假禾谷镰孢转录因子FpAPSES的鉴定与功能分析

【目的】假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）侵染小麦引起的小麦茎基腐病严重影响中国小麦的安全生产。查找假禾谷镰孢中的APSES转录因子,分析其在病原菌致病过程中的作用,为解析假禾谷镰孢的致病机制及小麦茎基腐病的防治提供理论依据。【方法】从GenBank获得物种中已知的APSES氨基酸序列,利用BLASTP方法在假禾谷镰孢中查找APSES同源蛋白,利用Pfam软件预测蛋白结构域,采用MEGA5.05构建APSES蛋白的系统进化树。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析A组APSES转录因子基因FpAPSES1和FpAPSES4在假禾谷镰孢侵染过程中的表达。通过PEG介导的原生质体转化和PCR筛选FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株。在PDA培养基上测定假禾谷镰孢野生型菌株Wz2-8A、Δfpapses1和Δfpapses4突变体菌株的菌丝形态和生长速率;测定在CMC培养液中培养后的分生孢子产生情况、形态以及在无菌水中的萌发率;利用菌丝块和分生孢子接种小麦胚芽鞘和大麦叶片以及盆栽试验测定其致病性;采用ELISA方法测定小米培养基中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的含量。【结果】假禾谷镰孢中有4个APSES同源蛋白,均含有保守的DNA结合结构域HTH。与其他物种的APSES蛋白构建系统进化树,发现FpAPSES1、FpAPSES2和FpAPSES4属于A组APSES,FpAPSES3分布在C组。FpAPSES1和FpAPSES4在侵染阶段诱导表达,推测可能参与假禾谷镰孢的致病。分别获得2个FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株Δfpapses1-T10、Δfpapses1-T27和Δfpapses4-T1、Δfpapses4-T2。表型测定结果显示,与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在PDA平板上的生长速率明显减慢、色素积累明显增多;FpAPSES1基因缺失突变体菌丝形态无差异,而FpAPSES4基因缺失突变体菌丝弯曲、分支明显增多;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在CMC液体中的分生孢子产生明显减少,分别比野生型下降了99.5%和97.4%,产生的分生孢子变短、隔膜减少、萌发率有所降低;与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体菌丝体和分生孢子对小麦胚芽鞘的致病力明显降低,菌丝在小麦胚芽鞘表皮细胞中的扩展明显受阻;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体对大麦叶片和小麦根部的致病力也明显降低;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在小米培养基中产生的DON毒素分别比野生型下降了约78%和44%。【结论】编码A组APSES同源蛋白的FpAPSES1和FpAPSES4对假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生和致病力均具有重要作用。     

苹果转录因子MdWRKY40b抗白粉病的机理

【目的】探究苹果白粉病相关基因MdWRKY40b调控苹果抗白粉病的机理,为苹果白粉病的抗性育种提供理论依据。【方法】以苹果品种‘嘎拉’叶片为材料提取总RNA,并以cDNA为模板克隆MdWRKY40b 552 bp特异性片段,采用Gateway技术将该基因片段的正反向序列构建入RNAi表达载体pB7GWIWG2(Ⅱ)中,然后利用农杆菌介导法对苹果叶片进行转化获得转基因植株,苹果叶片选用组培苗茎尖处幼嫩叶片;利用RT-qPCR技术对转基因植株中MdWRKY40b、超氧化物歧化酶基因（SOD）、过氧化氢酶基因（CAT）、过氧化物酶基因（POD）以及β-1,3-葡聚糖酶基因（β-1,3-glucanase）的表达量进行分析;进一步以1年生植株为材料,通过白粉病菌（Podosphaera leucotricha）接种试验,分析转基因植株对白粉病的抗病性;然后以接种白粉病菌后0、5、10、15、20 d的转基因植株及其对照植株叶片为材料,进行氯化硝基四氮唑蓝液（NBT）和二氨基联苯胺法（DAB）染色来分析病菌侵染期间植物材料中超氧阴离子和过氧化氢的积累量,进一步对病菌侵染期间植株中SOD、POD、CAT和β-1,3-葡聚糖酶等酶活性进行测定。【结果】经过PCR检测,确定获得3个MdWRKY40b基因沉默株系,分别为RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3;RT-qPCR结果显示3个转基因株系MdWRKY40b基因沉默效率分别为95.2%、92.2%、79.8%,转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的表达量相较野生型显著上调;人工接种白粉病菌后发现,与野生型植株相比,转基因植株叶片中的粉状病斑显著减少,超氧阴离子和过氧化氢的积累量显著降低,SOD、CAT、POD等调节植物超氧阴离子代谢的抗氧化酶以及抗病相关的β-1,3-葡聚糖酶的活性显著增强。【结论】MdWRKY40b的沉默使得苹果植株对白粉病的抗病性增强,推测转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的上调表达提高了苹果植株对白粉病的基础抗性,导致植物对超氧阴离子的清除能力增加,维持了植物体在响应病菌侵染过程中的低浓度超氧阴离子含量,从而减少高浓度超氧阴离子对植物的损伤。     

