猪流行性腹泻病毒通过下调FBXW7拮抗宿主抗病毒天然免疫应答的研究

为研究E3泛素连接酶FBXW7与PEDV感染的相互调节作用,本研究采用PEDV感染Vero E6细胞后检测FBXW7蛋白表达水平,结果显示,PEDV感染能够抑制Vero E6细胞中FBXW7的表达水平。将pCAGGS-HAFBXW7转染Vero E6细胞,通过FBXW7过表达试验评价其对PEDV感染复制的影响,western blot检测分析结果显示,过表达FBXW7显著抑制PEDV N蛋白的表达,表明FBXW7对PEDV复制有抑制作用。进一步利用荧光定量PCR检测PEDV感染条件下过表达FBXW7对干扰素及干扰素刺激基因的影响,结果显示,与pCAGGS-HA对照组对比,pCAGGS-HA-FBXW7转染细胞IFN-β、ISG15、 ISG54和ISG56的转录水平均显著提高(p0.05),表明PEDV感染可通过下调FBXW7的表达拮抗宿主天然免疫应答促进其感染复制。本研究阐明了一种PEDV拮抗宿主天然免疫的新策略。     

Dermcidin促进猪流行性腹泻病毒复制的研究

猪流行性腹泻病(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性的猪胃肠道疾病，可导致哺乳仔猪产生急性水样腹泻，造成严重的经济损失。为调查抗菌肽Dermcidin(DCD)对PEDV复制的影响，本研究利用Western blot、荧光定量PCR(RT-qPCR)以及测定病毒半数组织细胞感染量TCID₅₀等方法，通过检测在DCD的作用下PEDV在细胞中的基因转录、蛋白表达和病毒滴度的水平，并利用Western blot检测信号通路中蛋白表达水平，探究其作用的分子机制。研究表明，DCD能够参与PEDV感染；DCD过表达促进了PEDV在Vero细胞和LLC-PK1细胞中的复制，而敲低DCD抑制了PEDV复制；DCD通过诱导PTEN表达来抑制Akt-mTOR-p70S6K通路相关蛋白位点的磷酸化，从而介导自噬促进PEDV复制。研究DCD对PEDV复制的作用机制，对今后PEDV防治工作有重要参考意义。     

细胞糖酵解对猪流行性腹泻病毒复制的影响

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染细胞后,细胞糖酵解的变化及其对PEDV复制的影响,本试验通过实时荧光定量PCR和Western blot检测PEDV感染猪小肠上皮细胞IPEC-J2后36 h糖酵解相关酶己糖激酶2(HK2)的表达水平,然后通过添加糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)来进一步验证细胞糖酵解对PEDV复制的影响,最后检测了正常浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)和高浓度葡萄糖(11.1 mmol/L和22.2 mmol/L)培养条件下PEDV复制情况来探究葡萄糖浓度对PEDV复制的影响。结果表明,PEDV感染显著增加糖酵解限速酶HK2的表达,PEDV感染可增强IPEC-J2细胞的糖酵解,细胞糖酵解水平增强有利于PEDV的复制。在一定范围内提高葡萄糖浓度可促进PEDV复制。研究结果为初步阐明PEDV感染机制以及冠状病毒病的综合防控提供了理论依据。     

猪Viperin蛋白对PEDV复制的影响

为了研究干扰素刺激基因Viperin对猪流行性腹泻病毒复制的影响,试验构建猪源Viperin基因的慢病毒表达载体,并进行慢病毒的包装和转导,对重组蛋白质进行Western-blot鉴定,同时研究过表达Viperin对PEDV感染的影响。结果表明:成功构建了猪Viperin基因的慢病毒表达载体,命名为pWPXL-Vip,且测序结果进一步表明Viperin基因被正确克隆。免疫荧光检测结果显示猪Viperin在Vero细胞质中表达。Western-blot结果显示在分子质量约75 ku处有1条特异性条带,Viperin在Vero细胞中正确表达。用PEDV感染稳定表达Viperin的Vero细胞,荧光定量PCR结果显示过表达Viperin能够提高病毒拷贝数。说明本试验成功构建了猪Viperin基因的慢病毒表达载体,且表达的Viperin蛋白能够促进PEDV复制。     

