企鹅珍珠贝组织蛋白酶D的cDNA克隆、序列特征分析和应激表达研究

笔者初步研究了企鹅珍珠贝（Pteria penguin）组织蛋白酶D（cathepsin D,CTSD）的基因克隆和功能,通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得了企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因（命名为pgCTSD）。该基因cDNA全长1 767 bp,其中5＇UTR为38 bp,3＇UTR为553 bp,ORF为1 176 bp,编码392个氨基酸,包括信号肽（Met1-Ala18）、前体域（Leu19-Lys47）和成熟域（Tyr48-Ser392）三部分,分子量为42.3 kDa,等电点为8.04。pgCTSD氨基酸序列与大珠母贝（Pinctada maxima）pmCTSD的相似性最高（79%）,与其他物种的相似性为59%～75%。荧光定量分析表明,空白对照组中pgCTSD mRNA在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达,且在闭壳肌中表达量最少,肝胰脏中最高。与试验对照组相比,脂多糖（LPS）刺激6 h后性腺和肝胰脏显著下降,闭壳肌的表达量虽不大但增加显著,外套膜和鳃组织变化不显著;哈维弧菌（Vibrio harveyi）刺激6 h后肝胰腺和外套膜显著下降,闭壳肌和鳃显著上升,性腺无显著变化。肝胰腺中pgCTSD对LPS和弧菌刺激的应答反应表明pgCTSD可能参与了免疫反应。     

草鱼LPL基因的表达及饥饿和再投喂对其影响

获得了草鱼脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)部分cDNA序列（GenBank注册号为FJ612596）,并进行了序列同源性分析;采用半定量反转录聚合酶链式反应（SQ-RT-PCR）方法,检测了LPL基因在草鱼不同组织和不同发育阶段脂肪细胞中的表达状况;研究了饥饿和再投喂对草鱼肝胰脏LPL基因表达的影响。结果显示,所获得的草鱼LPL部分cDNA序列长度为360 bp,与其它物种的同源性为70%~89%; LPL基因在肝胰脏、肌肉、心脏、鳃、腹腔脂肪组织中均表达,其中在腹腔脂肪组织中表达丰度最高,在鳃中表达丰度最低;在成熟脂肪细胞中的表达丰度显著高于基质脉管组分（stromal vascular fraction,SVF）细胞;草鱼LPL基因表达水平在饥饿48 h后显著升高,再次投喂后12 h,回复到0 h的表达水平。研究表明,草鱼LPL在不同组织及脂肪细胞分化的起始和终末阶段均有表达,显示其在草鱼不同组织和脂肪细胞分化中具有重要作用,同时,其表达水平受营养状况的调控。论文首次克隆得到草鱼LPL基因部分cDNA序列,并对其进行了表达分析,研究结果可为LPL在鱼类脂质代谢中的作用研究提供参考和依据。     

凡纳滨对虾易位子相关蛋白α亚基(TRAPα)基因解析及其与WSSV抗性的关联

本研究旨在探讨凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)易位子相关蛋白 α 亚基(translocon-associated protein alpha, TRAPα)基因特征及其在抗白斑综合征病毒(white spot syndrome, WSSV)中的作用。通过 PCR 和 Sanger 测序技术, 获得凡纳滨对虾 TRAPα 的开放阅读框(open reading frame, ORF)序列, 将该基因命名为 Lv-trapα, 并进行生物信息学分析。采用 real-time PCR 分析 Lv-trapα 基因在健康凡纳滨对虾和感染 WSSV 不同时间点的凡纳滨对虾肝胰腺、鳃、 肌肉、眼柄中的 Lv-trapα 表达水平。同时, 利用重亚硫酸氢盐测序技术(bisulfite sequencing PCR, BSP)检测健康凡纳滨对虾和感染 WSSV 后 96 h 的凡纳滨对虾肝胰腺组织中 Lv-trapα 基因上游 DNA 序列的甲基化水平。结果显示, Lv-trapα 的 ORF 全长 873 bp, 共编码 290 个氨基酸, 预测相对分子质量为 32466.4, 理论等电点为 4.45。多序列比对发现 TRAPα 蛋白的保守性较高。Lv-trapα DNA 序列中有 8 个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism, SNP), 其中 1 个 SNP 位点处于外显子区域且属于错义突变, 其余 7 个 SNP 位点处于内含子区域。real-time PCR 结果显示, Lv-trapα 基因在凡纳滨对虾肝胰腺、鳃、肌肉、眼柄中均有表达, 且在感染 WSSV 后显著上调表达(P＜0.05)。 值得注意的是, 在感染 WSSV 后 96 h, 体内病毒含量不同的凡纳滨对虾肝胰腺中 Lv-trapα 的表达水平差异显著, 高病毒含量组中 Lv-trapα 的表达水平显著高于低病毒含量组(P＜0.05), 提示 Lv-trapα 表达水平和 WSSV 复制水平存在正相关性。BSP 结果显示, Lv-trapα 基因上游 1 个 CpG 位点(存在于 NCBI 数据库 NW_020872863.1 第 360336-360337 nt 位置)的甲基化水平和 Lv-trapα 表达水平呈负相关, 该 CpG 位点的甲基化水平和凡纳滨对虾体内 WSSV 病毒含量也呈负相关。本研究可为深入研究凡纳滨对虾抗 WSSV 的分子机制和抗病分子育种提供理论参考。     