肌动蛋白结合蛋白FgAbp1参与禾谷镰孢生长、发育和毒素体形成

【目的】Abp1作为肌动蛋白结合蛋白家族成员之一,在各种真核生物肌动蛋白骨架形成过程中具有核心作用。本研究旨在分析禾谷镰孢（Fusarium graminearum）中肌动蛋白结合蛋白FgAbp1在生长发育、对新型杀菌剂氰烯菌酯敏感性以及毒素体形成等生物学过程中的功能。【方法】利用融合PCR和酵母空隙修复技术分别构建FgAbp1基因敲除打靶片段和融合荧光蛋白载体,再通过聚乙二醇介导的原生质体转化的方法获取基因缺失突变体ΔFgAbp1和荧光标记菌株。观察比较野生型PH-1、突变体ΔFgAbp1和回补体ΔFgAbp1-C的菌丝生长、有性生殖以及无性繁殖,并测定基因敲除突变体ΔFgAbp1对杀菌剂氰烯菌酯的敏感性。通过融合绿色荧光蛋白,明确FgAbp1在菌丝中的分布情况;利用透射电子显微镜观察分析FgAbp1对细胞中液泡/囊泡形态的影响。在非产毒环境和诱导产毒条件下,通过双荧光共定位分析FgAbp1在禾谷镰孢毒素体形成过程中的作用。【结果】禾谷镰孢中,FgAbp1主要呈颗粒状定位于近细胞膜处。在MM培养基中,基因敲除突变体ΔFgAbp1的生长速率与野生型相比降低了15%,但在营养丰富的CM中ΔFgAbp1的生长速率却减慢了38%。突变体ΔFgAbp1在无性繁殖以及有性生殖过程中相较野生型没有明显缺陷。然而在0.5 μg·mL^-1氰烯菌酯的作用下,ΔFgAbp1的菌丝生长完全受到抑制,并且分生孢子萌发率显著下降。此外,敲除基因FgAbp1导致细胞中液泡不能正常形成且囊泡增多。在非产毒条件下,FgAbp1与DON毒素合成关键酶Tri1共定位于囊泡中;在诱导产毒条件下,FgAbp1与Tri1则共定位于毒素体中。此外,敲除基因FgAbp1会导致毒素体不能正常形成。【结论】肌动蛋白结合蛋白FgAbp1在禾谷镰孢营养生长、发育、氰烯菌酯敏感性以及毒素体形成过程中发挥着重要作用。     

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp70的克隆及温度胁迫下的表达特性

【目的】热激蛋白（heat shock protein,HSP）是一种在生物体内广泛存在且高度保守的蛋白质,在生物抗逆过程中发挥重要作用。当生物体遭受不利环境条件胁迫时,其迅速产生可保证生物体的正常生理活动。本研究以重大检疫害虫马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）为研究对象,对其热激蛋白HSP70基因（Ld-hsp70）进行克隆,并对其在温度胁迫下的表达特性进行分析,明确HSP70在马铃薯甲虫温度胁迫中的作用。【方法】基于NCBI数据库检索筛选马铃薯甲虫HSP70的cDNA序列,利用RT-PCR和RACE技术对Ld-hsp70的全长cDNA进行克隆;利用DNAMAN软件对其全长序列进行拼接;采用生物信息学方法对Ld-hsp70及其编码氨基酸的序列特性进行分析;使用MEGAX软件的邻接法（neighbor-joining,NJ）构建马铃薯甲虫HSP70与其他昆虫HSP70的系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对Ld-hsp70在不同温度胁迫条件下的表达模式进行分析;利用Primer 5.0软件设计试验所用的特异性引物。【结果】基于NCBI数据库获得3类马铃薯甲虫HSP70 cDNA序列,分别命名为HSP70a、HSP70b和HSP70c,经克隆、拼接获得其全长序列,分别命名为Ld-hsp70a、Ld-hsp70b和Ld-hsp70c,GenBank登录号分别为KC544268、KC544269和KC544270。序列分析表明,3个Ld-hsp70编码的氨基酸序列均包含了完整保守结构域和3段保守的HSP70家族签名序列,且在氨基酸C末端具有保守的亚细胞定位基序。Ld-hsp70a和Ld-hsp70c的氨基酸C末端具有保守基序EEVD,属于胞质型热激蛋白;Ld-hsp70b的氨基酸C末端具有保守基序KDEL,属于内质网型热激蛋白。系统进化树分析显示,Ld-hsp70a和Ld-hsp70b与其他物种的HSP70分别聚为一支,Ld-hsp70c与已报道的马铃薯甲虫HSP70聚为一支。其中,Ld-hsp70a与龟纹瓢虫（Propylaea japonica）的Pj-hsp70,Ld-hsp70b与稻水象甲（Lissorhoptrus oryzophilus）的Lo-hsp70,Ld-hsp70c与大猿叶甲（Colaphellus bowringi）的Cb-hsp70同源性最高。qRT-PCR结果表明,高、低温均能诱导马铃薯甲虫雌、雄成虫的3个Ld-hsp70的表达。不同温度胁迫处理1 h后,马铃薯甲虫雌、雄成虫体内3个Ld-hsp70的相对表达量未见显著变化;而4 h后,马铃薯甲虫雌、雄成虫Ld-hsp70a的相对表达量与对照相比分别在低温-10℃和高温44℃时显著上调至2.24和2.41倍,Ld-hsp70b和Ld-hsp70c相对表达量在胁迫4 h后与对照相比差异均不显著。另外,无论是雌虫还是雄虫,3个Ld-hsp70的相对表达量在同一温度不同的胁迫处理时间之间均无显著差异。【结论】Ld-hsp70a可以响应高、低温胁迫,可能在马铃薯甲虫抵御温度胁迫中发挥作用,而Ld-hsp70b和Ld-hsp70c对高、低温均不敏感,表明马铃薯甲虫3个Ld-hsp70在抗温度胁迫中发挥不同的作用。     

