口蹄疫病毒3A、3B、3C基因克隆、表达及其抗体消长规律的研究

 成功克隆到O 型口蹄疫病毒（FMDV）太保毒株3ABC 基因片段中的3A、3B、3C基因，并将它们插入pGEX-4T-1 或24B11表达载体构建了重组表达质粒，经Western blotting 分析表明，表达的3A、3B蛋白可与FMDV阳性血清发生特异性反应，但表达的3C蛋白没有反应。以纯化的3A、3B表达蛋白为抗原建立间接ELISA，对4组背景清楚的试验牛血清进行检测，结果表明3A、3B表达蛋白与非免疫对照组（C组）和灭活疫苗反复免疫组（CI组）牛血清均不发生反应，与未免疫直接攻毒组（D组）和免疫后攻毒组（I组）牛血清均发生反应；D组和I组3A、3B表达蛋白抗体持续时间最长可达90 d以上，3A和3B表达蛋白最早检出相应抗体的时间分别为攻毒后第 5天和第10天。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB、3A基因的克隆与原核表达

以构建的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC质粒pGEM-T-3ABC为模板,设计了特异性的引物,进行RT-PCR扩增得到非结构蛋白3AB、3A基因,然后分别定向克隆到原核表达载体pET-28a、pET-41a载体上,将重组质粒转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,证明重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。     

O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表达与纯化鉴定

[目的]通过原核表达并纯化获得O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因及其多表位基因的重组蛋白,为建立O型FMDV抗体ELISA检测试剂盒及制备动物高免血清提供技术支持.[方法]以O型FMDV VP1全基因重组质粒pMD18-T-T-VP1及串联的ⅥP1多表位基因重组质粒pMD 18-T-O-VP1为模板,通过特异性引物扩增并回收目的基因,构建重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入大肠杆菌BL211 (DE3)中诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析鉴定.[结果]O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到正确表达,表达的两种融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯度较高,且均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性.[结论]表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发.     

O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其抗原性鉴定

为构建并表达O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的空衣壳蛋白的重组杆状病毒并鉴定其抗原性.以质粒pMD19-P12A3C为模板,扩增出编码O型FMDV衣壳蛋白前体P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因,插入至杆状病毒转移载体pFast-BacDual PH启动子下,构建出重组转移载体pFastBacDual-P12A3C,并转化DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,构建重组转座子Bacmid-P12A3C,将其转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C.增殖重组杆状病毒然后用其感染Sf9细胞,最后通过间接免疫荧光检测外源蛋白的表达.结果表明,表达产物能够被O型FMDV VP1多克隆抗体识别,并具有良好的反应原性,表明表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C构建成功.该研究为进一步研究O型FMDV空表壳的体外组装提供前期实验材料,并为后期研制出口蹄疫的基因工程亚单位疫苗奠定基础.     

A型口蹄疫病毒VP3基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT- PCR获得cDNA.并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS - PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化.结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料.     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

OM Ⅲ株口蹄疫病毒P1-2A-3C腺病毒载体的构建

选取O型口蹄疫病毒(FMDV)OMⅢ株的P1-2A和3C作为目的基因,分别扩增出目的片断后,定向亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,得到重组载体pAdTrack-P12A3C,重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后得到重组腺病毒质粒(pAd-P12A3C).将重组腺病毒质粒线性化后转染至HEK293细胞中可观察到典型的绿色荧光,从重组腺病毒的基因组中可扩增到P12A3C基因,证实获得了含有P12A3C的重组腺病毒.     