三疣梭子蟹Apaf-1基因的克隆及其在低盐和病原胁迫后的表达分析

本研究利用RACE方法克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)基因,该基因cDNA全长为2032 bp,其中,ORF为1050 bp,编码349个氨基酸,预测分子量为39.13 kDa,理论等电点为7.67。同源性和系统发育分析显示,Apaf-1与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) Apaf-1的同源性最高,为51.27%,并与凡纳滨对虾聚为一支。组织表达分析显示,Apaf-1基因的相对表达水平在肝胰脏最高,其次是肌肉、心脏、鳃和眼柄,血细胞和表皮最低。不同盐度胁迫后,Apaf-1在Ⅱ期幼蟹体内表达水平在3 h达到最大值,此后,呈先下降再上升趋势;Apaf-1在80日龄盐度20胁迫后三疣梭子蟹的鳃中呈上升趋势,在肝胰腺中为先上升后下降趋势,表明盐度改变能影响该基因在鳃和肝胰腺组织中的表达。不同病原感染实验结果显示,在血细胞中,注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后Apaf-1的表达于48 h到达峰值,为对照组的2.76倍(P<0.05),注射白斑综合征病毒(WSSV)后,仅在12 h表达水平上调,为对照组的1.25倍(P<0.05);在肝胰腺中,注射副溶血弧菌后在72 h到达峰值,为对照组的5.44倍(P<0.05),注射WSSV后在12 h到达峰值,为对照组的5.89倍(P<0.05),整体呈上调表达趋势。本研究为进一步理解三疣梭子蟹Apaf-1基因的生理功能提供了参考。     

马氏珠母贝TLR6基因的克隆、序列分析与表达

为了探究TLR6(Toll like receptor 6)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝TLR6基因(Pm-TLR6)c DNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了Pm-TLR6在马氏珠母贝各组织中的表达情况、哈维氏弧菌刺激后和植核移植后血淋巴中的表达模式。结果显示:Pm-TLR6c DNA全长2295 bp,其中5′非编码区(UTR)长94 bp,3′UTR长89 bp,开放阅读框(ORF)长2112 bp,编码703个氨基酸;多序列比对结果表明物种间TLR6具有较高的保守性;PmTLR6具有跨膜域、富含亮氨酸的重复序列(LRRs)和TIR域,符合TLRs家族特征。q RTPCR数据分析表明,Pm-TLR6在马氏珠母贝肝胰脏、血细胞、鳃、性腺、闭壳肌、外套膜中均有表达,其中肝胰脏中表达量最高;哈维氏弧菌刺激后,Pm-TLR6在2 h表达上调,约为对照组(0 h)的9倍,随后的6 h恢复至正常水平,直至16 h表达水平开始回升并于24 h达到最大表达量,是对照组的29.4倍,具有显著性差异;植核移植实验结果显示PmTLR6在植核后5和10 d表达水平没有显著性变化,15和20 d表达量出现上升趋势,但差异不显著,最后于30 d达到最大值,约为空白对照组(0 d)的5倍,具有显著性差异。研究表明,Pm-TLR6可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。     