新疆春小麦品种Pins基因等位变异及其对新疆拉面加工品质的影响

【目的】检测新疆春小麦品种Pins等位变异分布规律,分析不同Pins基因型春小麦品种籽粒硬度的差异,探讨Pins对春小麦品种主要品质性状和新疆拉面加工品质的影响,明确籽粒硬度影响新疆拉面加工品质的分子遗传基础及机理。【方法】以386份新疆春小麦品种资源为材料,用分子标记检测籽粒硬度Pins,测定品质性状（籽粒性状、磨粉品质、面粉品质、面团特性、淀粉糊化特性等）,制作新疆拉面并进行评鉴。【结果】Pins等位变异分布规律：在新疆春小麦品种资源中,Pina有2种等位变异,分别为Pina-D1a（占比86.79%）、Pina-D1b（13.21%）;Pinb有3种等位变异,分别为Pinb-D1a（64.77%）、Pinb-D1b（32.12%）和Pinb-D1p（3.11%）;Pina/Pinb有6种基因型组合,分别为Pina-D1a/Pinb-D1a（58.81%）、Pina-D1a/Pinb-D1b（25.39%）、Pina-D1a/Pinb-D1p（2.59%）、Pina-D1b/Pinb-D1a（5.96%）、Pina-D1b/Pinb-D1b（6.74%）和Pina-D1b/Pinb-D1p（0.52%）。Pins对春小麦品种品质性状的影响：Pina-D1a的籽粒蛋白含量、灰分含量、白度、湿面筋含量、Zeleny沉淀值均显著高于Pina-D1b;籽粒硬度、黄度（b^*值）、面筋指数、峰值时间、8分钟面积、稀懈值均显著低于Pina-D1b。与其他等位变异相比,Pinb-D1a的白度、湿面筋含量,Pinb-D1b的出粉率、黄度（b^*值）,Pinb-D1p的籽粒硬度、面筋指数均最高且达显著差异水平。与其他基因型组合相比,Pina-D1a/Pinb-D1a的白度,Pina-D1a/Pinb-D1p的籽粒硬度、面筋指数、8分钟面积,Pina-D1b/Pinb-D1b 的淀粉稀懈值,Pina-D1b/Pinb-D1p的籽粒蛋白含量、出粉率、面粉的湿面筋含量均最高且达显著差异水平。Pins对新疆拉面加工品质的影响：Pina-D1a的拉面手感、粘弹性、总分极显著低于Pina-D1b;Pina-D1b/Pinb-D1p的拉面手感最好,Pina-D1a/Pinb-D1p、Pina-D1b/Pinb-D1a和Pina-D1b/Pinb-D1b的粘弹性最高;Pina-D1b/Pinb-D1a、Pina-D1b/Pinb-D1b的总分最高。【结论】Pina突变会使新疆春小麦胚乳质地变硬、主要品质性状显著升高,促进新疆拉面的拉面手感和粘弹性等性状得到显著改善,最终促使新疆拉面的加工品质（总分）显著提升;Pinb变异对新疆拉面加工品质的影响不显著。Pina-D1b/Pinb-D1a、Pina-D1b/Pinb-D1b是优质新疆拉面小麦品种品质改良中重点选择的基因型组合类型。     

