大肠杆菌主动外排系统的研究进展

由于各种抗生素在临床上的广泛应用,导致细菌多重耐药菌株(Multiple-resistant strain,MRS)的不断出现.由主动外排系统介导,阻止药物在菌体内积聚是细菌产生多重耐药性的主要机制之一,主动外排系统在细菌多重耐药性的研究中显得越来越重要.目前大肠杆菌主动外排系统的研究已成为热点,现已发现大肠杆菌中存在多种主动外排系统,如AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE等.本文就近年来有关大肠杆菌主动外排系统的研究作以介绍.     

大肠杆菌耐药菌的体外诱导及主动外排基因acrA表达量的变化

为探讨大肠杆菌的体外诱导及主动外排基因acrA表达量的变化,首先对选定大肠杆菌进行耐药性培养,得到各大肠杆菌的0,5,10,15,20,25及30代菌,测定MIC的变化,结果表明不同菌株的不同代数的主动外排基因acrA表达量均有变化。随着耐药性增加,大肠杆菌的主动外排基因acrA表达量也有所增加。以上结果表明大肠杆菌的耐药性与主动外排基因acrA的表达量有相关性。     

AcrAB-TolC主动外排系统与猪源耐药大肠杆菌多重耐药的相关性

以前期获得的25株猪源耐药大肠杆菌为试验菌株,采用药敏纸片法测定以上分离菌株对氟苯尼考、多西环素、庆大霉素等11种药物的敏感性,并分析其多重耐药表型;采用PCR方法和实时荧光定量PCR方法分别检测25株猪源大肠杆菌中AcrAB-TolC主动外排基因的携带率以及不同耐药数量的多重耐药菌株的外排泵基因arA和acrB的表达量,同时分析其主动外排调控基因marA、soxS、robA和acrR相对表达量的差异,从mRNA水平上探讨外排泵基因表达量和调控因子与大肠杆菌多重耐药性的相关性。结果显示,25株耐药大肠杆菌中acrA、acrB和tolC等3种主动外排基因的携带率分别为68.00%、72.00%和76.00%;acrA、acrB这2种主动外排基因以及调控基因marA和soxS的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈正相关,调控基因acrR的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈负相关;robA调控基因的表达量均低于标准菌株,且与耐药谱数无明显相关性。结果表明,猪源耐药大肠杆菌携带acrA、acrB、tolC等3种基因主动外排基因的携带率较高,且与多重耐药菌株的耐药谱具有相关性;调控因子的表达量亦与多重耐药的耐药谱具有相关性。     

临床分离食品动物源多重耐药大肠杆菌耐药分子特征研究

本研究从主动外排机制、膜孔蛋白缺失及氟喹诺酮类药物作用靶位改变等几个方面探讨,临床分离的20株动物源性多重耐药大肠杆菌的耐药分子特征。实验结果表明,20株临床分离大肠杆菌gyrA83、gyrA87、parC80的突变率分别为95％、85％、55％。gyrA和parC共同突变的有11株,突变率为55％;20株多重耐药菌大肠杆菌普遍存在主动外排机制,主要介导对部分氨基糖苷类、四环素、氟苯尼考和氟喹诺酮类药物耐药,当添加外排泵抑制剂PAβN后多数菌株庆大霉素、新霉素、四环素、氟苯尼考及氟喹诺酮类药物的MIC都降低了2倍～256倍。利用建立的ELISA方法检测外排泵AcrA蛋白的表达水平,结果证实所有,临床分离菌外排泵表达都增高;20株分离大肠杆菌中,部分菌株缺失OmpC或OmpF蛋白,同时缺失这两个蛋白的只有3株。部分菌株OmpF蛋白条带附近存在有多重耐药相关蛋白（Mar）。本研究结果揭示多重耐药大肠杆菌对常用抗菌药物高水平的耐药表型是主动外排机制、药物作用靶位的改变、外膜通透性的改变及其它机制共同作用的结果。     