中国明对虾MKK4基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达分析

为初步研究中国明对虾MKK4的生物学功能,采用RACE技术克隆获得中国明对虾MKK4基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾MKK4基因全长为2 064 bp,开放阅读框长1 221 bp,5'非编码区长214 bp,3'非翻译区长629 bp。将该基因命名为FcMKK4。推测该基因编码406个氨基酸,预测分子量为45.94 ku,理论等电点为8.50。同源性和系统进化分析发现FcMKK4与肩突硬蜱和印度跳蚁的同源性分别为80%和78%,与其他节肢动物MKK4聚为一支。荧光定量RT-PCR结果表明,FcMKK4基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为肝胰腺。氨氮胁迫后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的表达量均显著增加,并有不同的时空表达谱式,表明FcMKK4可能参与中国明对虾非生物胁迫的应答反应。     

Akt在中华绒螯蟹免疫中的功能

Akt作为PI3K-AKT 信号通路的核心分子,在细胞增殖、代谢、发育和存活等过程中发挥重要作用。本研究采用特异性引物及PCR技术,克隆获得了中华绒螯蟹Akt基因 (EsAkt)并进行生物信息学分析,实时定量PCR技术检测了EsAkt在中华绒螯蟹不同组织和不同免疫刺激后的表达水平,免疫荧光技术检测了EsAkt蛋白的细胞定位,双链RNA干扰技术分析了EsAkt干扰后凋亡基因的变化。结果显示,EsAkt分子包含PH结构域、中心催化结构域 (S_TKc)和羧基端疏水结构域 (S_TK_X) 3个保守的结构域。EsAkt在所有被检测的组织中呈现组成型表达,且在免疫相关组织 (如肝胰腺、鳃和血淋巴细胞)中的表达量显着高于胃和肠道。EsAkt蛋白主要以弥散状的形式分布在细胞质中。中华绒螯蟹注射脂多糖 (LPS)和嗜水气单胞菌后,显著诱导EsAkt转录本的表达,LPS免疫刺激12 h后,EsAkt响应达到峰值,为对照组的4.35倍,刺激48 h后,EsAkt的mRNA表达水平有所降低,但仍是对照组2.62倍。嗜水气单胞菌免疫刺激6 h后,EsAkt响应达到峰值,为对照组的9.05倍,刺激48 h后,EsAkt的mRNA表达量回落到正常水平。双链RNA干扰EsAkt后,EsAkt的mRNA表达量为对照组的0.38倍,而凋亡相关基因EsCaspase-3-like表达水平显著上调,为对照组的2.69倍。研究表明,EsAkt基因在中华绒螯蟹免疫中发挥重要作用,参与了机体对细菌引起的免疫应激过程。本研究丰富了中华绒螯蟹PI3K-AKT信号通路研究的基本资料,为进一步研究甲壳动物免疫防御机制奠定了基础。     

热休克及菌胁迫对厚壳贻贝HSP70基因表达的影响

70 ku的热激蛋白(HSP70)具有细胞内分子伴侣和细胞外免疫调节功能,是受到热激、重金属、干旱、疾病、寄生虫感染等条件胁迫后产生的诱导蛋白。本实验利用同源克隆法,获得厚壳贻贝HSP70基因1 700 bp的核心序列,BLAST比对和系统进化分析显示,该序列与已知的双壳贝类相应分子高度同源,其中与紫贻贝HSP70基因相似性高达96%,在进化树中两者位于同一分支。37 ℃热激后,厚壳贻贝肝胰腺和鳃中HSP70基因的表达快速上调,2 h即达到对照组30倍,随后持续上升,肝胰腺中最高表达量达到对照组100倍,说明厚壳贻贝HSP70分子为典型的热诱导蛋白。鉴于大肠杆菌及枯草芽孢杆菌是水体中常见微生物,进一步利用实时荧光定量PCR技术检测上述两种细菌感染后,HSP70基因在厚壳贻贝鳃和肝胰腺中的表达水平,结果显示,两种细菌均可引起厚壳贻贝鳃和肝胰腺的HSP70基因表达上升,但大肠杆菌诱导效应显著,8 h时表达量达到最高,鳃为对照组的4倍,肝胰腺为4.5倍,随后逐渐下降,到48 h已恢复到原始水平;枯草芽孢杆菌刺激后,肝胰腺组织中最高表达量在刺激后6 h约为对照组2.5倍,与注射PBS的效果相差不大,鳃组织的响应较肝胰腺组织明显,表达量缓慢升高,8 h达到最高,为对照组4倍,随后迅速下降,直至生理水平。研究表明,厚壳贻贝HSP70分子在调节环境胁迫及宿主免疫防御中具有重要功能。     