核苷二磷酸激酶B稳定表达细胞系的建立及其对新城疫病毒F48E9株复制的影响

为研究核苷二磷酸激酶B（nucleoside diphosphate kinase B,NDPK B）蛋白表达对新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV） F48E9株复制与增殖的影响,本试验将真核表达重组质粒pEGFP-NDPK B转染Vero细胞,经G418压力筛选出了阳性细胞单克隆,并通过RT-PCR、Western blotting和倒置荧光显微镜观察鉴定了NDPK B mRNA和蛋白质的表达,在细胞系基础上,通过HA-HI、TCID₅₀及实时荧光定量PCR检测NDPK B蛋白对NDV F48E9株复制和增殖的影响。结果表明,试验成功地构建了高表达NDPK B蛋白的Vero/NDPK B细胞系,并在此基础上,通过检测证明了NDPK B能抑制NDV F48E9株在Vero细胞中的复制与增殖,提示以NDPK B为基础有可能设计开发抗NDV的新药物或抗病毒增效剂,对NDV进行预防或治疗。     

4株猪流行性腹泻病毒的HA和HI试验

为观察猪流行性腹泻病毒(PDEV)的血凝特性,进而为建立PEDVHA和HI试验,评估疫苗免疫抗体水平奠定基础,将CV777、DR13、YN13和YN144共4株PEDV毒株,在37℃下,分别用0、5、10、50、100μg/mL胰蛋白酶处理30min,然后用鸡、兔和猪红细胞进行血凝(HA)试验;用已经鉴定为PEDV抗体阳性的血清和乳清分别进行血凝抑制(HI)试验。结果显示:4株PEDV毒株只与兔红细胞发生凝集反应;CV777、DR13毒株的HA现象需要用5μg/mL的胰蛋白酶进行预处理,但是YN13和YN144毒株的HA现象不需要胰蛋白酶作用;该凝集现象能够被PEDV抗体特异性抑制。结果表明,PEDV能够凝集兔的红细胞,不能凝集鸡和猪的红细胞,因而可以用兔红细胞建立PEDV的HA和HI试验方法。     

非洲绿猴FILIP1L真核表达质粒的构建及其抑制PEDV复制的研究

为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响，以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增出FILIP1L基因，克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因，通过免疫印迹和定量PCR检测FILIP1L蛋白的表达情况，并研究其抗病毒功能。结果：成功构建3×FLAG-CMV-10-FILIP1L重组质粒，转染后能够正常表达。PEDV感染Vero细胞后，FILIP1L基因的mRNA表达显著上调；过表达FILIP1L基因显著抑制PEDV的复制；下调FILIP1L的表达可显著促进PEDV的复制。综上，FILIP1L蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞的复制，研究结果为寻找新的抗PEDV药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。     

复方术芩提取液体外抗PEDV感染PK-15细胞的作用效果

为探讨复方术芩提取液体外抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染Vero细胞作用效果,以Vero细胞为宿主细胞,通过检测药物抗PEDV活性,计算其IC50和治疗指数TI,并从药物对PEDV的直接灭活作用、阻滞作用、吸附抑制、穿入抑制及复制抑制5个方面探讨复方术芩抗PEDV作用机理。结果显示复方术芩提取液能明显抑制PEDV的致病变作用,其IC50为17.41mg/L,TI为23.40。各浓度术芩提取液对PEDV病毒复制过程中均有一定的抑制作用,其中直接灭活作用和复制抑制试验效果比较明显,且质量浓度C=100mg/L,与病毒对照相比差异极显著(P<0.01),质量浓度C≥25mg/L,细胞保护率均超过50%。而阻滞试验、吸附抑制试验和穿入抑制试验,药物质量浓度需要达到100mg/L才出现显著的保护作用。表明复方术芩提取液在体外抗PEDV主要是通过对病毒的直接灭活和对病毒复制抑制而达到抗病毒功效。     

