92%。基因表达水平研究发现，MsPOD基因在不同发育阶段和不同组织中差异表达，在蛹期和唾腺中表达量最高。温度梯度诱导后，MsPOD基因在不同时间点的表达量具有显著差异，经35℃下12 h处理后表达量最高。研究结果为进一步研究过氧化物酶在昆虫体内的保护性作用以及利用该基因进行分子设计来防治粘虫奠定理论基础。     

爪哇根结线虫Mj-1-1基因的克隆、鉴定及RNAi表型分析

根据爪哇根结线虫食道腺内表达的EST序列,结合反式剪接序列SL1,从爪哇根结线虫中克隆了一个假定寄生基因Mj-1-1(KU358725),该基因的c DNA全长为573 bp,包含450 bp的开放阅读框(ORF),编码149个氨基酸。DNA全长为740 bp,包含2个内含子,长度分别为20 bp和111 bp。NCBI BLASTn比对表明,Mj-1-1与南方根结线虫的M.incognita zk1236.5(JQ284068)基因相似性最高,为97%。原位杂交表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫的背食道腺中表达,qRT-PCR结果表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫寄生性3龄幼虫阶段表达量最高。对爪哇根结线虫侵染前2龄幼虫的Mj-1-1基因进行沉默,调查发现,沉默Mj-1-1后,爪哇根结线虫对番茄的侵染力显著下降,表明Mj-1-1对爪哇根结线虫侵染和寄生具有重要的调控作用。     

根结线虫种群的线粒体DNA分析

 在同工酶和形态学鉴定的基础上,利用引物#C2F3和#1108对42个根结线虫种群线粒体DNA (mtDNA)中的COⅡ和LrRNA间区域进行特异性PCR扩增,35个种群的扩增产物约为1.7kb,其中29个是南方根结线虫,6个是爪哇根结线虫;3个花生根结线虫种群的扩增产物约为1.1kb;1个种群的扩增产物约为0.7kb,为根结线虫属在中国的新记录种;3个北方根结线虫种群的扩增产物约为0.5kb。用单条2龄幼虫提取物作模板得到的结果与大量提取DNA作模板的结果相同。为了区分产生相同大小片段的南方根结线虫和爪哇根结线虫,用限制性内切酶HinfⅠ对扩增产物进行酶切,结果表明:所有供试的南方根结线虫都可以被HinfⅠ酶切,且产生约1.3和0.4kb的2个限制性片段;但供试的爪哇根结线虫种群不能被酶切。由此表明,利用mtDNA PCR及酶切实验可以作为快速而准确地鉴定常见根结线虫的方法。     

寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因TlChi46的克隆

为进一步筛选高效寄生线虫真菌和阐明其寄生线虫卵的机理,本研究从湖北省烟草南方根结线虫雌虫分离到1株具高效生防潜力的菌株HBF1。形态学、rDNA-ITS和翻译延长因子tef1-α序列分析鉴定该菌为长梗木霉菌Trichoderma longibrachiatum,其对南方根结线虫卵第10 d寄生率为80.45%。通过简并引物设计和RACE技术克隆其几丁质酶基因,分析该基因序列及与其他几丁质酶的同源性。该菌是1株可以产生几丁质酶的南方根结线虫卵寄生真菌,第10 d几丁质酶的活性达到高峰,为24.88μmol/h/mL。本研究首次从长梗木霉HBF1菌株中克隆到1个几丁质酶基因TlChi46,该基因DNA全长1 793 bp,含3个内含子和1个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸,理论分子量45.9 kDa,等电点5.23。同源性比对表明和昆虫寄生菌几丁质酶的亲缘关系较远。从长梗木霉HBF1中克隆得到的几丁质酶基因编码的几丁质酶的功能域可供进一步研究,高效产几丁质酶并有效寄生南方根结线虫卵的长梗木霉对南方根结线虫具有良好的生防潜力。     

普通小麦-华山新麦草易位系H9015-17抗条锈病基因的标记定位

 采用我国当前流行的小麦条锈菌小种和重要致病类型, 在常温条件下对普通小麦-华山新麦草易位系H9015-17进行苗期抗条锈性鉴定, 并用当前主要流行小种CYR32对H9015-17与铭贤169的杂交后代及其双亲进行抗条锈性遗传分析, 以揭示H9015-17抗条锈性遗传基础。结果显示, H9015-17对小麦条锈菌小种CYR31、CYR32、CYR33和致病类型Su11-4、Su11-7、V26、Su11-11均有良好的抗病性, 对当前主要流行小种CYR32的抗病性由1对显性基因控制, 暂命名为YrHua1。 采用分子标记定位技术,筛选到5个与抗病基因YrHua1连锁的RGAP标记(M1、M2、M3、M4和M5)和1个SSR标记(Xgwm292),这些标记与抗病基因YrHua1的遗传距离分别为17.3、15.7、13.1、3.3、2.9和11.2,并将基因YrHua1定位在小麦染色体5DL上。研究结果将为分子标记辅助选择改良小麦抗条锈性提供宝贵的种质材料,建议在抗病育种加以利用。