斑节对虾天门冬氨酸转氨酶基因的克隆及氨氮胁迫条件下的表达分析

为了探索天门冬氨酸转氨酶(AST)在斑节对虾(Penaeus monodon)氨氮(NH3-N)解毒代谢中的作用,该研究利用RACE技术获得了斑节对虾AST基因(PmAST)的cDNA全长序列,进行了相关生物信息学分析,在此基础上采用荧光定量与氨氮胁迫实验的方法研究了PmAST基因在斑节对虾的不同组织以及不同浓度氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 957 bp,开放阅读框(ORF)为1 242 bp,3'非编码区(UTR)为584 bp,包括含有30个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为131 bp。ORF可编码413个氨基酸,预测分子量为45.852 kD,理论等电点为8.85。序列含有1个AAT-like超家族结构域、15个磷酸化位点和2个糖基化位点。PmAST的mRNA在斑节对虾各组织中都有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为鳃组织,在胃和脑组织中的表达量最低。96 h氨氮胁迫后荧光定量PCR分析结果表明,PmAST在肝胰腺和鳃组织中都具有不同程度的表达上调,显著高于对照组(P0.05)。研究结果表明斑节对虾的PmAST基因在氨氮胁迫条件下会出现表达上调,并且氨氮浓度越高其上调幅度也越大,所以PmAST参与了斑节对虾的急性氨氮胁迫应答。     

中国对虾ATG5基因的克隆及其在pH、碳酸盐碱度胁迫下的表达分析

采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) ATG5基因cDNA全长,命名为FcATG5。利用实时荧光定量技术分析了FcATG5的组织表达及其在pH和碳酸盐碱度胁迫下的表达特征,并利用RNAi技术验证其功能。基因分析显示,FcATG5 cDNA全长为2225 bp,开放阅读框为810 bp,编码269个氨基酸,预测其编码的蛋白质分子量为31.103 kDa,理论等电点为5.59,为疏水性蛋白,包含1个APG5自噬相关蛋白结构域,无跨膜结构,不包含信号肽。同源性和系统进化分析显示,FcATG5具有高度保守性,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)同源性最高(98.14%)。组织表达分析显示,FcATG5在中国对虾各组织中均有表达,肌肉中表达量最高(P<0.05),血淋巴细胞中最低(P<0.05)。pH胁迫后48 h,FcATG5在鳃中的表达量最低,为对照组的1.68倍;胁迫后96 h最高,为对照组的2.67倍。碳酸盐碱度胁迫后12 h,FcATG5在鳃中表达量最高,为对照组的2.77倍;胁迫后96 h最低,为对照组的1.30倍。干扰实验结果显示,pH和碳酸盐碱度胁迫下,沉默FcATG5基因会使中国对虾死亡率显著增高(P<0.05),表明该基因的表达量越高,越有利于中国对虾存活。实时定量结果表明,FcATG5在pH、碳酸盐胁迫下的表达量均显著升高(P<0.05),推测自噬可能参与中国对虾应对非生物胁迫的调控。本研究结果对水生动物特别是甲壳动物中细胞自噬研究具有重要的借鉴意义,有助于推进中国对虾盐碱水养殖的研究进程。     

团头鲂铁蛋白基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染下的表达

利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆团头鲂Megalobrama amblycephala铁蛋白基因c DNA全长序列;同时研究经嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila攻毒后团头鲂肝组织中铁蛋白表达的变化,了解铁蛋白基因在团头鲂免疫应答中的作用。结果表明:团头鲂铁蛋白c DNA全长序列包括150bp的5’末端序列(untranslated region,UTR),270bp的3’UTR,以及522bp编码174个氨基酸的开放阅读框(open reading frame,ORF)。这些氨基酸序列同其他鱼类铁蛋白M链氨基酸序列同源性较高。团头鲂铁蛋白基因在5’非编码区核甘酸序列124~154的位置有个特殊的结构,即铁反应元件(iron response element,IRE)。荧光定量PCR分析表明:铁蛋白基因在团头鲂肌肉、心脏、鳃、肝胰脏、脑和肾脏等组织器官中都有表达,在肝胰脏的表达量最高,脑组织表达量最低。经嗜水气单胞菌急性感染后,团头鲂肝胰脏组织中铁蛋白基因表达量显著上调。上述结果表明:团头鲂铁蛋白M亚基在团头鲂免疫应答过程中起重要作用。     