棉花黄萎病菌VdHP1的克隆及功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌（大丽轮枝菌Verticillium dahliae）中一个新基因（VdHP1）的功能,为解析棉花黄萎病菌的致病机制以及棉花黄萎病的防治提供依据。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdHP1全长进行克隆并测序;利用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分别对棉花根系诱导不同时间VdHP1的表达量及V592菌株不同组织中VdHP1的表达量进行测定;构建针对VdHP1的敲除载体、互补载体和过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdHP1基因敲除突变体、互补菌株和过表达菌株;以野生型菌株V592为对照,对VdHP1基因敲除突变体及互补菌株的菌落及菌丝形态进行观察,并对微菌核量、产孢量及致病力进行测定;通过RT-qPCR测定其他致病力相关的基因在VdHP1基因敲除突变体及过表达体菌株中的表达情况。【结果】VdHP1全长为862bp,预测编码蛋白含268个氨基酸,与GenBank中已注释的基因没有任何的序列相似性。野生型菌株V592受棉花根系诱导6—12 h时VdHP1表达水平显著上调,表明VdHP1在大丽轮枝菌侵染早期发挥作用。VdHP1在分生孢子中的表达量显著高于在菌丝和微菌核中的表达量,表明VdHP1在大丽轮枝菌不同组织中的表达具有差异性。与野生型菌株V592相比,VdHP1基因敲除突变体产孢量和产孢梗显著减少,菌丝分支呈螺旋状,对棉花的致病力明显下降。与侵染钉形成相关基因（VdCrz1、VdNoxB、VdPls1）、分泌蛋白释放相关基因（VdSep5）及分生孢子产生相关基因（Vdpf、VdSge1、VGB、VdPLP、VdCYC8、VdNLP1、VdNLP2）在VdHP1基因敲除体中的相对表达量显著下调,在过表达菌株中上调;而与黑色素合成相关基因（VdCmr1、VdSho1、VdLAC、VdPKS1）在VdHP1基因敲除突变体中则显著上调,在过表达菌株中下调。【结论】VdHP1与大丽轮枝菌分生孢子和产孢梗的产生有关,参与大丽轮枝菌致病;VdHP1对与侵染钉形成、分泌蛋白释放及分生孢子产生相关基因的表达具有正调控作用,对黑色素合成相关基因的表达具有负调控作用。     

中国水稻主产区白叶枯病菌致病型分析及近等基因系鉴别寄主的构建

【目的】分析中国不同稻区白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）致病型,建立近等基因系鉴别寄主,为白叶枯病菌群体结构田间实时准确监测、抗性品种应用以及抗病育种提供科学依据。【方法】利用中国鉴别寄主、IR24以及15个抗白叶枯病近等基因系等共21个鉴别寄主,采用人工剪叶接种方法,对2018—2021年采自广东、广西、海南、浙江、湖南、辽宁、云南共7个省（自治区）的954个单菌落分离菌株进行致病型测定,探明白叶枯病菌致病型种类、分布及毒性分化;基于测试菌株与15个近等基因系及IR24的抗感互作,应用主成分因子分析法,开展近等基因系与病菌互作的变量因子分析,构建白叶枯病菌致病型近等基因系鉴别寄主;基于抗病基因与测试菌株的抗感反应,分析抗病基因聚合效应。【结果】954个测试菌株在中国鉴别寄主上鉴定出11个致病型,包括SRRRR（I）、SSRRR（Ⅱ）、SSSRR（Ⅲ）、SSSSR（Ⅳ）、SSRRS（V）、SRSRR（Ⅵ）、SSSSS（Ⅸ）、SSSRS（新型1）、SRSRS（新型2）、SRSSS（新型3）以及SSRSS（新型4）,占测试菌株的比率分别为11.53％、4.82％、7.34％、6.18％、7.23％、1.05%、59.96％、1.57%、0.10%、0.10%、0.10%。Ⅸ型菌作为致病性最广的强毒菌系已上升为华南和长江中下游湖南和浙江稻区的优势致病型,西南稻区的云南以Ⅳ型菌为主,东北稻区的辽宁以I型菌为主。15个水稻抗白叶枯病近等基因系对954个菌株的抗感性分析结果表明,测试的15个近等基因系可分为5种类型,第Ⅰ类为高感基因系,包括IRBB1、IRBB2、IRBB10、IRBB11、IRBB4;第Ⅱ类为中感基因系,包括IRBB3、IRBB203、IRBB14;第Ⅲ类为中抗基因系,包括IRBB8、IRBB13;第Ⅳ类为抗病基因系,有IRBB21;第Ⅴ类为高抗基因系,包括IRBB5、IRBB7、CBB23、GDBB23;测试菌株中,出现可侵染抗病基因xa5的有42个、Xa7的有34个、Xa23的有31个。对以白叶枯病近等基因系为主的16个品种（系）与954个菌株组成的抗感互作变量数据矩阵进行因子分析,以解释总变量>85.0%为界,提取出8个主成分因子,组建了以近等基因系为主的10个品种(系)组成白叶枯病菌近等基因系鉴别寄主,按其对变量方差贡献大小,这些寄主分别为IRBB10（Xa10）、IRBB4（Xa4）、GDBB23（Xa23）、IRBB5（xa5）、IRBB7（Xa7）、IRBB21（Xa21）、IR24（Xa18）、IRBB13（xa13）、IRBB3（Xa3）、金刚30;新鉴别寄主可将954个测试菌株划分为55个致病型,对测试稻区的白叶枯病菌菌株表现出较好的鉴别力。基因聚合联合抗性分析表明,不同抗病基因聚合对病菌的抗性频率有一定的提升,不同抗病基因对测试菌株的抗性具有一定的互补性。【结论】监测稻区的白叶枯病菌系趋向多样化,毒性分化明显,强毒菌系Ⅸ型菌在部分稻区已上升为优势致病型,侵染xa5、Xa7及Xa23等广谱抗性基因的菌株有上升趋势;抗病基因聚合可拓宽品种对病原菌系的抗性谱,是培育广谱抗性品种的有效途径;近等基因系鉴别寄主的建立与应用可为白叶枯病发生流行的精准监测以及田间实时预警提供技术支撑。     