猪IFN-δ5的表达纯化及其抗PEDV感染的作用分析

【目的】试验旨在建立大量表达及纯化猪δ5干扰素(pIFN-δ5)的方法,并对其抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染的作用进行分析。【方法】根据GenBank中pIFN-δ5序列(登录号:NM_001164854.1)设计引物,以猪肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增;将目的基因连接入经EcoRⅤ和Hind Ⅲ双酶切的线性化pET-32a (+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化诱导表达条件,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;pIFN-δ5蛋白大量表达后使用镍离子亲和层析柱纯化,并测定蛋白纯度;采用细胞病变抑制法检测pIFN-δ5的干扰素效价,采用CCK8方法检测pIFN-δ5的细胞毒性,进一步测定其抗PEDV的感染能力。【结果】试验成功构建了重组表达质粒pET-pIFNδ5,经诱导条件摸索发现,在D_{600 nm}值为0.5~0.6、IPTG浓度为0.8 mmol/L、37 ℃诱导条件下,目的蛋白pIFN-δ5主要表达于菌体裂解上清中;经大量表达并纯化后可获得纯度＞95%的pIFN-δ5蛋白。使用VSV/MDCK细胞滴定系统检测pIFN-δ5的比活性为5×10⁴U/mg;CCK8检测表明pIFN-δ5的细胞毒性较小。实时荧光定量PCR、Western blotting和间接免疫荧光检测结果表明,pIFN-δ5具有显著抗PEDV感染能力。【结论】本试验建立了表达和纯化pIFN-δ5的方法,通过一系列的体外抗病毒试验证实pIFN-δ5具有良好的抗PEDV感染的活性,为将pIFN-δ5作为抗病毒药物及临床应用奠定了基础。     

DDX1影响猪流行性腹泻病毒复制的机制研究

【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX1基因序列(登录号：XM＿021087822.1),设计特异性引物PCR扩增DDX1基因全长并连接至pMD19-T克隆载体,双酶切鉴定成功后连接至pcDNA3.1表达载体;连接产物转化后筛选阳性菌落;培养IPI-2I细胞,取传代2次的细胞铺于6孔板内进行后续试验,将阳性菌落的重组质粒转染至6孔板培养24 h后收集蛋白质,Western blotting检测DDX1转染效率;以感染复数(MOI)为1.0的PEDV感染已转染pcDNA3.1-DDX1或PBS(对照)的IPI-2I细胞,建立PEDV感染细胞模型,PEDV感染12 h后分别收集细胞总蛋白质和RNA;间接免疫荧光试验检测细胞水平上PEDV N蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测PEDV N基因mRNA表达水平,Western blotting检测PEDV N蛋...     

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及S1基因序列分析

为了对疑似猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染病例进行确诊,并掌握致病原与其他流行毒株的基因差异性,试验采用病毒分离与细胞病变观察、PCR检测、中和试验、间接免疫荧光试验、S1基因序列分析等方法对该病例进行了研究。结果表明:临床病料接种Vero细胞盲传至18代后可产生典型的细胞病变,临床病料样品及各代次分离株病毒的PCR检测均为阳性,该毒株的TCID_(50)为1×10~(-6.61)/mL,该病毒可被PEDV阳性血清特异性中和,间接免疫荧光试验中可见明显的特异性绿色荧光,该病毒的S1基因核苷酸序列与GenBank中PEDV S1基因序列同源性在65.2%~100%之间,遗传进化关系中该病毒与近几年新分离株属于同一个大分支,与CV777等经典毒株亲缘关系较远。说明分离株病毒为国内近几年流行的新型PEDV。     