高温胁迫对日本沼虾热休克蛋白基因的表达、抗氧化酶活力及组织结构的影响

为探究日本沼虾(Macrobrachium nipponense)应对高温胁迫的响应机制, 设置了水温对照组(20±0.5) ℃和高温组(30±0.5) ℃, 溶氧浓度(6.5±0.5) mg/L, 分别在高温胁迫 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h 测定了日本沼虾肝胰腺和鳃组织中热休克蛋白 21 (heat shock protein 21, HSP21)、热休克蛋白 60 (heat shock protein 60, HSP60)、热休克同源蛋白 70-3 (heat shock protein cognate 70-3, HSC70-3)和热休克蛋白 90 (heat shock protein 90, HSP90)基因的表达, 相关抗氧化酶——超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)、 谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性以及组织结构的变化。结果表明, 高温胁迫下肝胰腺和鳃组织中的 4 个热休克蛋白基因均被诱导表达上升, 其中 HSC70-3 基因表达上升最为显著; 同时, 肝胰腺中的基因表达上升趋势比鳃中的基因表达趋势更为明显。高温胁迫下相关抗氧化酶活力均发生不同程度的变化, 肝胰腺中 SOD、GST 和 CAT 酶活力均有显著上升趋势, 而 GPX 酶活力仅有轻微变化; 鳃组织中的 SOD 酶活性显著低于对照组(P＜0.05), GST、GPX 和 CAT 酶活性显著高于对照组(P＜0.05)。肝胰腺和鳃组织结构均发生变化, 肝胰腺组织中分泌细胞及内部转运泡体积增大, 鳃组织结构层状上皮轻微弯曲, 血细胞排列紊乱等。综上所述, 高温胁迫激活了日本沼虾抗氧化系统, 并诱导了热休克蛋白基因的表达上升, 其中 HSC70-3 基因可能在日本沼虾的耐热性中起重要作用。高温胁迫下抗氧化酶活力的变化可能对于避免氧化损伤至关重要。本研究旨在通过了解日本沼虾应对高温胁迫的响应机制从而为日本沼虾的健康养殖提供参考。     

斑节对虾MKK7基因的克隆及在不同胁迫条件下的表达分析

丝裂原活化蛋白激酶激酶7（MKK7）是JNK（c-Jun N-terminal kinase）信号通路的关键调控因子,参与调节细胞对各种胞外刺激的反应。本研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾（）,其全长为2710 bp,包括14 bp的5''非编码区（UTR）、1295 bp的3''UTR和1401 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码466个氨基酸。多重序列比对和系统进化树分析结果表明,基因聚为一支并且具有最高的同源性（99.14%）。定量表达结果表明,Staphylococcus aureus）组和鳗弧菌（Vibrio harveyi）组,这两种组织中的表达量均显著低于对照组。两组低盐（17、3）胁迫后,肝胰腺和鳃组织中的PmJNK在各组的表达均受到抑制,表明MAPK信号转导通路可能在斑节对虾免疫防御和盐度应激过程中发挥重要作用。     

斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得了斑节对虾(Penaeus monodon)谷氨酸脱氢酶基因(PmGDH)的cDNA序列。该序列全长2386 bp,开放阅读框(ORF)为1677 bp,3'非编码区(UTR)为688 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为21 bp。ORF可编码558个氨基酸,预测分子量为61.837 k D,理论等电点为6.57。序列含有ELFV dehydrog N与NAD bind 1 Glu DH两个保守结构域,37个磷酸化位点,3个糖基化位点。通过同源性、相似性以及系统进化树分析,斑节对虾的GDH基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GDH基因的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了PmGDH基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。结果表明,PmGDH的m RNA在各组织中都有表达,其中,在肌肉组织中表达量最高,其次为眼柄神经,在血淋巴与肠组织中表达量最低。96 h氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明PmGDH在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比都具有显著差异(P0.05),都具有不同程度的表达上调。表明PmGDH在氨氮代谢方面具有重要的作用,参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

文蛤Clq基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤Clq基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316 bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸.在文蛤Clq(MmClq)蛋白中,Clq结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的Clq结构域均具有较高的同源性.通过荧光实时定量PCR,MmClq mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高.在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,Clq相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmClqmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍.包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmClq重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性.     

