七星瓢虫乙酰辅酶A羧化酶基因克隆及表达分析

乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)是脂肪酸合成第一步反应的限速酶,参与长链脂肪酸的合成。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,探究ACC在滞育七星瓢虫脂代谢中的调控作用。利用RT-PCR和RACE技术从七星瓢虫中克隆得到ACC基因全长,命名为CsACC(GenBank登录号:MT012819),该基因cDNA序列全长7 217 bp,开放阅读框(ORF)长为6 792 bp,编码2 263个氨基酸,预测蛋白质分子量为255.9 kDa,理论等电点(pI)为5.90,无跨膜螺旋结构,无信号肽。通过氨基酸多序列比对分析,结果显示CsACC与鞘翅目的赤拟谷盗Tribolium castaneum乙酰辅酶A羧化酶同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术检测CsACC基因在七星瓢虫正常发育及滞育诱导不同阶段的相对表达量,结果显示,滞育诱导30 d表达量达到最高,滞育诱导60 d、滞育解除期以及正常发育30 d表达量几乎持平。本研究为揭示CsACC基因在脂代谢通路中的调控作用提供理论依据。     

黏虫保幼激素环氧水解酶基因MsJHEH2的克隆与生物学功能

保幼激素环氧水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH）是调控保幼激素（juvenile hormone,JH）滴度的重要降解酶。本文在黏虫体内克隆得到一条具有EHN环氧水解酶超家族结构域的保幼激素环氧水解酶MsJHEH2基因cDNA序列（GenBank登录号：MT802192）,长度1533 bp,开放阅读框（ORF）为1389 bp,编码462个氨基酸,推测分子量和等电点分别为52.42 kDa和7.07。表达模式分析发现,MsJHEH2在黏虫各个龄期与组织中均有表达,其中在蛹期和中肠中表达量最高。RNA干扰处理4龄幼虫6 h后的基因沉默效率最高,为64.86%,此时黏虫体内JH滴度上升为对照的1.58倍。该基因沉默后对黏虫无明显致死作用,但导致其蛹历期延长、羽化率降低。本研究表明MsJHEH2可以通过调节JH含量进而影响黏虫生长发育进程。     

小麦播种期对麦蚜及七星瓢虫的影响

2010-2011年对不同播种期条件下麦蚜发生量及七星瓢虫种群动态进行了研究。结果表明,适期播种田七星瓢虫迁入早,经控制蚜虫基数小,蚜量增长缓慢;晚播田七星瓢虫迁入晚,蚜虫基数大,蚜量增长迅速。2011年七星瓢虫在当地麦田大规模发生,麦蚜在扬花期已被七星瓢虫有效控制。     

滞育七星瓢虫酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因的克隆及表达分析

去饱和酶（Fatty acid desaturase,FAD）是生物体不饱和脂肪酸合成中的关键酶,酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因是其中重要的一种。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,利用RT-PCR和RACE技术从滞育七星瓢虫中克隆得到酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因全长,并命名为CsFadΔ11（GenBank登录号：MF458996）,该基因全长1447 bp,开放阅读框（ORF）1095 bp,编码364个氨基酸,预测蛋白质分子量为42.99 kD,等电点（pI）为8.87,无信号肽。氨基酸序列分析结果表明,CsFadΔ11有3个组氨酸富集区和6个跨膜结构域,与膜翅目的内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术研究其时间表达模式,发现CsFadΔ11基因在七星瓢虫初羽化、滞育诱导10 d、滞育诱导20 d、滞育初期、滞育后期、滞育解除期以及正常发育状态下均有所表达,且在滞育早期表达量最高,其次是在滞育解除个体中。其整体表达趋势与相应时期脂积累变化情况基本相符,推测CsFadΔ11基因参与七星瓢虫脂积累调控,并进一步影响七星瓢虫滞育。     

紫外胁迫对棉铃虫成虫保幼激素的影响

采用高效液相色谱法,测定了紫外(Ultraviolet,UV)胁迫对棉铃虫体内保幼激素JHI、JHII和JHIII的影响。结果表明:棉铃虫体内JHI、JHII和JHIII的滴度均随着日龄的变化发生了显著的改变,与1日龄相比,CK、1h/d、5h/d组在2、3、4日龄时的JHI、JHII和JHIII滴度均升高,其中1h/d和5h/d组的JHI、JHII和JHIII滴度在2日龄时达到最高值,且达到显著水平,然后均随着日龄的增大逐渐下降,9h/d组JHI、JHII和JHIII滴度则随着日龄的增大显著降低;棉铃虫体内JHI、JHII和JHIII的滴度随着UV照射时间的延长均发生了显著的变化,当照射时间为5h/d和9h/d时,2～5日龄棉铃虫体内的JHI、JHII和JHIII滴度显著低于对照水平,不同日龄虫体内的JHI、JHII和JHIII滴度均在9h/d时达到最低;此外,日龄与UV照射的交互作用均达到显著水平。     