猪流行性腹泻病毒Nsp12与宿主RNF7蛋白相互作用的研究

猪流行性腹泻病毒(PEDV)编码的Nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用。为了研究与Nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-Nsp12与猪小肠绒毛上皮细胞(IECs)cDNA酵母表达文库进行杂交筛选,获得的阳性克隆经过测序鉴定证实为环指蛋白7(RNF7),将pGBKT7-Nsp12与p GADT7-RNF7进行酵母回复验证,结果显示二者共转化后能分解SD/-4/X/A中的X-α-Gal形成蓝色菌落,表明Nsp12与RNF7蛋白在酵母中存在相互作用。同时,构建p CAGGS-Nsp12-HA和p CAGGS-Flag-RNF7真核表达载体,利用针对不同标签的抗体进行正向和反向免疫共沉淀鉴定,进一步证实PEDV Nsp12蛋白与RNF7蛋白之间存在直接相互作用;激光共聚焦显微镜观察发现Nsp12蛋白和RNF7蛋白在细胞质中存在共定位现象。为了分析宿主细胞中RNF7蛋白异常表达对PEDV增殖的影响,将构建的RNF7真核表达质粒pcDNA3.1-RNF7转染LLC-PK1细胞后,再用PEDV感染过表达RNF7的LLC-PK1细胞,通过western blot检测LLC-PK1细胞中PEDV N蛋白表达量,荧光定量PCR检测PEDV N基因转录水平,采用TCID50方法检测病毒滴度,结果显示,过表达RNF7后LLCPK1细胞内PEDV N蛋白表达量和N基因拷贝数均下降,其子代病毒滴度也明显低于正常对照组,表明过表达RNF7蛋白可以抑制PEDV的增殖。而利用si RNA-178敲低宿主细胞内源性RNF7蛋白的表达,再以MOI 0.01的PEDV感染后,对感染后不同时间的细胞样品进行western blot检测和病毒滴度检测,结果显示在PEDV感染后24 h,细胞内PEDV N蛋白表达量明显增加,PEDV的滴度在感染后18 h和24 h时分别是对照组的1.10倍和1.17倍。本研究结果首次证实了宿主细胞中RNF7蛋白表达对PEDV的复制发挥负调控作用,为深入探究PEDV复制调控的分子机制奠定了基础。     

茯苓多糖对LPS诱导猫肾细胞炎症的保护作用研究

【目的】研究茯苓多糖(Poria cocos polysaccharide, PCP)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的猫肾细胞(crandell rees feline kidney, CRFK)炎症反应的保护作用及抗炎机制。【方法】通过MTT法检测不同浓度PCP(5、10、15、25、35、45μg/mL)和LPS(20、40、60、80、100、125、150μg/mL)对CRFK细胞活力的影响;用不同浓度PCP处理LPS诱导的CRFK炎症模型,观察PCP干预后的细胞形态变化,通过硝酸还原酶法和流式细胞术检测CRFK中一氧化氮(NO)释放和细胞凋亡情况;利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测细胞炎症和凋亡相关基因以及蛋白表达水平。【结果】5～25μg/mL PCP对CRFK无毒性,且可逆转LPS刺激后CRFK细胞形态变化。25μg/mL PCP可显著降低LPS刺激后CRFK内NO释放和细胞凋亡率(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,不同浓度PCP能够显著降低LPS诱导CRFK中IL-6、TNF-α、Caspase3...     

