利用单碱基编辑器定点突变猪肌肉生长抑制素基因的研究

【目的】利用单碱基编辑器在宁乡花猪肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因第2外显子处引入终止密码子,以获得MSTN基因表达沉默的肾成纤维细胞系,为后期培育MSTN碱基编辑猪奠定基础。【方法】首先在MSTN基因的第2外显子处设计1条单向导RNA (single guide RNA,sgRNA),将其连接至pMLM3636-puro质粒,形成重组表达载体pMLM3636-puro-MSTN,与含有红色荧光碱基编辑器YE1-BE3-FNLS共转入宁乡花猪肾成纤维细胞中,在红色荧光和嘌呤霉素双筛选条件下,挑取单克隆细胞,测序验证后,分析阳性单克隆细胞的蛋白表达情况。【结果】在MSTN基因第2外显子处发生了碱基定点突变,目标位点的氨基酸序列由色氨酸(TGG)转变成终止密码子(TAA),且G→A突变率为5.5%。Western blotting检测结果表明,试验组10号单克隆细胞的MSTN蛋白表达量与野生型相比降低了60%。【结论】本研究运用单碱基编辑技术在宁乡花猪MSTN基因编码区引入终止密码子,使翻译提前终止,导致蛋白表达量显著降低,为后期MSTN基因碱基编辑猪的生产奠定基础。     

PRRSV清道夫受体CD163基因的真核表达和功能鉴定

从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中提取总RNA为模板,采用RT-PCR法获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的受体CD163全基因,将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-HIS A上,构建出真核重组质粒pcDNA3.1-CD163,经酶切和DNA测序证明获得了CD163基因,其序列与GenBank报道序列比较,核苷酸同源性为99.37%。将测序正确的CD163基因在脂质体LipofectamineTM2000介导下转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测到了CD163在PK-15中的表达。将转染的细胞感染PRRSV后,经IFA检测转染CD163的细胞能够被PRRSV感染。     

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163的HEK293细胞系的建立

为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。     

稳定转染CD151或CD163的Marc145细胞系的建立及其在PRRS疫苗生产中的应用

为了进一步探讨提高PRRSV感染靶细胞滴度的有效方法,本研究采用脂质体介导方法,通过G418筛选稳定转染Marc145细胞,并利用单个细胞克隆技术,获得了稳定超表达CD151蛋白和(或)CD163蛋白的Marc145细胞株,经免疫荧光化学和Western Blot鉴定证实,成功表达出基因重组猪CD151蛋白和CD163蛋白。在GMP生产车间将超表达CD151、CD163蛋白或CD151/CD163蛋白共表达的Marc145细胞感染PRRSV,使病毒感染滴度提高了10倍以上。将上述收获的病毒液制备了灭活苗,疫苗效力超过部颁标准。     

稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定

试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。     

猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建1株猪TRIM56基因敲除的PAM-KNU细胞系，并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)疫苗毒株中的应用。根据猪TRIM56基因组外显子区域设计合成2对特定的向导RNA引物，将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞，经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养；通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定，最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系，利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID₅₀)以及Western blot检测PRRSV增殖情况。结果显示，TRIM56敲除细胞系构建成功，该敲除细胞系中sTRIM56基因编码区第929～2 120位1 192个碱基缺失，未检测到sTRIM56...     

CRISPR/Cas9介导的猪IPEC-J2细胞CD13基因敲除细胞系的建立

旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的IPEC-J2(猪空肠上皮细胞系)细胞,揭示细胞表面分化抗原13(cluster of differentiation 13, CD13)在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用。本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计2个向导RNA(guide RNA, gRNA),命名为g3、g5,然后分别将g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP载体骨架上,电转染IPEC-J2细胞,48 h后通过流式细胞术分选具有双荧光标记的细胞,培养并获得单克隆细胞,PCR扩增、测序,从而获得CD13基因纯合敲除的阳性细胞系。对获得的20个细胞单克隆进行PCR,并挑取部分克隆PCR产物测序,发现共有7个克隆发生了基因片段缺失,其中1个克隆为单等位基因片段缺失,3个克隆为双等位基因杂合片段缺失,3个克隆为双等位基因纯合片段敲除。本研究检测双等位基因纯合片段敲除细胞的蛋白表达水平,其结果显示,在该纯合敲除细胞中CD13蛋白几乎不表达,表明成功构建了CD13敲除的IPEC-J2细胞系。本研究获得的CD13基因敲除细胞系为探究CD13在猪肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用奠定了基础。     