新疆小麦籽粒过氧化物酶(POD)活性检测及其基因等位变异检测

【目的】 研究新疆小麦品种(系)过氧化物酶活性高低并分析相关基因变异类型和分布,为新疆小麦育种和品质的遗传改良奠定基础。【方法】 分别利用TaPod-A1和TaPod-D1基因位点的显性互补功能标记TaPod-3A1/TaPod-3A2和TaPod-7D1/TaPod-7D6对113份新疆小麦品种(系)进行分子标记检测,结合新疆小麦材料POD活性的测定结果,分析POD活性相关基因不同等位变异对小麦籽粒POD活性的影响,验证TaPod-A1和TaPod-D1基因位点功能标记有效性的同时,对新疆小麦材料POD相关基因的等位变异分布频率进行分析。【结果】 新疆小麦品种(系)中,在TaPod-A1位点,具有TaPod-A1b基因型的小麦品种(系)POD活性(2 595.3 U/(g·min))极显著(P<0.01)高于具有TaPod-A1a基因型的材料(2 346.0 U/(g·min)),2种基因型的分布频率分别为36.3%和63.7%;在TaPod-D1位点,具有TaPod-D1b基因型的小麦品种(系)POD活性(2 503.9 U/(g·min))显著(P<0.05)高于具有TaPod-D1a基因型的材料(2 376.9 U/(g·min)),2种基因型的分布频率分别为46.9%和53.1%。在113份新疆小麦材料中,共检测到TaPod-A1a/TaPod-D1a、TaPod-A1a/TaPod-D1b、TaPod-A1b/TaPod-D1a和TaPod-A1b/TaPod-D1b 4种变异组合类型,在新疆小麦中的分布频率分别为31.9%、31.9%、21.2%和15.0%。TaPod-A1b/TaPod-D1b(2 706.2 U/(g·min))类型的POD活性显著(P<0.05)高于TaPod-A1a/TaPod-D1a(2 283.6 U/(g·min))。【结论】 新疆小麦品种(系)以TaPod-A1a(低POD活性)和TaPod-D1a(低POD活性)等位变异类型为主;TaPod-A1和TaPod-D1的功能标记均能较好的区分小麦籽粒POD活性的高低,将2个位点特异性标记结合起来使用,有效地筛选出高POD活性的材料,提高新疆小麦品种(系)优异等位变异的频率,促进新疆小麦品质的遗传改良。     

花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因AhNRT2.7a响应低氮胁迫的功能研究

【目的】 氮素在作物生产中对生物量和产量起关键作用。高亲和硝酸盐转运蛋白基因NRT2在植物响应低氮胁迫时被激活并具有维持氮吸收和转运的作用。通过筛选花生低氮耐受相关的NRT2基因并解析其生物学功能,为培育高氮素利用率的花生新品种提供理论参考,最终有助于实现节氮、高效的绿色生产目标。【方法】 检测正常氮浓度及1/20正常氮浓度（15 mmol·L^-1）条件下5个具有典型跨膜结构的花生NRT2基因（AhNRT2.4、AhNRT2.5b、AhNRT2.5c、AhNRT2.7a和AhNRT2.7b）的时空表达情况。以花育6309的cDNA为模板,对AhNRT2.7a进行克隆和生物信息学分析,并通过亚细胞定位确定AhNRT2.7a的表达部位。进一步构建异源过表达AhNRT2.7a的拟南芥株系,分别在正常以及低氮胁迫条件下测定其叶绿素含量、氮积累量以及谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酸脱氢酶（GDH）5个氮代谢关键酶的活性。【结果】 5个NRT2基因中有4个NRT2基因在花生响应低氮胁迫条件下大量表达。其中,AhNRT2.7a能够响应低氮胁迫,并在花生茎和叶中高表达。获得AhNRT2.7a的cDNA序列,全长为1 380 bp,编码459个氨基酸。蛋白结构分析显示其为具有12个典型跨膜结构域的膜蛋白。该氨基酸序列与栽培种花生（Arachis hypogaea L.）相似性高达99.56%,其次是野生亲本AA和BB基因组花生。亚细胞定位显示其主要定位于细胞质膜上。构建异源过表达AhNRT2.7a的转基因拟南芥植株,在不同供氮条件下,成熟叶和幼叶叶片的叶绿素相对含量均显著高于野生型拟南芥。同时,对上述5个氮代谢相关酶活性以及氮、磷、钾积累量测定显示,转基因植株中2个氮代谢相关酶（GS和NR）的酶活性以及氮积累量均比野生型拟南芥有显著升高。【结论】 花生中4个NRT2基因响应低氮胁迫,其中AhNRT2.7a能够提高植物氮代谢过程的氮素利用率。AhNRT2.7a的表达在促进氮代谢过程的同时,促使碳代谢作用的进一步加强。因此,AhNRT2.7a适合作为花生氮素高效利用为目的的候选基因。     