稳定表达IL-10的PK-15细胞的构建及其在PCV2增殖中的应用

【目的】 研究白细胞介素-10（IL-10）对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】 利用PCR技术扩增猪IL-10基因,将目的基因与慢病毒表达载体（pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro）进行连接,获得重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。用收集的慢病毒液感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到细胞株PK-15-IL-10,对照组细胞分别命名为PK-15-pCDH和PK-15。PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞株后,在24、48和72 h分别收集细胞液,利用CCK-8检测细胞活力。利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测IL-10基因的表达水平和PCV2的复制情况;利用间接免疫荧光试验（IFA）观察PCV2在细胞中的复制情况及测定PCV2的病毒滴度（TCID₅₀）。【结果】 试验成功构建了重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞后,48 h时细胞状态最好,荧光最强。分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清感染PK-15细胞,pCDH-CMV-IL-10组的荧光最强,将其在嘌呤霉素浓度为2.5 μg/mL的完全培养基中继续培养,获得仍有绿色荧光的稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blotting检测发现,IL-10基因在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显高于对照组PK-15-pCDH和PK-15,PCV2的拷贝数增加了4倍,复制能力增强,且将病毒稀释连续传3代后,PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞（P<0.01）。细胞增殖试验表明,猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响;IFA结果表明,PK-15-IL-10细胞中的荧光比PK-15细胞更强,PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID₅₀在感染后48 h极显著高于PK-15细胞（P<0.01）。【结论】 本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体,并利用其感染PK-15细胞,继续培养后筛选出过表达IL-10的PK-15-IL-10细胞株,用PCV2感染该细胞株能促进PCV2在PK-15细胞中的复制。本试验结果为后期疫苗研究提供了参考,为进一步研究IL-10对PCV2在PK-15细胞中复制的影响奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R²值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%～0.43%,组间变异系数为0.67%～0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。     

长链非编码RNA在PEDV感染Vero-E6细胞中对自噬的调控作用

【目的】 试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru，PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用，以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】 根据GenBank上公布的人lncRNA-HOTAIR基因序列(登录号:NR_047517.1)，利用LongMan在线工具筛选lncRNA-HOTAIR的猴源同源序列(lncRNA-M)，并利用RNAfold、LncLocator在线预测工具预测其二级结构和核质分布。建立PEDV感染的Vero-E6细胞模型，在0、6、12、24、36和48 h收集细胞，利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测微管相关蛋白1-轻链3(LC3)蛋白的表达，以明确病毒感染细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-M在PEDV感染Vero-E6细胞模型中0、6、12、24、36和48 h的表达水平。设计并合成3条lncRNA-M的干扰片段:siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，分别转染Vero-E6细胞，待细胞汇合度达到90%时接毒，感染48 h后利用实时荧光定量PCR检测lncRNA-M的表达情况，筛选出干扰效率最高的干扰片段。将干扰效率最高的干扰片段转染至Vero-E6细胞并接种PEDV后，通过Western blotting检测感染后24和48 h LC3蛋白的表达水平，以验证自噬的发生情况。【结果】 成功筛选出lncRNA-HOTAIR猴源同源序列为lncRNA 0.1，并根据RNAfold预测结果生成lncRNA 0.1的RNA最小自由能二级结构;LncLocator预测结果表明，lncRNA 0.1在细胞核和细胞质中的分布分别为41.88%和37.78%。PEDV感染Vero-E6细胞48 h后，细胞皱缩、聚集成团，细胞膜融合形成合胞体;1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在1 326 bp处出现目的条带，说明PEDV感染Vero-E6细胞模型成功建立。在PEDV感染的Vero-E6细胞模型中，Western blotting结果显示，6、12、24、36和48 h LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在48 h最高且极显著高于0 h (P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示，LC3的mRNA表达量在48 h最高，且极显著高于0 h(P<0.01)，自噬被激活;lncRNA 0.1的表达均呈上升趋势，在48 h表达量最高，48 h lncRNA 0.1的表达量极显著高于0 h (P<0.01);siRNA-2的干扰效果最好，干扰效率为80%。干扰lncRNA 0.1后，Western blotting结果显示，24和48 h干扰组的LC3蛋白表达量均低于对照组，自噬受到抑制。【结论】 PEDV感染Vero-E6细胞能够诱导自噬发生，lncRNA 0.1在感染过程中起到了促进自噬的作用。     