CD163片段在PRRSV感染过程中的作用

使用Scanprosite软件对猪肺泡巨噬细胞的CD163蛋白结构和功能域进行预测,并对其进行分段克隆,构建原核表达载体pET-28a(Y-P1,Y-P2,Y-P3),片段位置Y-P1(160~798bp),Y-P2(790~20 146bp),Y-P3(2 143~3 084bp)。利用镍柱纯化重组蛋白,免疫小鼠获得特异性抗体。通过病毒阻断试验,验证Y-P1,Y-P2,Y-P3的PRRSV阻断情况;构建真核表达载体pCD163,P1(1~798bp),P2(790~2 046bp),P3(2 023~3 345bp)分别转染PRRSV非易感细胞系BHK-21,验证其PRRSV感染情况。结果显示,经PCR、双酶切及测序鉴定构建的原核和真核表达载体是正确的,SDS-PAGE检验Y-P1,Y-P2,Y-P3蛋白大小分别为27 000,46 000,39 000。Y-P2蛋白,抗Y-P2的小鼠血清能够阻断PRRSV感染Marc-145细胞;转染pCD163的细胞系能够感染PRRSV,而P1,P2,P3片段不感染PRRSV。CD163其790~2 046bp可能是PRRSV感染细胞与CD163受体作用位点。     

苦参碱对感染PRRSV Marc-145细胞受体表达的影响

为探讨苦参碱在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染Marc-145细胞过程中的抗病毒机制。本研究建立感染PRRSV的Marc-145细胞模型,将试验分为4组:细胞对照组、病毒对照组、苦参碱对照组和苦参碱试验组,每组重复3次。PRRSV感染细胞3,6,12,24h后,收集细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测苦参碱对PRRSV N基因及其细胞受体CD163、Vimentin和CD151的影响。结果表明,在PRRSV感染24h内苦参碱显著降低PRRSV N基因的表达(P0.05)。与病毒对照组相比,在PRRSV感染6h时,苦参碱可显著降低CD163的表达量(P0.05);在PRRSV感染3,6h,苦参碱试验组Vimentin的表达量显著降低(P0.05);在PRRSV感染3,24h时,CD151的表达量显著低于病毒对照组(P0.05)。以上结果表明苦参碱在PRRSV感染Marc-145细胞的不同时间点可通过抑制细胞不同受体的表达来抑制PRRSV吸附和侵入宿主细胞,从而干扰PRRSV在细胞中的复制。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白7真核表达及亚细胞定位

【目的】对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)非结构蛋白7 (nonstructural protein 7,NSP7)进行真核表达及生物信息学分析,从而推测其在PRRSV复制过程中的功能。【方法】按照GenBank数据库中NSP7基因序列合成目的基因并构建真核表达载体P3×FLAG-CMV-NSP7,瞬时转染Marc-145细胞后通过Western blotting验证蛋白表达,通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)对NSP7蛋白进行亚细胞定位,利用生物信息学分析软件预测NSP7蛋白的理化性质、结构及功能。【结果】成功构建P3×FLAG-CMV-NSP7真核表达载体;Western blotting结果显示,获得大小约为2.7 ku的目的条带,证实重组载体在Marc-145细胞中高效表达。IFA结果证实在PRRSV感染初期NSP7蛋白大部分分布于细胞质中,随着感染时间延长NSP7蛋白由细胞质进入细胞核。生物信息学分析结...     

基于生物信息学探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒感染特征及银花甘草汤防治机制

【目的】基于生物信息学分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后的生物标志基因,并对银花甘草汤进行成分鉴定及网络药理学研究,探究银花甘草汤防治PRRSV的作用机制。【方法】通过高通量基因表达(GEO)数据库收集PRRSV感染不同组织或机体的转录组数据,利用GEO2R在线软件筛选差异表达基因,并通过STRING软件构建蛋白互作网络,使用CytoNAC软件筛选核心蛋白,利用GO功能与KEGG通路富集分析确定感染后核心蛋白信号通路及生物学功能变化;选用超高效液相色谱飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)分析并鉴定银花甘草汤组成成分,结合SwissTargetPredication数据库进行活性成分筛选及作用靶点预测,进一步通过网络药理学预测银花甘草汤对PRRSV感染的防治机制。【结果】GEO数据库的5组基因芯片共鉴定出4 476个PRRSV感染后的差异表达基因,蛋白互作分析共筛选出164个核心蛋白。PRRSV感染后的主要基因特征变化为非常规核糖体蛋白S27a(RPS27A)、泛素A-52残基核糖体蛋白融合产物1(UBA52)和RPS家族,生物学功能变化为生物合成工艺和核糖体结构等...     