核蛋白H-NS调控多重耐药鸡大肠埃希菌IncFⅡ质粒接合转移的分子机制

【目的】以临床分离的多重耐药鸡大肠埃希菌IncFⅡ质粒为研究对象,探究核蛋白H-NS调控其接合转移的分子机制,为控制IncFⅡ质粒介导的多重耐药基因水平散播提供理论依据。【方法】测定大肠埃希菌ATCC25922及4株重组菌（pBAD25922、F25922、FΔhns和FΔhns/phns）的生长曲线,比较hns对菌株的影响情况;分别以F25922、FΔhns和FΔhns/phns为供体菌,大肠埃希菌J53（耐叠氮钠）为受体菌,进行接合试验,并计算接合频率;采用实时荧光定量PCR检测各重组菌（F25922、FΔhns和FΔhns/phns）中IncFⅡ质粒接合转移相关基因（traM、traJ和traY）的mRNA表达量;构建LacZ融合报告菌株F25922/P_M（P_J/P_Y）、FΔhns/P_M（P_J/P_Y）和FΔhns/phns/P_M（P_J/P_Y）,分别测定不同菌株中3种基因（traM、traJ和traY）启动子P_M、P_J和P_Y的β-半乳糖苷酶活性;构建H-NS蛋白原核表达载体,采用镍离子亲和层析法分离纯化H-NS核蛋白,PCR扩增并纯化3种基因启动子区的DNA序列,利用电泳迁移率变动分析试验（EMSA）探明核蛋白H-NS调控IncFⅡ质粒接合作用的调控方式,预测H-NS与不同启动子的结合位点并用EMSA进行进一步验证。【结果】重组菌F25922和pBAD25922与大肠埃希菌ATCC25922的生长状况无明显差异,说明质粒pBAD和IncFⅡ均不影响宿主菌大肠埃希菌ATCC25922的生长;但是,缺失重组菌FΔhns和缺失回补重组菌FΔhns/phns的生长速度明显低于大肠埃希菌ATCC25922,表明hns的缺失导致菌株的生长适应性变差,但不影响菌株的存活。接合试验结果显示,FΔhns中IncFⅡ质粒的接合频率较对照菌F25922升高了1 279.33倍（P<0.001）,而FΔhns/phns中IncFⅡ质粒的接合频率虽未完全恢复到对照菌株的水平,但也明显低于FΔhns。实时荧光定量PCR结果显示,FΔhns中tra基因（traM、traJ和traY）的mRNA表达量均极显著高于对照菌株（P<0.001）,其中traJ的mRNA表达量最高,为F25922的1 510.14倍,其次为traY和traM,表达量分别为F25922的448.14倍和81.54倍,而回补株FΔhns/phns中不同基因的mRNA表达量均极显著低于FΔhns,与对照菌相类似。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示,缺失报告菌株FΔhns/P_M（P_J/P_Y）中P_M、P_J和P_Y的β-半乳糖苷酶活性分别为5.66,10.45和21.91,均极显著高于对照菌F25922/P_M（P_J/P_Y）的相应启动子（P<0.001）,而回补报告菌株FΔhns/phns/P_M（P_J/P_Y）中P_M、P_J和P_Y的β-半乳糖苷酶活性极显著低于FΔhns/P_M（P_J/P_Y）,且均与对照菌株无明显差异。这些结果均表明hns对IncFⅡ质粒接合转移呈明显的负调控作用。EMSA结果显示,H-NS核蛋白均能明显阻滞3个tra基因启动子DNA的迁移,说明H-NS可直接与tra基因的3个启动子区结合;通过对结合位点的预测和EMSA进一步验证,证实H-NS核蛋白可与3个启动子区的AT富集区结合。【结论】H-NS核蛋白通过直接与IncFⅡ质粒的traM、traJ和traY的启动子区的AT富集区结合,抑制启动子活性,从而导致启动子下游相关转移基因traM、traJ和traY的表达量下降,结果明显抑制IncFⅡ质粒的接合转移。     