口蹄疫病毒3ABC、3AB、3BC基因克隆、表达及其抗体消长规律的研究

 成功克隆了FMDV太保毒株3ABC全基因片段,并将ABC、3AB、3BC片段插入pGEX-4T-1表达载体构建了重组表达质粒,经Western blotting 分析表明,表达的3ABC、3AB蛋白与FMDV阳性血清有反应性,表达的3BC蛋白反应性差。以纯化的3ABC、3AB表达蛋白为抗原建立间接ELISA方法,对背景清楚的试验牛血清进行检测。结果3ABC、3AB表达蛋白与空白对照组(C组)、灭活疫苗反复免疫组(CI组)和部分免疫后攻毒组(I组)牛血清均不发生反应,与未免疫直接攻毒组(D组)和部分I组血清均     

OMⅢ株口蹄疫病毒P1-2A-3C腺病毒载体的构建

选取O型口蹄疫病毒（FMDV）OMⅢ株的P1-2A和3C作为目的基因,分别扩增出目的片断后,定向亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,得到重组载体pAdTrack-P12A3C,重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后得到重组腺病毒质粒（pAd-P12A3C）。将重组腺病毒质粒线性化后转染至HEK293细胞中可观察到典型的绿色荧光,从重组腺病毒的基因组中可扩增到P12A3C基因,证实获得了含有P12A3C的重组腺病毒。     

口蹄疫病毒 VP1与3ABC 基因片段的克隆及表达

根据GenBank中注册的O型口蹄疫病毒(FMDV) VP1和3ABC 基因序列,设计了2对引物. 采用RT-PCR方法从FMDV分离株O/HK/2001扩增得到 VP1和3ABC 基因. 经对它们的核苷酸序列测序和同源性比较,显示与14株O型FMDV参考毒株中的O/HKN/2002同源性最高(分别为98.3%和98.6%),并且在 VP1决定各种亚型FMDV免疫原性的主要抗原决定族的144、148、154和208位     

A型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒载体的构建

采用体外连接法构建了含有A型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C或3ABC基因的重组腺病毒表达载体.利用PCR技术分别扩增得到P1-2A、3C和3ABC基因,经XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ双酶切之后,与XbaⅠ/KpnⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle2大片段连接,获得重组穿梭质粒pSh-P12a3c和pSh-P12a3abc.然后用I-CeuⅠ和PI-SceⅠ双酶切穿梭质粒回收目的基因表达盒,通过体外连接法将目的基因表达盒与BD Adeno-X Vi-rus DNA连接,转化DH5α感受态菌.获得两个重组腺病毒质粒分别命名为A-P12a3c和A-P12a3abc,经PCR、酶切及测序鉴定正确.用PacⅠ酶切后转染HEK293细胞,取转染细胞裂解液上清连续传至第5代时,在24~48 h内细胞完全病变.分别提取第3、7代病毒DNA,可扩增出目的基因,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且能稳定传代.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.     

通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装FMDV空衣壳结构

 【目的】口蹄疫病毒（FMDV）对酸很敏感,当pH值低于7时,二十面体对称的衣壳结构就会裂解成12S的五聚体。而昆虫细胞培养基的正常pH值在6.3左右,很难应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装天然的FMDV空衣壳结构。本研究旨在通过耐酸性改造,应用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中组装产生AsiaⅠ型FMDV空衣壳结构。【方法】应用定点突变技术改变VP3上的H140和H143为亮氨酸,以提高空衣壳对酸的耐受性。将改造和未改造的P12A基因和3C基因插入带双启动子的杆状病毒转移载体pFastBacTM Dual 中,通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒,转染Sf 9细胞,获得两株表达FMDV全衣壳蛋白的重组杆状病毒Bac mP12A3C和Bac P12A3C。重组杆状病毒经增殖后感染High FiveTM细胞,进行目的蛋白的表达。【结果】通过Western blotting检测表明目的基因均获得表达,且衣壳蛋白被3C蛋白酶成功地加工裂解。双抗体夹心ELISA和免疫荧光检测结果表明表达蛋白主要集中在细胞膜上,且具有很好的抗原性。通过电镜观察到P12A基因改造的重组杆状病毒在昆虫细胞内产生了直径为25～30 nm的空衣壳结构,而P12A基因未改造的重组杆状病毒观察到很多直径小得多的结构。【结论】本研究首次用电子显微镜在昆虫细胞中观察到FMDV完整的空衣壳结构,为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定