苹果酸脱氢酶与异柠檬酸脱氢酶在滞育七星瓢虫中的差异表达

为分析七星瓢虫滞育相关蛋白质的类别和功能,在滞育调控及滞育后生物学研究的基础上,应用双向电泳、质谱分析(ESI-QUAD-TOF)、生物信息学等蛋白质组学方法,对表达量存在2倍及以上差异且差异显著的蛋白点进行鉴定。应用Mascot软件进行数据库检索,根据数据的匹配程度鉴定蛋白质。所得蛋白质中,参与三羧酸循环的两种关键酶呈现差异性表达,其中苹果酸脱氢酶(gi|212508346)呈上调表达,异柠檬酸脱氢酶(gi|21392222)则呈下调表达。苹果酸脱氢酶的增加,推测与滞育状态下的生理需求相关:一方面与昆虫对NAD的合成和利用有关,另一方面或是七星瓢虫应对滞育环境条件的一种应激方式,与正常个体的代谢通路相比,滞育个体开启了另外的代谢通路以适应环境条件的改变。异柠檬酸脱氢酶作为三羧酸循环中起关键调节作用的限速酶,在滞育个体中下调表达,或反映了三羧酸循环整体速率的降低,表现在滞育七星瓢虫体内维持了低水平的能量代谢。本文的研究结果,为从蛋白质水平深入揭示七星瓢虫滞育调控及其机理提供一定的参考。     

异色瓢虫与七星瓢虫细胞色素P450、抗菌肽和溶菌酶基因的鉴定及表达分析

为探究异色瓢虫Harmonia axyridis环境竞争力的来源,以七星瓢虫Coccinella septempunctata为对照,采用同源比对法对两者细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）、抗菌肽和溶菌酶基因进行鉴定,并对差异表达基因进行分析和荧光定量PCR验证。结果显示,在异色瓢虫中共发现89个CYP450基因、25个抗菌肽基因和18个溶菌酶基因;在七星瓢虫中共发现127个CYP450基因、17个抗菌肽基因和9个溶菌酶基因。异色瓢虫编码抗菌肽和溶菌酶的基因较七星瓢虫存在明显的扩增,而CYP450基因的扩增少于七星瓢虫,表明抗菌肽家族在异色瓢虫环境竞争过程中有着更重要的作用;通过转录组的差异表达分析以及荧光定量PCR验证,发现大部分抗菌肽和溶菌酶基因在脂肪体中高表达,据此推测脂肪体为2种瓢虫抗菌肽等免疫因子的主要合成场所。     

黏虫保幼激素结合蛋白基因MsJHBP3生物学功能及对黏虫生长发育的影响

保幼激素结合蛋白（juvenile hormone binding protein,JHBP）是一类载体蛋白,与保幼激素（juvenile hormone,JH）结合形成复合体后将保幼激素运送到靶器官处调控昆虫的生长发育。本试验在黏虫Mythimna separata转录组中获得7条保幼激素结合蛋白基因,筛选获得一条经保幼激素诱导后高表达的保幼激素结合蛋白MsJHBP3(GenBank登录号：MZ577068),c DNA全长为839bp,开放读码框长度729bp,编码242个氨基酸,氨基酸等电点为5.35,分子量为27.02kDa。不同发育阶段研究表明,Ms JHBP3在蛹期表达量最高,2龄表达量最低。RNA干扰处理4龄幼虫后6 h基因抑制效率最好,达79.72%。干扰后虫体内保幼激素含量为对照的1.14倍;羽化率和化蛹率均较对照组显著降低,羽化率下降7.42%,化蛹率下降3.75%;Ms JHBP3干扰后转录组测序数据分析共获得212个差异基因,其中105个上调基因,107个下调基因,其中保幼激素甲基转移酶基因、保幼激素环氧水解酶基因、保幼激素酯酶基因均上调。本研究表明MsJHBP...     