3种抗菌药物诱导改变marA、soxS和robA基因mRNA表达水平

本研究旨在探讨不同类抗菌药物诱导引起大肠肝菌主动外排系统调控基因marA、soxS、robA表达水平的变化特点.挑选大肠杆菌标准菌株O78经阿米卡星(AMK),环丙沙星(CIP),头孢曲松钠(CRO)逐代诱导的10、20、30代菌株作为试验菌株,提取其总RNA并反转录,采用荧光定量RT-PCR的方法测定其主动外排调控基因marA、soxS、robA的mRNA表达水平.结果表明:marA基因在CIP20中mRNA的表达水平最高,是母体菌株O78的2.30倍,且其在CIP10、CRO30、CIP30、AMK20的表达量分别为母体菌株O78表达量的2.11、1.71、1.15、1.44倍;soxS基因在AMK20中的表达量最高,是母体菌株的5.98倍,其它高于O78的菌株表达量的菌株为CRO30、CRO20、CIP20、CIP30;robA基因mRNA表达量除了在CIP10的表达量高于O78外,其余均低于母体菌株的表达.结果提示头孢曲松、环丙沙星、阿米卡星能诱导菌株的主动外排调控基因marA、soxS mRNA表达增加,robA基因mRNA表达减少.     

黄芩苷对耐药大肠杆菌marA基因mRNA表达水平的影响

为探究黄芩苷对耐药大肠杆菌主动外排调控基因marA的mRNA表达水平的影响,利用微量肉汤稀释法确定黄芩苷增敏环丙沙星的最佳浓度,然后对8株耐药菌株采取不加任何药物、单独加32mg/L黄芩苷或4 mg/L环丙沙星、32mg/L黄芩苷和4mg/L环丙沙星联合及16mg/L CCCP和4mg/L环丙沙星联合等5种方式培养,抽提总RNA并反转录成cDNA,荧光定量PCR测定主动外排调控基因marA及管家基因gapA的Ct值,并计算不同培养条件下各个耐药大肠杆菌marA基因mRNA相对表达量。结果显示,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数R~2=1.00,溶解曲线特异,marA基因产物Tm值为81.8~82.1℃;黄芩苷与环丙沙星联合培养的耐药菌外排泵基因marA表达量与环丙沙星单独培养相比明显下降,前者0.71~2.06,后者2.27~7.28;以上结果表明黄芩苷可以通过抑制外排泵调控基因marA发挥作用,提示其也许可作为大肠杆菌的外排泵抑制剂应用于临床。     

赤芍水提物及芍药苷对大肠杆菌抗菌增敏活性的影响

旨在考察中药赤芍水提物及其主要成分芍药苷对磷霉素钠的抗菌增敏活性,验证芍药苷对外排泵转运子AcrB的抑制作用,推测其抗菌增敏机制。首先,通过微量棋盘稀释法检测赤芍水提物及其主要成分芍药苷与磷霉素钠联合应用对临床分离的禽多重耐药大肠杆菌E320和质控菌株大肠杆菌ATCC35218的抑菌作用;其次,利用YASARA软件,以大肠杆菌多重耐药AcrAB-TolC系统中的外排泵转运子AcrB为靶标,与芍药苷进行分子对接模拟,探讨两者的识别机制;通过尼罗红外排试验验证芍药苷对外排泵的抑制作用;最后,通过实时荧光定量PCR验证芍药苷降低AcrB mRNA的表达量进而发挥抗菌增敏作用。试验结果证实赤芍水提物和芍药苷与磷霉素钠联合用药均具有协同抑制多重耐药大肠杆菌E320的作用(FICI≤0.5);分子对接结果显示芍药苷与AcrB蛋白受体的结合能达到8.333 kJ/mol,作用主要位点是AcrB蛋白受体上Phe628、Phe615、Val612、Ile277、Asn274、Gly179、Phe178等氨基酸残基,分子间主要作用力为疏水作用力;外排抑制试验结果显示芍药苷可以抑制耐药大肠杆菌外排泵活性,明显阻滞尼罗红的外排;实时荧光定量PCR结果显示芍药苷联合磷霉素钠比单独使用磷霉素钠显著降低大肠杆菌AcrB mRNA的表达量。本试验证明芍药苷通过作用外排泵转运子AcrB,使抗生素在菌体内积聚;并能显著降低AcrB mRNA的表达量进而起到抗菌增敏作用,为临床提供一种有效的抗菌增敏剂,对治疗耐药菌引起的细菌感染具有重要意义。     

车前子提取物对大肠杆菌耐药抑制作用初步研究

为了对车前子提取物耐药抑制作用进行研究,采用棋盘法测定车前子乙醇提取物与环丙沙星的联合作用,二者联合应用对大肠杆菌耐药菌株具有较好的抗菌作用。通过环丙沙星蓄积动力学试验检测车前子乙醇提取物对鸡源大肠杆菌外排泵的影响,结果表明,车前子乙醇提取物能增加环丙沙星在细胞内的蓄积量,抑制耐药大肠杆菌对抗生素的主动外排作用。三氯甲烷萃取物对大肠杆菌的药物外排具有一定的抑制作用,但其抑制作用不如乙醇提取物。     