猪CD163基因的单碱基编辑研究

旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C＞T的单碱基突变,形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止.利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点,并且C5后续的两个碱基为A A,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍.PCR扩增CD...     

碱基编辑器介导的猪IGF2基因高效定点突变

本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast cells,PFFs）中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2,IGF2）进行高效、精确的定点编辑。通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的IGF2基因序列进行鉴定,构建靶向巴马猪的sgRNA-IGF2表达载体,进而通过细胞转染、混合细胞编辑效率检测、单克隆细胞筛选及基因型鉴定等技术手段研究不同碱基编辑器对猪IGF2基因靶点的编辑效率及突变类型。结果显示,巴马猪和大白猪IGF2基因第3内含子存在第3 072 bp处的单核苷酸多态性（SNP）位点,设计靶向巴马猪IGF2基因的单链寡核苷酸序列。单链寡核苷酸经退火后与BsaⅠ线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行重组连接,构建sgRNA-IGF2表达质粒,重组质粒测序结果表明,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间。将rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器分别与sgRNA-IGF2表达质粒共转染至猪胎儿成纤维细胞中,对混合细胞编辑效率进行检测结果表明,对于IGF2基因靶点,hA3A-BE3系列碱基编辑器C到T的编辑效率显著高于rA1-BE3（P<0.05）。流式分选、单克隆细胞培养及鉴定结果表明,虽然有71.43%的hA3A-BE3单克隆细胞已被编辑,但有42.86%的细胞存在插入和缺失（indels）;hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F的编辑效率（56.86%和40.38%）虽低于hA3A-BE3（71.43%）,但是indels的效率也较低（31.37%和21.15%）。测序结果分析表明,利用碱基编辑器高效筛选到IGF2基因靶点纯合点突变的单克隆细胞。碱基编辑器作为新的基因编辑工具,可以对猪基因组中与经济性状关联的SNP位点进行高效、精确的基因修饰,为加速猪经济性状的遗传改良提供理论与实践基础。     

MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

【目的】 构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO)，研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)复制的影响。【方法】 根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】 试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】 本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的重组腺病毒的构建及其免疫原性分析

【目的】 利用腺病毒AdMax系统表达载体表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）,并研究其免疫原性。【方法】 参考GenBank中已公布的PRRSV N基因序列（登录号：KT945017.1）,人工合成PRRSV N基因,并将其连接至腺病毒穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建重组穿梭质粒pDC316-N。将重组穿梭质粒pDC316-N与AdMax腺病毒系统的骨架质粒PBHGLOX （delta） E1,3Cre共同转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-N,对获得的重组腺病毒液进行PCR和测序鉴定,用鉴定正确的rAd-N病毒液感染293A细胞,对该重组腺病毒进行扩大培养,检测病毒的TCID₅₀,并用RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的表达和反应原性。用重组腺病毒免疫小鼠,收集血清用PRRSV抗体检测试剂盒检测其抗体水平,初步评价其对小鼠的免疫效果。【结果】 PCR扩增出1条大小为400 bp的PRRSV N基因条带,测序结果正确,表明重组腺病毒构建成功,浓缩后测得其半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）为10^-10.239。RT-PCR和Western blotting检测结果证实目的基因在基因和蛋白水平上均可得到正确表达,蛋白分子质量约为14 ku。小鼠特异性抗体检测表明,重组腺病毒rAd-N免疫小鼠后可使小鼠快速产生PRRSV特异性抗体,与对照组差异显著（P<0.05）,其中重组腺病毒与Gel佐剂配合使用时效果最好,最高可达7.84 U/L。【结论】 本研究成功构建表达PRRSV N蛋白的重组腺病毒,其具有良好的免疫原性,为建立针对PRRSV抗体的间接ELISA检测方法和进一步研发PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系

试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因敲除的猪回肠上皮（immortal pig intestinal-2I,IPI-2I）细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体（pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5）共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞（片段敲除效率为15.5%）,其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。     