中华蜜蜂NPC2基因家族克隆及表达模式分析

【背景】 作为我国本土重要的资源昆虫,中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值,其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现,与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】 以中蜂NPC2家族基因为研究对象,克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异,为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】 基于中蜂高、低温转录组测序结果,利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列,进行系统进化树分析和三维结构预测,然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱,以及高、低温时的表达量变化。【结果】 获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长,分别为447、480、459和465 bp,编码148、159、152和154个氨基酸,预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD,等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近,与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示,AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高,其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期;AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高,在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达;AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达;AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后,4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升,但差异不显著。【结论】 AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构,其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性,其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达,表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升,表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性,或与初冬季访花行为有关。     

甘蓝型油菜苗期氮高效吸收转运特征研究

[目的]氮素吸收效率是影响作物氮效率的重要方面,开展油菜氮高效吸收转运特征研究旨在为提升油菜氮吸收效率及产量提供理论依据.[方法]为探究油菜氮高效吸收转运机理,以一对氮效率差异显著的油菜种质:氮高效种质'498'和氮低效种质'428'为试验材料,在营养液培养条件下,设置正常供氮(9.5mmol·L-1)和低氮(0.47...     

苹果蠹蛾几丁质脱乙酰基酶2的基因克隆、表达模式和分子特性

【目的】研究苹果蠹蛾（Cydia pomonella）几丁质脱乙酰基酶2（chitin deacetylase 2,CDA2）的分子特性和表达模式,为新型杀虫剂靶标筛选提供理论依据。【方法】基于苹果蠹蛾转录组和基因组数据,通过同源比对获得苹果蠹蛾CDA2的相关信息;新鉴定的CpCDA2a和CpCDA2b与其他昆虫中已鉴定的CDA2氨基酸序列进行多序列比对,并采用MEGA7软件邻接法（neighbor-joining,NJ）构建系统发育树;通过生物信息软件预测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体的蛋白功能域和三维结构并分析其差异,并通过在线软件对其分子量、等电点和亲/疏水性等蛋白理化性质及糖基化修饰位点等方面进行分析比较;采用荧光定量PCR检测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体在苹果蠹蛾不同发育时期及其幼虫不同组织的表达情况,以及注射蜕皮激素后其表达量的变化趋势。【结果】获得了苹果蠹蛾CDA2的两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b的全长CDS序列及其内含子和外显子位置信息;分析发现两个剪切体的蛋白序列均具有信号肽、几丁质结合域（ChBD）、低密度脂蛋白受体域（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化域（CDA）等功能域。多序列比对和聚类分析结果表明,不同昆虫间CDA2差异剪切类型非常类似,相同目昆虫的序列以较高的置信度聚为一支。三维结构模拟与比较发现两个剪切体的ChBD功能域在结构上存在较大差异;理化性质分析显示两个剪切体的亲/疏水性和糖基化位点也存在差异。不同发育时期表达量分析表明,CpCDA2a主要在幼虫期高表达,CpCDA2b主要在蛹的前期和中期高表达,而且在幼虫蜕皮前和蜕皮后CpCDA2a和CpCDA2b表达量均会显著上调;不同组织的表达量分析表明,CpCDA2a和CpCDA2b均在表皮中表达量最高,而CpCDA2b在头部的表达量也较高。对注射蜕皮激素后幼虫中CpCDA2a和CpCDA2b表达量分析显示,与对照相比在注射蜕皮激素后CpCDA2a的表达量在24 h和48 h均有所上调,但差异不显著,而CpCDA2b在24 h和48 h均显著上调。【结论】苹果蠹蛾CDA2的转录本存在两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b,根据对其分子特性、发育阶段和组织表达谱、以及注射蜕皮激素后表达动态等方面的综合分析,推测两者均参与苹果蠹蛾蜕皮和新表皮形成过程,但由于可变剪切的序列差异导致的蛋白结构和理化性质上的差异造成了两者在功能上的分化。     

羔羊STEC的耐药性、毒力基因和血清型分析

【目的】 研究新疆羊源STEC的耐药性和毒力情况,评价羊源STEC在羊产业链饲养阶段的风险。【方法】 从某规模化羊场随机采取2月龄羊的肛拭子样本,EC肉汤增菌后用MAC平板结合双重PCR(stx1,stx2)法分离鉴定STEC,用SMAC平板结合双重PCR(rfbE和fliC)法分离鉴定E. coli O157:H7;用K-B法做9类18种药的敏感试验,并用PCR检测相应的耐药基因;用PCR检测STEC的毒力基因(eae,ehxA,hlyA,stx1a,stx1c,stx1d,stx2a等),并检测是否“Top Six”和E. coli O157:H7血清型。【结果】 被检的21只羊中,9只携带STEC(42.86%),其中1只羊还携带E. coli O157:H7;药敏试验显示仅有2株菌对头孢吡肟具有耐药性,对其他药均敏感;所有分离菌均携带stx1毒力基因,其毒力基因亚型以stx1a(60%)与stx1c(80%)为主,9株STEC不属于“Top Six”或O157血清型。【结论】 该场羊源STEC的携带率较高,主要携带致病力较弱的stx1,有E. coli O157:H7,但是没有“Top Six”血清群;该场羊源STEC对目前的抗菌素普遍敏感,反映了其良好的养殖环境和较少的抗生素使用。     