龟纹瓢虫胰岛素信号通路AKT、MAPK、RPS6KB基因序列结构与时空表达模式分析

为明确龟纹瓢虫Propylea japonica胰岛素信号通路中AKT、MAPK和RPS6KB三个基因的序列结构和时空表达模式,基于龟纹瓢虫全基因组序列数据,选取AKT、MAPK和RPS6KB三个基因全长进行序列结构分析,蛋白序列结构分析发现其分别编码522、332和375个氨基酸。利用qRT-PCR检测其在龟纹瓢虫雌虫不同发育时期（羽化后1、3、5、7 d）、不同组织（头、胸、腹、肠）中的表达模式,结果显示AKT、MAPK和RPS6KB基因表达量均在龟纹瓢虫雌虫羽化第7 d显著上调,并达到最高水平;AKT在雌虫羽化第1 d和3 d高表达部位均为头部,第5 d和7 d高表达部位分别为肠道和胸部;MAPK基因在龟纹瓢虫雌虫羽化第1 d、3 d、5 d和7 d,头部表达水平均显著高于胸、腹和肠道;RPS6KB基因在其羽化后第1 d、3d、5d和7d,腹部表达水平均显著高于头、胸和肠道。AKT、MAPK、RPS6KB基因在龟纹瓢虫不同发育时期及不同组织中的表达量存在差异,为进一步研究胰岛素信号通路在龟纹瓢虫生殖发育中的作用奠定了基础。     

水稻热休克蛋白HSP70基因克隆、表达分析及原核表达

为明确水稻热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因在逆境胁迫下的表达特征,以日本晴粳稻水稻品种为材料,通过基因克隆方法获得水稻HSP70基因cDNA全长序列,并采用生物信息学的方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术测定不同水稻组织、不同激素、不同温度以及不同逆境下HSP70基因的相对表达量,同时对其原核表达条件进行优化。结果表明,水稻HSP70基因全长1 950 bp,预测蛋白大小为71.18 kD,等电点为5.10,亚细胞定位于细胞质内,有较强的亲水性。水稻HSP70蛋白序列与香蕉HSP70蛋白序列的亲缘性较高;水稻HSP70基因表达具有组织特异性,在茎中的相对表达量最高,在根中最低;低温胁迫后,水稻HSP70基因在12 h内基因相对表达量相对稳定,在24 h时相对表达量达到峰值,为9.60;高温胁迫后,在较短时间内水稻HSP70基因显著上调并达到峰值,为79.10;激素吲哚乙酸、脱落酸和油菜素内酯均能诱导水稻HSP70基因表达;但在甘露醇模拟干旱和NaCl盐胁迫处理下,水稻HSP70基因的相对表达量呈现先升后降的趋势。水稻HSP70蛋白的最佳诱导温度是30℃,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷最佳诱导浓度为1.2 mmol/L。     

七星瓢虫的抗药性选育及其生物学特性研究

为了明确七星瓢虫对吡虫啉的抗性发展动态,在室内选用吡虫啉逐代筛选,选育抗吡虫啉的七星瓢虫品系。发现七星瓢虫对吡虫啉的抗性整体呈上升趋势,但抗性不稳定,选育20代后抗性为63.1519倍。同时为了明确七星瓢虫对吡虫啉产生抗性后对其生物学特性的影响,将抗性选育13代的七星瓢虫品系与敏感七星瓢虫品系、野外七星瓢虫种群进行生物学特性的比较,结果表明,从幼虫的整个发育历期来观察,抗性品系幼虫的发育历期为12.36 d,野外种群为9.88 d,敏感品系为10.62 d,3者之间差异显著;蛹发育历期3者之间没有差异;4龄老熟幼虫、蛹、初羽化雌成虫、初羽化雄成虫平均体重3组间有一定的差异;七星瓢虫抗性品系、敏感品系、野外种群前期的卵孵化率分别为63.0%、62.4%和66.3%,中期的卵孵化率分别为64.8%、58.7%和75.6%,后期的卵孵化率分别为69.3%、57.4%和75.5%,3组之间无显著差异;抗性品系雌成虫的平均产卵量为1043.3粒,敏感品系为1100.2粒,野外种群雌成虫为1250.1粒,3者之间没有显著差异。综上所述,抗药性对七星瓢虫的生物适合度有一定程度的影响,但是,由于抗性倍数较低,影响尚不明显。     

七星瓢虫对苜蓿斑蚜捕食作用的研究

七星瓢虫(Coccinella septempunctata)捕食苜蓿斑蚜(Therioaphis trifolii)的数量与苜蓿斑蚜密度呈负加速曲线关系,功能反应符合Holling-Ⅱ型模型,为N_a=1.024 2N/(1+0.003 3N),捕食苜蓿斑蚜的数量随斑蚜密度增加而增大,但寻找效应随之而降低,日最大捕食量为313头。在10～25℃下,七星瓢虫捕食率y与温度x的关系为y=2.4 1x+3 0.0 7 5,在2 5～3 5℃间的捕食率y与温度x的关系为y=1 2 0-1.2x,2 5℃下七星瓢虫捕食率最高,捕食率达9 0.5%。在种内干扰条件下,其捕食作用率E随天敌密度P的增加而减少,干扰反应数学模型为E=0.4 1 9 3P^{-0.5 0 1 8}。随着叶片数量增多,七星瓢虫和斑蚜之间的距离相对增大,造成捕食率的下降。     