临床分离大肠杆菌对氟喹诺酮类药物高耐药株AcrA的过量表达

大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性通常由靶位酶DNA旋转酶和拓扑异构酶IV基因gyrA和parC突变介导，但是否基因突变单独就能介导高水平的耐药还不十分清楚。因为大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药还存在主动外排系统——AcrAB—TolC介导的耐药。Everett等检测了36株对环丙沙星高水平耐药的大肠杆菌，发现所有菌株都存在gyrA的突变，     

中药提取物对耐药大肠杆菌MIC及acrA基因表达量的影响

通过亚抑菌浓度中药提取物处理大肠杆菌耐药菌,利用荧光定量PCR技术检测其外排泵基因acrA表达量的变化及试管二倍稀释法测定乳酸环丙沙星对处理前后细菌MIC的变化。结果显示,经亚抑菌浓度中药提取物处理后的耐药大肠杆菌其acrA基因表达量存在显著变化。其中经中药A,I,S,X处理过的大肠杆菌外排泵基因表达量分别降低到原来的0.20,0.16,0.05和0.24倍,表明亚抑菌浓度中药提取物对大肠杆菌耐药菌的外排泵基因表达量有明显的抑制作用,提示在中药提取物中寻找大肠杆菌耐药外排泵抑制剂有一定前景。     

大肠杆菌AcrAB-TolC外输泵的研究进展

大肠杆菌是主动外输泵最多的一种细菌,其中AcrAB-TolC是最主要的、占绝对优势的多药外输系统,在多药耐药过程中起重要作用.许多学者对AcrAB-TolC的结构、功能及表达调控机制做了深入研究,为解决多药耐药性问题奠定了基础.本文就大肠杆菌AcrAB-TolC的结构特征和表达调控机制等进行了综述.     

氨基糖苷类耐药鸭大肠杆菌acrD基因mRNA表达水平

从89株临床分离鸭源大肠杆菌中选择5株氨基糖苷类高水平耐药菌,应用实时荧光定量RT-PCR方法测定其主动外排基因acrD mRNA水平,选用1株中介株、1株敏感株和大肠杆菌ATCC25922作为对照,分析其mRNA转录水平与耐药强度的相关性。结果显示,5株耐药菌的acrD mRNA相对表达量均高于中介株和敏感株,其相对表达量分别是2.00、1.96、2.22、1.84、4.39,敏感对照株为1.67,中介对照株为1.75,除4号菌株外,其余4株耐药菌相对表达量和标准菌株ATCC25922具有显著性差异;同是高度耐药的4号菌和5号菌存在较大差异,5号菌相对表达量是4号菌的2.39倍,这说明对氨基糖苷类不同耐药程度的菌株acrD基因的转录、表达存在差异,且与耐药水平呈正相关,但同时存在其他重要耐药机制介导氨基糖苷类耐药。     

甘草酸对多重耐药大肠杆菌的抗菌增敏作用

多药外排泵转运子AcrB是大肠杆菌产生多重耐药性（MDR）的重要原因和生物学基础。筛选针对大肠杆菌外排泵AcrB的抑制剂有助于解决大肠杆菌多重耐药问题,本试验借助虚拟筛选工具AutoDock Vina以大肠杆菌多药外排泵转运子AcrB为靶点进行筛选,得到结合作用较好的中药单体成分甘草酸,应用DS Visualizer进行相关作用力分析,通过联合抑菌试验验证甘草酸与抗生素的联合抑菌作用,通过尼罗红外排试验、内膜质子梯度影响试验与外膜渗透稳定性试验验证甘草酸抑制外排泵转运子AcrB的作用机制,最后通过实时荧光定量PCR检测甘草酸对AcrB表达相关基因的影响。结果表明,甘草酸与AcrB蛋白多个氨基酸残基形成了疏水作用力,并且还与对接部位形成多个氢键,其结合作用力为47.720 4 kJ·mol^-1;3.125 mg·mL^-1甘草酸与头孢噻肟钠、磷霉素钠对大肠杆菌E320的FICI≤0.5,具有协同作用;甘草酸有明显阻滞尼罗红的外排作用且与已知的AcrB抑制剂PAβN具有相同的趋势;3.125 mg·mL^-1甘草酸对外膜渗透性、内膜质子梯度浓度均无明显影响;甘草酸能够显著提高负调控子AcrR、MarR mRNA的表达。综上表明,甘草酸具有成为降低多重耐药大肠杆菌耐药性外排泵抑制剂的潜质。     