Ⅰ群禽腺病毒血清11型的分离鉴定及致病性试验

【目的】 了解江苏地区禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV）的基因遗传演化情况及致病性,为FAdV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】 通过SPF鸡胚盲传、PCR鉴定、电镜观察、全基因组测序、序列比对与相似性分析判定病毒血清分型,并将分离株以5×10^5.33 EID₅₀剂量胸肌注射的方式感染10日龄SPF雏鸡进行动物回归试验。【结果】 PCR结果显示,该分离株为Ⅰ群FAdV阳性,在透射电镜下可见球型、无囊膜、具有腺病毒典型的二十面体结构,通过全基因组和Hexon基因进行序列分析表明该分离毒株为FAdV D种血清11型毒株,命名为JSNT-1株。将该毒株感染SPF雏鸡,死亡率为10%（1/10）,病死鸡剖检可见肝脏褪色变黄,出血肿胀,边缘钝圆;肾脏肿大出血,苍白等病变。通过实时荧光定量PCR试验可从口腔及泄殖腔中检测到排毒,且病毒在鸡体内多个组织器官均有分布。病理组织学结果显示,死亡鸡的肝细胞变性坏死,出现嗜碱性核内包涵体;肾小球上皮细胞变性坏死;心肌可见大量炎性细胞浸润。【结论】 分离株为FAdV血清11型,感染SPF鸡后临床发病不明显,致死率低,病死鸡能产生特征性的包涵体肝炎病变,且病毒可在鸡体内外进行复制。     

不同毒力水貂阿留申病毒在猫肾细胞中的增殖特性及凋亡特性的比较研究

试验旨在对不同毒力水貂阿留申病毒（Aleutian mink disease virus,AMDV）在猫肾细胞（feline kidney cell,CRFK）中的增殖规律及其诱导细胞凋亡情况进行比较研究。将标准毒株AMDV-G及分离到的野毒株AMDV-DL124、AMDV-DL125、AMDV-QD2、AMDV-QD3、AMDV-ZJ3接种CRFK细胞,应用间接免疫荧光、实时荧光定量PCR、TCID₅₀测定技术研究病毒在细胞中的复制及表达情况,同时检测病毒诱导的细胞凋亡情况。间接免疫荧光结果显示,5株野毒株荧光着色趋势差异不大,均在感染后12 h出现荧光,随感染时间延长荧光增多,AMDV-G荧光出现时间比野毒株晚,但病毒感染后72 h几乎所有细胞均出现荧光;实时荧光定量PCR结果显示,基因组复制趋势大致相同,AMDV-DL125感染后3 h复制开始,AMDV-G感染后24 h复制才开始并呈快速增长趋势,但感染后72 h均达到峰值。TCID₅₀检测结果表明,0~12 h为病毒感染潜伏期,AMDV-G感染后60 h达到峰值,野毒株均在感染后72 h达到峰值,但是6株病毒均能在感染后48~72 h维持较高的感染滴度,其后随细胞崩解而降低。SPSS 23.0统计软件分析凋亡检测结果显示,与对照组相比,野毒株感染细胞后2~12 h诱导细胞凋亡差异显著（P<0.05）,AMDV-G诱导细胞凋亡差异明显低于野毒株,但是诱导细胞凋亡时间较野毒株长,在感染后24 h仍对细胞凋亡有较明显的诱导作用,但是各病毒诱导的细胞凋亡主要集中在2~12 h。该结果为AMDV的培养、鉴定及致病机理研究提供一定参考。     

RNA甲基化转移酶METTL3对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究RNA甲基化转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells, BSMSCs)增殖和成肌分化的影响。【方法】利用体外诱导BSMSCs分化模型模拟牛骨骼肌生长发育过程,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测METTL3在BSMSCs分化前后mRNA和蛋白表达水平的差异。设计合成METTL3干扰RNA(si-METTL3),且构建METTL3的过表达载体pcDNA3.1-METTL3,分别转染至BSMSCs中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测转染效果和BSMSCs增殖标志因子盒转录家族成员7(paired box 7,Pax7)的表达情况,EdU检测细胞增殖情况。将转染si-METTL3和pcDNA3.1-METTL3的BSMSCs进行体外诱导分化,通过光学显微镜观察BSMSCs进入分化期的细胞形态,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测BSMSCs分化标志因...