七星瓢虫对豆蚜的功能反应

［目的］测定七星瓢虫各虫态对豆蚜的捕食能力。［方法］将野外七星瓢虫(Coccinella septempunctata L.)采回并在室内饲养一代后,就其各龄幼虫及雌雄成虫对豆蚜(Aphis craccivora Koch)的捕食能力进行室内测定。［结果］ 七星瓢虫各龄期幼虫以及雌雄成虫对豆蚜的功能反应均属HollingⅡ型模型,1、2、3、4龄幼虫捕食反应拟合的圆盘方程分别为Na=1.121 86N/(1+0.059 92N)、Na=1.217 04N/(1+0.049 33N)、 Na=0.789 92N/〖JP2〗(1+0.008 00N)、Na=0.967 01N/(1+0.001 41N),雌、雄成虫的圆盘方程分别为Na=0.958 64N/(1+0.001 03N)、Na=0.976 20N/(1+0.001 52N),经χ2检验各虫态的捕食反应的圆盘方程理论值与实测值相符。用七星瓢虫雌成虫进行自身密度的干扰反应测定,利用Hassell模型进行拟合,所得模型方程为E=0.447 4P-0.433 7,经χ2检验雌成虫的捕食作用率实测值与理论值相符,该模型方程能很好地反映雌成虫自身密度的干扰程度。［结论］ 1～4龄幼虫、雄成虫和雌成虫对豆蚜的日最大捕食量分别为18.7、24.7、98.8、685.5、642.5、927.5头。     

七星瓢虫对草地贪夜蛾低龄幼虫的捕食能力评价

为了评估七星瓢虫Coccinella septempunctata对重大入侵害虫草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J.E.Smith）的防控效果,本试验在室内条件下开展了七星瓢虫对草地贪夜蛾1龄、2龄幼虫的捕食功能反应和种内干扰研究。结果表明：七星瓢虫对草地贪夜蛾幼虫的捕食功能反应均符合HollingⅡ模型,七星瓢虫对草地贪夜蛾1龄幼虫的日最大捕食量、瞬时攻击率和处理时间分别为233.100头、1.204和0.103 h;对草地贪夜蛾2龄幼虫的日最大捕食量、瞬时攻击率和处理时间分别为41.220头、1.075和0.582 h。七星瓢虫的搜寻效应随猎物密度的增加而逐渐降低。七星瓢虫对草地贪夜蛾的捕食作用受到较强的种内干扰。试验证明七星瓢虫对草地贪夜蛾具有较好的控害效果,可用于对草地贪夜蛾的防控实践。     

七星瓢虫和多异瓢虫对三叶草彩斑蚜的功能反应研究

研究了七星瓢虫和多异瓢虫在不同猎物密度下对三叶草彩斑蚜的功能反应,结果表明,七星瓢虫和多异瓢虫对三叶草彩斑蚜密度的功能反应可用HollingⅡ方程较好地拟合,经卡平方检验误差不显著（p>0.05）;捕食量在一定范围内随猎物密度的增加而增大;而七星瓢虫和多异瓢虫对三叶草彩斑蚜的捕食量随自身密度的增加而减少,相互之间存在一定的干扰,自身密度的功能反应能用Hassell数学模型较好地反映,经卡平方检验误差不显著（p>0.05）。     

七星瓢虫不同虫态的低温贮藏条件

为了探究七星瓢虫不同虫态的低温贮藏条件,本研究在不同恒定低温-时间与变温预处理后恒定低温-时间组合下分别测定了七星瓢虫卵、蛹及成虫的孵化率、羽化率及成虫存活率。结果表明,无论恒定低温或变温预处理,卵在常温下3 d均可孵化,恒温和变温的孵化率分别为72.56%和73.93%,且当保存时间不超过5 d时,卵在8℃、10℃及12℃时孵化率均在50%以上,保存时间为10 d时,卵在10℃及12℃时孵化率均在50%以上。七星瓢虫蛹在恒温和变温预处理条件下,在10℃保存3 d时均可完全羽化,且羽化率与对照组无显著差异,但当保存时间达到50 d,恒定温度在2℃、4℃、6℃和8℃下畸形率达到了100%,而其余保存天数下均未出现畸形率,当变温预处理后,仅在2℃下保存20、30和50 d分别出现100%、50%和100%的畸形率。在25℃保存时,恒温和低温预处理下的成虫保存40 d时,全部死亡,但恒温8℃下保存60 d和变温预处理10℃下保存60 d的成虫存活率分别达到60.46%和63.29%。综合分析表明,一定时间下的恒定低温和变温预处理保存均能延长七星瓢虫卵、蛹及成虫寿命,从而为七星瓢虫不同虫态商品化及其货架期的延长提供有效支持。