山茶芽变花色与花青苷的关系

目的 研究山茶芽变花色与花青苷的关系,为山茶花色的芽变育种提供科学依据。方法 按照CIE L* a* b*表色系法测量山茶及其芽变品种的花色,利用高效液相色谱-光电二极管阵列检测（HPLC-DAD）和超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）联用技术定性定量分析其花瓣中花青苷成分与含量,运用多元线性回归方法研究花青苷与花色之间的关系。结果 山茶及其芽变品种花瓣中共检测到7种花青苷,分别是矢车菊素-3-O-β-半乳糖苷（Cy3Ga）、矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷（Cy3G）、矢车菊素-3-O-[6-O-(E)-咖啡酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaECaf）、矢车菊素-3-O-[6-O-(E)-咖啡酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GECaf）、矢车菊素-3-O-[6-O-(Z)-p-香豆酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GZpC）、矢车菊素-3-O-[6-O-(E)-p-香豆酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaEpC）和矢车菊素-3-O-[6-O-(E)-p-香豆酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GEpC）。山茶各系列芽变品种中,白色花瓣中均未检测到花青苷,红色花瓣中花青苷成分与粉色花瓣相同,但红色花瓣中各成分含量及花青苷总量均远高于粉色花瓣;红色和粉色花瓣中主要花青苷成分为Cy3G和Cy3GEpC;红色花瓣中Cy3G和Cy3Ga所占比例大于粉色花瓣,而Cy3GEpC等花青苷比例小于粉色花瓣。结论 山茶各系列芽变品种中各种花青苷含量及花青苷总量越大,花瓣红色越深;Cy3G、Cy3Ga和Cy3GEpC是决定山茶芽变花色的主要花青苷成分,其含量的积累增加花瓣红色程度。     

茶树咖啡碱合成酶基因稀有等位变异TCS1g的筛选、克隆及功能

【目的】茶树咖啡碱合成酶1（TCS1）是山茶属（Camellia）茶组植物咖啡碱合成的关键酶,TCS1具有丰富的等位变异。从我国丰富的茶树种质资源中发掘TCS1稀有等位变异并研究其功能,深入解析茶树咖啡碱合成机制,为低咖啡碱育种提供新的基因资源。【方法】利用特异引物TCS1P InDel F/R对673份茶树资源中的TCS1等位变异进行鉴定;使用引物TCS1cDNAF/R,从含有新稀有等位变异的茶树资源中克隆基因的cDNA全长序列;利用生物信息学、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和原核表达等方法研究新发现稀有等位基因的功能。【结果】在部分大理茶（C. taliensis）资源中鉴定到一个新的TCS1稀有等位变异,命名为TCS1g。从大理茶资源‘龙陵17’（LL17,含有的TCS1等位变异为TCS1a和TCS1g）中克隆了TCS1g。TCS1g的编码区序列全长为1 098 bp,编码365个氨基酸,编码蛋白的分子量和理论等电点分别为40.9 kD和5.1。序列比对结果表明,TCS1g与TCS1a、TCS1b、TCS1c、TCS1d、TCS1e、TCS1f的相似度在94.1%—99.2%;与具有可可碱合成酶活性（TS）的TCS1b和TCS1c编码蛋白序列相似度均大于96.7%,而与同时具有TS和咖啡碱合成酶（CS）活性的TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f相似度都小于95.4%,且TCS1g第221位氨基酸残基与TCS1b、TCS1c同为组氨酸（His）,而TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f为精氨酸（Arg）。第221位氨基酸残基位于TCS1g蛋白活性中心,该位点的突变（His突变为Arg）,可以导致TCS1g的等电点（5.05变为5.06）和亲水性（-0.119变为-0.123）发生改变。此外,5′上游调控区域的比对结果显示TCS1g、TCS1b、TCS1c起始密码子（ATG）比TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f延后了15 bp。原核表达发现TCS1g具有TS活性,活性为44.3 pkat/mg,但未检测到CS活性。qRT-PCR的结果表明LL17中等位变异TCS1g有表达。LL17的咖啡碱和可可碱的含量分别为40.3 mg·g ^-1和5.4 mg·g ^-1。 【结论】鉴定并克隆了一个新的TCS1稀有等位变异TCS1g,其在LL17中具有一定的表达水平,且其表达蛋白具有TS活性,而未检测到CS活性;推测决定TCS1g仅具有TS活性的关键位点是第221位氨基酸残基。