中华绒螯蟹4E-BP1基因的克隆、表达特征及其在蜕壳中的作用

真核翻译起始因子 4E 结合蛋白 1 (4E-BP1)是 mTOR 信号通路下游的翻译抑制因子, 调节翻译的起始和蛋白质的合成。为探究中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis) 4E-BP1 基因特征、时空表达模式及其在蜕壳过程中的潜在作用, 本研究利用 RACE 技术克隆获得中华绒螯蟹 Es4E-BP1 全长 cDNA 序列, 利用 qPCR 技术探究其时空表达, 利用 dsRNA 干扰探究其在中华绒螯蟹蜕壳中的作用。测序结果显示, Es4E-BP1 cDNA 全长 1678 bp, 包括 134 bp 的 5? 非编码区、1193 bp 的 3?非编码区和 351 bp 的开放阅读框。氨基酸序列分析发现, Es4E-BP1 含有 1 个 eIF4E 超级家族的典型保守域, 且包含 1 个超二级结构 TOS 基序和 1 个 YXXXXLΦ 基序。多序列比对和系统进化树分析显示, Es4E-BP1 与蓝蟹(Callinectes sapidus)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)聚为一支并且具有很高的同源性 (95.69%和 93.16%)。qPCR 结果显示, Es4E-BP1 在成蟹各个组织均有表达, 其中 Y 器官表达量最高, 其次为肌肉, 鳃丝中表达量最低。一个完整蜕壳周期内, 幼蟹不同组织表达模式不同, 但均在蜕壳后期 A-B 期表达量最高, 蜕壳前期表达量较低。注射 dsEs4E-BP1 后, 中华绒螯蟹存活率远低于对照组 CG 组; 蜕壳间隔显著高于 CG 组。研究结果表明, Es4E-BP1 在中华绒螯蟹各组织中广泛表达, 在调控蜕壳生长中具有重要作用, 为进一步研究甲壳动物 4E-BP1 基因提供了重要参考。     

中国对虾甘氨酸脱羧酶的基因克隆、表达及其与抗WSSV的关联分析

本研究采用RACE技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)甘氨酸脱羧酶基因(Fc GLDC)的全长cDNA及DNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,FcGLDC基因的cDNA全长为3481 bp,其中,ORF为2829 bp,5￠UTR长17 bp,3￠UTR长86 bp。完整的阅读框编码942个氨基酸,分子量为104.66 kDa,预测的理论等电点为6.51。FcGLDC基因DNA序列全长共4964bp,包含12个外显子和11个内含子。同源性及系统进化分析显示,FcGLDC基因与节肢动物的GLDC基因聚为一类;氨基酸序列比对发现,Fc GLDC基因的蛋白序列与节肢动物的相似度最高,与内华达白蚁(Zootermopsis nevadensis)、体虱(Pediculus humanus corporis)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)的相似度分别为71%、68%和68%。在鳃、肝胰腺和肌肉中的荧光定量PCR结果显示,FcGLDC在肌肉中的相对表达量最高,鳃中最低。WSSV感染后,该基因在鳃、肝胰腺和肌肉中呈现出了不同的时空表达特点。使用直接测序法结合质谱法,在该基因内部发现4个SNP位点,但是各位点与抗WSSV性状均不相关(P0.05)。本研究表明,FcGLDC基因在对虾感染WSSV后的应答反应中或起一定作用。     

pH、氨氮胁迫对中国对虾HSP90基因表达的影响

研究了pH、氨氮胁迫对中国对虾Fenneropenaeus chinensis血细胞、肝胰腺、鳃和肌肉组织HSP90基因时空表达的影响.分别将中国对虾暴露于pH7.0、9.0的水体中148h和不同氨氮浓度的水体中96h,结果表明,pH（7.0,9.0）胁迫条件下中国对虾鳃、肌肉和血细胞HSP90基因表达均上调,肝胰腺HSP90基因表达对两种pH胁迫差异明显：pH7.0胁迫条件下,HSP90基因表达3h达峰值后明显降低;pH 9.0胁迫时,HSP90基因表达水平逐渐升高,整个胁迫过程中均显著高于对照组（P＜0.05）,说明中国对虾肝胰腺组织是高pH胁迫的响应器官.6mg/L氨氮浓度组鳃和肌肉组织HSP90基因表达水平24h达最高值,分别为对照组的5.46和1.55倍;各胁迫组肝胰腺和血细胞HSP90基因表达水平分别于6h和48h达到最高值,为对照组的1.33～2.08倍和2.20～5.45倍.肝胰腺组织对氨氮胁迫表现敏感,短时间内（6h）通过上调HSP90基因表达水平保护细胞;鳃组织HSP90基因表达波动范围最大,说明鳃组织需要更高表达量的HSP90保护细胞.当氨氮浓度持续48～96h维持在2～6mg/L,各组织HSP90基因表达水平显著降低.     