[目的] 研究口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定。[方法] 以含有FMDV 3ABC基因的质粒为模板,应用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因并进行序列测定,将3AB基因克隆至表达载体pET-28a（＋）,选取阳性克隆转化BL21感受态用IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-bolt检测分析。[结果] 经SDS-PAGE和Western-bolt分析表明,在大肠杆菌中成功表达了3AB蛋白,表达的目的蛋白能与FMDV阳性血清发生特异性反应。[结论] 该项研究为应用以重组FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫动物的鉴别诊断方法提供了依据。     

口蹄疫病毒非结构蛋白VPg1-2、VPg2-3、VPg3基因的克隆、表达及VPg1-2抗体持续时间的研究

【目的】表达口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）非结构蛋白VPg1-2、VPg2-3、VPg3，用于FMDV感染与灭活疫苗动物鉴别诊断和其蛋白功能研究。【方法】对O 型口蹄疫病毒太保毒株3ABC 基因片段中的 VPg1-2 (3B1-2)、VPg2-3 (3B2-3)、VPg3 (3B3)基因进行扩增和亚克隆，并将它们分别插入pGEX-4T-1 表达载体构建了重组表达质粒，经IPTG诱导后，进行Western blotting 分析。以纯化的VPg1-2表达蛋白为抗原建立间接ELISA，对背景清楚的实验牛血清进行检测。【结果】表达的VPg1-2、VPg2-3蛋白可与FMDV阳性血清发生特异性反应，表达的VPg3蛋白没有反应。VPg1-2表达蛋白与对照组（C组）和灭活疫苗反复免疫组（CI组）牛血清均不发生反应，与未免疫直接攻毒组（D组）血清均发生反应，与部分免疫后攻毒组（I组）（4/7）血清发生反应，与部分I组（3/7）血清不发生反应；D组和I组VPg1-2表达蛋白抗体持续时间最长可达90 d以上，最早检出相应抗体的时间为攻毒后第10天。【结论】表达的VPg1-2抗原用于健康牛群、免疫后未感染牛群以及未免疫感染牛群的鉴别诊断的特异性、敏感性达到100%，对免疫后感染牛群进行检测时可能有一定的漏检现象。     

液相阻断ELISA在口蹄疫病毒抗体水平检测中的应用

分别利用口蹄疫病毒Asia-I型和O型液相阻断ELISA方法,对健康猪、牛、羊血清,O型、Asia-I型免疫血清,以及人工感染Asia-I型FMDV的猪、羊血清和人工感染O型FMDV牛血清进行了抗体水平检测,同时利用3ABC-I-ELISA对液相阻断ELISA方法所选的部分阴性血清进行了验证试验.结果显示:利用Asia-I型和O型液相阻断ELISA方法筛选的阴性动物,在免疫和攻毒后,血清抗体水平显著升高,表明该法可完全用于口蹄疫阴性动物筛选及口蹄疫病毒抗体水平的检测.     

检测猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3AB经纯化后作为抗原,建立了3AB间接ELISA方法,该方法可用于判定被检动物是否感染了口蹄疫病毒.重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以兔抗猪IgG/HRP酶结合物作为第2抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法.用该方法检测了大量不同背景的猪血清,并与3ABC-I-ELISA检测结果进行比较.结果表明:3AB-I-ELISA和3ABC-I-ELISA的总符合率为98.9%,而且3AB-I-ELISA的特异性高于3ABC-I-ELISA.     

Asia I口蹄疫病毒组合基因P1-2A3C在不同家蚕品种中的表达

[目的]研究Asia I口蹄疫病毒组合基因P1-2A3C在不同家蚕品种中的表达,以期筛选出较适合表达该组合基因的家蚕品种。[方法]将已经获得高效表达的重组家蚕杆状病毒rBmNPV（P1-2A3C）基因,分别注射原种及杂交家蚕蚕蛹。利用ELISA方法对其进行抗原表达量检测,并对表达结果进行差异比较。[结果]不同家蚕品种对rBmNPV（P1-2A3C）的表达存在着明显差异;秋丰×TQ78和秋丰×丝胶茧杂交组合可考虑作为高效表达的家蚕生物反应器专用品种。[结论]为AsiaΙFMDV目的蛋白的高效表达专用品种的选育提供了依据。