禽巴氏杆菌链霉素耐药株转录组测序与分析

为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(Pm)链霉素(Str)敏感株与耐药株(MIC=1024μg/mL)在转录组水平上的差异,本研究采用RNA-seq技术对Str敏感株与耐药株进行双向测序,筛选得到差异表达基因,通过GO、KEGG和ARDB数据库对差异表达基因进行分组和富集性分析,并利用荧光定量PCR对筛选出的差异表达基因进行验证。结果显示,共筛选获得625个差异表达基因,其中包括581个上调基因和44个下调基因。通过GO功能富集分析显示差异表达基因多数发挥细胞膜转运功能;对差异表达基因进行信号通路富集性分析显示,大多数差异表达基因分布在ABC转运蛋白与双组分系统代谢途径中;采用ARDB对差异表达基因进行耐药基因分析,显示其中的耐药基因主要为氨基糖苷转移酶类和外排系统两类。本研究结果表明,禽源Pm对Str的耐药机制可能与细胞膜上多药外排泵的过量表达和氨基糖苷转移酶类灭活抗菌药物有关。同时,也为进一步研究禽源Pm对Str的耐药机制奠定了基础。     

利血平对化脓隐秘杆菌大环内酯类外排基因mefA表达的影响

化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种能够引起动物和人化脓性感染的重要病原菌。随着抗生素的广泛使用,该菌已对临床常用的大环内酯类、四环素类等药物产生不同程度的耐药性。本试验拟探讨外排泵抑制剂利血平对T.pyogenes大环内酯类外排基因mefA mRNA及蛋白表达的影响,将为细菌外排泵抑制剂的研究奠定理论基础。以携带mefA基因的T.pyogenes分离株(17,20号)为试验菌株,采用荧光定量PCR及Western blot技术,检测利血平作用前后各菌株mefA基因mRNA及蛋白表达量。结果表明,1/2 MIC利血平作用2株耐药菌株36 h后,大环内酯类抗生素红霉素、罗红霉素、泰乐菌素、阿奇霉素和替米考星对携带mefA基因的T.pyogenes的MIC值均有不同程度的降低。17和20号分离株外排基因mefA mRNA表达水平较药物作用前均极显著降低(利血平作用前是作用后的5.18,17.54倍),外排蛋白MefA表达量较药物作用前也显著降低(利血平作用前是作用后的1.08,1.70倍),且基因水平和蛋白水平的变化与其耐药表型的变化趋势一致;提示利血平可能是通过抑制外排基因mefA的转录和翻译而消减T.pyogenes对大环内酯类抗生素的耐药性。     

高渗对多重耐药大肠杆菌外排泵和外膜孔道蛋白基因表达及其生长的影响

为了探究高渗对多重耐药菌外排泵和外膜孔道蛋白基因表达及其生长的影响,试验应用生长曲线和相对适应性测定,对比考察不同盐胁迫条件对多重耐药大肠杆菌QL15和敏感大肠杆菌ATCC 25922的生长差异,采用RT-PCR方法考察2种盐胁迫条件下外排泵与外膜孔道蛋白基因表达差异。结果表明,大肠杆菌QL15为高水平多重耐药菌,其中对大观霉素和恩诺沙星耐药最为严重,可达耐药标准MIC的32倍;独立培养时大肠杆菌QL15对NaCl胁迫的敏感性大于大肠杆菌ATCC 25922,并且在6.0% NaCl胁迫下,大肠杆菌QL15在10 h内生长缓慢,但是在24 h细菌峰值浓度更高;混合培养时大肠杆菌QL15在6.0% NaCl胁迫时具有更高的适应性,在体外培养中更具竞争优势。大肠杆菌QL15共携带5大类、15种耐药相关基因,其中含8种外排泵基因和3种外膜孔道蛋白基因;大肠杆菌ATCC 25922在6.0% NaCl浓度下的5种基因表达量较3.5% NaCl均出现约50%的显著下调（P<0.05）,大肠杆菌QL15在6.0% NaCl浓度下除acrB、ompF基因下调外,其余3种外排泵与外膜孔道蛋白基因的表达量则显著上调（P<0.05）。推测大肠杆菌QL15对盐胁迫具有更高的适应性的原因可能与细胞膜相关蛋白的表达相关。     