急性低氧对团头鲂鳃组织氧化还原稳态及细胞凋亡的影响

为探究急性低氧对团头鲂(Megalobrama amblycephala)鳃组织氧化还原稳态及细胞凋亡的影响, 本研究通过测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutases, SOD)、过氧化氢酶(catalases, CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量, 检测急性低氧胁迫下鳃组织的氧化应激水平, 并采用 Hoechst 染色法观察了团头鲂鳃组织细胞的凋亡, 同时还利用 qRT-PCR 技术检测了团头鲂鳃组织中凋亡相关基因 Caspase 3、Caspase 8 的表达量。结果显示, 在溶解氧含量为(2.0±0.1) mg/L 的低氧环境下, 团头鲂鳃组织中 SOD、CAT 活性及 MDA 的含量均在 6 h、12 h 时显著增加(P＜0.05); 且 SOD 活性与 MDA 含量的变化趋势相同, 均呈上升趋势。此外, 随低氧胁迫时间的延长, 在 6、 12 及 24 h 时鳃组织细胞凋亡的平均荧光强度分别为 0 h 的 2.19 倍(P＜0.05)、2.32 倍(P＜0.05)及 2.59 倍(P＜0.05), 鳃组织中 Caspase 3 与 Caspase 8 基因表达水平均显著高于 0 h(P＜0.05)。研究表明, 团头鲂在急性低氧的水环境中会提高自身的氧化应激水平, 激活凋亡相关基因 Caspase 3、Caspase 8 的活性, 最终促使团头鲂鳃组织发生细胞凋亡。 本研究结果为急性低氧下团头鲂鳃组织的生理状态和细胞凋亡应答情况的研究提供参考。     

养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1的检出及组织病理学分析

为探究浙江省舟山市某养殖池塘中三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴发疾病的病因, 应用组织病理学、 分子生物学和荧光原位杂交等技术手段, 对患病三疣梭子蟹组织进行检验。研究发现, 患病三疣梭子蟹的临床症状主要表现为食欲下降, 行动迟缓, 鳃水肿; 光学显微镜下观察鳃及血淋巴液未发现寄生虫, 肝胰腺等组织中也未分离到致病菌; 采用 PCR 方法对病蟹进行血卵涡鞭虫(hematodinium)、白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、青蟹双顺反子病毒(mud crab discistrovirus-1, MCDV-1)以及青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus, SSRV) 蟹类常见病原 PCR 检测, 结果均为阴性; 病蟹的肝胰腺、心脏、鳃等组织的病理切片中可观察到明显的细胞病变和嗜酸性包涵体; 超薄切片电镜观察显示: 病蟹的肝胰腺、心脏和鳃组织中均存在六边形病毒颗粒, 粒子直径 150 nm 左右, 与已报道的十足目虹彩病毒 1 (decapoda iridescent virus 1, DIV1)形态特征相似。采用特异性套式 PCR 检测方法对患病蟹组织样品进行 DIV1 病原检测, 所有样本均扩增出 457 bp 和 129 bp 大小的目的片段。进一步根据 GenBank 中 DIV1 的主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)表达基因和三磷酸腺苷酶(ATPase)表达基因序列设计特异性引物, 均能从病蟹样品中扩增出预期大小的 MCP 和 ATPase 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)区全长。将扩增获得的 MCP 和 ATPase 基因 ORF 区全长进行测序和同源序列比对分析, 进化树分析结果表明其与十足目虹彩病毒属(Decapodiridovirus)病毒的 MCP 和 ATPase 基因序列自然聚为一支, 判定导致此次三疣梭子蟹发病病原为 DIV1。根据原位杂交探针设计原则, 以 DIV1 的 MCP 和 ATPase 基因的保守区域为靶位点分别设计探针, 通过荧光原位杂交获得了病毒粒子在病蟹肝胰腺、心脏、肌肉和鳃组织的分布情况, 与电镜切片观察和套式 PCR 检测结果相符。研究结果可为海水养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒 1 病诊断与防控提供参考。