猪源CD163受体蛋白多克隆抗体的制备及其PRRSV阻断效力研究

为了制备猪源CD163受体蛋白鼠源多克隆抗体并检验其病毒阻断效力,采用RT-PCR方法扩增了猪肺泡巨噬细胞(PAM)CD163受体SRCR4-6功能区域片段,将其克隆至载体pET-32a中,并在大肠杆菌中表达重组CD163受体蛋白,纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂充分混合乳化;采用皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体,应用间接ELISA方法检测抗体含量,以病毒阻断试验和间接免疫荧光法验证其病毒阻断效力。结果显示:重组蛋白主要以包涵体的形式表达,相对分子量约为50 kDa,制备的CD163受体蛋白多克隆抗体含量较高,经2～8倍稀释后,抗体阻断PRRSV感染细胞的能力逐渐下降。研究表明,在大肠杆菌中成功表达了PRRSV重组CD163受体蛋白,制备的鼠源多克隆抗体具有较明显的阻断PRRSV感染细胞的效力。本研究为深入研究病毒的入侵机制和PRRSV的防控提供了试验基础和新的思路。     

猪CD151基因的克隆及过表达细胞系的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要感染猪肺泡巨噬细胞,但对猪源的其他细胞系不易感。本试验通过构建PK15-CD151和3D4/21-CD151过表达细胞系,为深入研究PRRSV感染宿主细胞的机制奠定基础。应用分子生物学方法、实时荧光定量PCR和荧光显微镜技术,对基因CD151在组织中的分布情况进行检测、基因克隆、真核表达载体的构建、对CD151在PK15和3D4/21细胞内的过表达情况,以及对细胞生长增殖的影响进行了研究。结果显示:CD151基因在不同组织内均有表达,但表达量有差异;PB真核表达载体构建成功,荧光显微镜下可见转染PB载体和CD151基因共转染的PK15和3D4/21细胞表达强烈的绿色荧光,实时荧光定量PCR分析结果进一步证实,CD151在转染后的细胞中获得超表达,并且对细胞的生长增殖无影响。本试验成功构建了PK15-CD151和3D4/21-CD151过表达细胞系,过表达细胞系的成功构建为进一步探索CD151在PRRSV感染细胞过程中的协同作用提供了细胞模型,特别是对深入研究PRRSV的入侵及宿主识别具有重要意义。     

DDX1影响猪流行性腹泻病毒复制的机制研究

【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX1基因序列(登录号：XM＿021087822.1),设计特异性引物PCR扩增DDX1基因全长并连接至pMD19-T克隆载体,双酶切鉴定成功后连接至pcDNA3.1表达载体;连接产物转化后筛选阳性菌落;培养IPI-2I细胞,取传代2次的细胞铺于6孔板内进行后续试验,将阳性菌落的重组质粒转染至6孔板培养24 h后收集蛋白质,Western blotting检测DDX1转染效率;以感染复数(MOI)为1.0的PEDV感染已转染pcDNA3.1-DDX1或PBS(对照)的IPI-2I细胞,建立PEDV感染细胞模型,PEDV感染12 h后分别收集细胞总蛋白质和RNA;间接免疫荧光试验检测细胞水平上PEDV N蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测PEDV N基因mRNA表达水平,Western blotting检测PEDV N蛋...     

干扰素诱导跨膜蛋白3基因敲除Caco2细胞株的构建及其对水泡性口炎病毒复制的影响

通过CRISPR/Cas9系统，旨在构建干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因敲除的人结直肠腺癌细胞Caco2,并探究IFITM3基因敲除对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响。针对人IFITM3基因靶向设计sgRNA,合成后连接至pLentiv2载体中获得重组质粒，经测序后将正确连接sgRNA的重组质粒及辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装并感染Caco2细胞，然后进行嘌呤霉素加压筛选，利用有限稀释法获取IFITM3基因敲除单克隆细胞。利用DNA测序和Western blot对所获得单细胞克隆进行鉴定，鉴定正确的细胞命名为Caco2-△IFITM3。用表达绿色荧光蛋白的VSV(VSV-EGFP)感染Caco2-△IFITM3细胞，通过荧光显微镜观察IFITM3敲除对VSV复制的影响。基因组DNA测序结果表明，在IFITM3基因开放阅读框产生了碱基缺失，细胞中IFITM3蛋白表达消失，但细胞活性未受明显影响。病毒感染试验可观察到Caco2-△IFITM3细胞感染比例显著高于Caco2细胞，表明敲除IFITM3使其抗病毒功能减弱。本研究通过CRISPR/Ca...