鸭源致病性大肠杆菌四环素类耐药基因检测

对40株鸭源致病性大肠杆菌的四环素类耐药基因进行检测并分析,利用PCR技术扩增主动外排机制耐四环素类抗生素的耐药基因tet A、tet B、tet C、tet D、tet K、tet L。结果表明,tet B、tet A、tet C、tet D的检出率分别为80.0%、75.0%、55.0%、15.0%,tet K和tet L的检出率均为0%,tet B基因的检出率最高。     

小檗碱消除ESBLs大肠杆菌耐药性的研究

为了研究小檗碱消除超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠杆菌耐药性的效果，试验以3株ESBLs大肠杆菌作为研究对象，采用二倍稀释法测定小檗碱作用3株ESBLs大肠杆菌前后的MIC变化，然后采用琼脂糖凝胶电泳、ELISA法和实时荧光定量PCR方法分别检测小檗碱作用后大肠杆菌R质粒、ESBLs活性、生物被膜形成及外排系统AcrA mRNA、AcrB mRNA转录水平的变化。结果表明：3株ESBLs大肠杆菌对小檗碱的MIC均为2.00 mg/mL;经小檗碱作用后有2株ESBLs大肠杆菌对头孢噻肟的MIC从32.00 mg/mL降至8.00 mg/mL,有1株ESBLs大肠杆菌对头孢噻肟的MIC从32.00 mg/mL降至16.00 mg/mL。经小檗碱作用后有2株ESBLs大肠杆菌质粒条带消失2条，有1株ESBLs大肠杆菌质粒条带消失1条；3株ESBLs大肠杆菌的ESBLs活性均极显著降低(P<0.01),碱性磷酸酶活性均极显著升高(P<0.01);3株ESBLs大肠杆菌外排系统AcrA mRNA转录水平极显著降低(P<0.01),2株ESBLs大肠杆菌外排系统AcrB mR...     

氨基糖苷类抗生素耐药机制研究进展

分别从氨基糖苷类抗生素修饰酶、核糖体靶位修饰、药物的主动外排系统3个方面对近年来氨基糖苷类抗生素耐药机制的最新研究进展做以综述,以期为临床合理应用氨基糖苷类抗生素及控制致病菌氨基糖苷类耐药性提供参考。     

MarA和SoxS共同调节大肠杆菌K12外排泵AcrAB-TolC的表达

利用Red同源重组技术构建大肠杆菌K12调控基因缺失菌株,探讨耐药发展过程中marRAB和soxRS对大肠杆菌K12外排泵AcrAB-TolC表达的调控作用。在环丙沙星浓度递增的条件下诱导K12及调控基因缺失菌株,分别获得系列突变菌株,测定各菌株对其他药物的MIC,并检测靶位基因突变情况。利用RT-PCR方法检测诱导突变株中外排泵基因、调控基因、膜孔蛋白基因的表达水平。结果表明,K12正向调控基因(marA和soxS)缺失株在环丙沙星选择压力下仅获得环丙沙星敏感性降低的菌株,而负向调控基因(marR和soxR)在环丙沙星选择压力下可获得环丙沙星中介和耐药的菌株,且诱导突变株仅出现与耐药有关的gyrA单突变(Ser83Leu和Asp87His)。正向调控基因marA和soxS缺失后,外排泵基因表达水平变化不明显,而负向调控基因marR和soxR缺失后,marA和soxS的表达水平显著升高,引起外排泵基因表达水平显著升高,最高达到约13倍。当阻遏蛋白SoxR被敲除后,soxS的表达水平没有变化,而marA的表达水平显著升高,外排泵基因acrB表达水平也升高,说明在调控AcrAB-TolC外排泵基因表达方面,marRA与soxRS存在功能上的冗余,即当其中一个调控因子功能缺陷时,另一个调控因子可以发挥互补调控功能。因此,MarA和SoxS对三聚体系统AcrAB-TolC的正向调控作用是通过解除负向调控蛋白MarR和SoxR对其的阻遏作用实现的,MarRA和SoxRS共同调节外排泵AcrAB-TolC的表达水平。