大肠杆菌多药外输泵的研究进展

在细菌的耐药研究中,有关细菌主动外输泵的研究相对较多.目前,发现在细菌中至少存在50多种外输泵.大肠杆菌是主动外输泵最多的一种细菌,其中AerAB-TolC是最主要的、占绝对优势的多药外输系统,在多药耐药过程中起重要作用.     

MarA和SoxS共同调节大肠杆菌K12外排泵AcrAB-TolC的表达

利用Red同源重组技术构建大肠杆菌K12调控基因缺失菌株,探讨耐药发展过程中marRAB和soxRS对大肠杆菌K12外排泵AcrAB-TolC表达的调控作用。在环丙沙星浓度递增的条件下诱导K12及调控基因缺失菌株,分别获得系列突变菌株,测定各菌株对其他药物的MIC,并检测靶位基因突变情况。利用RT-PCR方法检测诱导突变株中外排泵基因、调控基因、膜孔蛋白基因的表达水平。结果表明,K12正向调控基因(marA和soxS)缺失株在环丙沙星选择压力下仅获得环丙沙星敏感性降低的菌株,而负向调控基因(marR和soxR)在环丙沙星选择压力下可获得环丙沙星中介和耐药的菌株,且诱导突变株仅出现与耐药有关的gyrA单突变(Ser83Leu和Asp87His)。正向调控基因marA和soxS缺失后,外排泵基因表达水平变化不明显,而负向调控基因marR和soxR缺失后,marA和soxS的表达水平显著升高,引起外排泵基因表达水平显著升高,最高达到约13倍。当阻遏蛋白SoxR被敲除后,soxS的表达水平没有变化,而marA的表达水平显著升高,外排泵基因acrB表达水平也升高,说明在调控AcrAB-TolC外排泵基因表达方面,marRA与soxRS存在功能上的冗余,即当其中一个调控因子功能缺陷时,另一个调控因子可以发挥互补调控功能。因此,MarA和SoxS对三聚体系统AcrAB-TolC的正向调控作用是通过解除负向调控蛋白MarR和SoxR对其的阻遏作用实现的,MarRA和SoxRS共同调节外排泵AcrAB-TolC的表达水平。     

大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制研究现状

大肠杆菌是典型的革兰氏阴性杆菌,其耐药谱广,耐药机制复杂,是国内外耐药性研究较为详细的细菌.大肠杆菌对氟喹诺酮药物的耐药性问题是当前国内外研究的热点.本文就大肠杆菌与氟喹诺酮耐药性有关的gyrA、gyrB、parC、parE点突变;多药外输泵;多重耐药基因;抗性质粒等方面的研究进展作一综述.     

不同动物源性大肠杆菌多重耐药调控基因SoxS的同源性分析

大肠杆菌多重耐药主要与其主动外排系统的过量表达、菌体细胞膜通透性的改变以及耐药性质粒的介导等因素有关.AcrAB-TolC外排泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统,其过量表达可使大肠杆菌对包括四环素、氯霉素、红霉素、β内酰胺类、利福平和氟喹诺酮类等的多种化合物耐受.     

AcrAB-TolC主动外排系统与猪源耐药大肠杆菌多重耐药的相关性

以前期获得的25株猪源耐药大肠杆菌为试验菌株,采用药敏纸片法测定以上分离菌株对氟苯尼考、多西环素、庆大霉素等11种药物的敏感性,并分析其多重耐药表型;采用PCR方法和实时荧光定量PCR方法分别检测25株猪源大肠杆菌中AcrAB-TolC主动外排基因的携带率以及不同耐药数量的多重耐药菌株的外排泵基因arA和acrB的表达量,同时分析其主动外排调控基因marA、soxS、robA和acrR相对表达量的差异,从mRNA水平上探讨外排泵基因表达量和调控因子与大肠杆菌多重耐药性的相关性。结果显示,25株耐药大肠杆菌中acrA、acrB和tolC等3种主动外排基因的携带率分别为68.00%、72.00%和76.00%;acrA、acrB这2种主动外排基因以及调控基因marA和soxS的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈正相关,调控基因acrR的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈负相关;robA调控基因的表达量均低于标准菌株,且与耐药谱数无明显相关性。结果表明,猪源耐药大肠杆菌携带acrA、acrB、tolC等3种基因主动外排基因的携带率较高,且与多重耐药菌株的耐药谱具有相关性;调控因子的表达量亦与多重耐药的耐药谱具有相关性。     

单一药物诱导大肠杆菌外输泵的确证

细菌是否具有药物外输系统,可通过加入能量抑制剂如DNP(2,4二硝基酚)或间-氯苯羰腙氰化物(CCCP)[1-4],检查药物摄取率增加与否测得.主动外排可通过脱能细胞蓄积的物质较含能细胞多而识别.可直接检测细胞摄取或定量分析物质从外环境中的去除,也可将蓄积了某种药物的细胞置入无药介质中,检测存在或不存在能量时药物自细胞的损失率或介质中药物出现率.从药物摄取角度间接估测外输泵的活动状况,是外输泵介导的大肠杆菌多重耐药性研究的重要环节.     

体外诱导和临床分离多重耐药大肠杆菌acrA和acrB基因无突变

临床分离的动物源性大肠杆菌的多重耐药株不断增多,多重耐药常与大肠杆菌外输泵有关,acrAB是最主要的外输泵.     

不同动物源性大肠杆菌多重耐药调控基因SdiA的同源性分析

为研究大肠杆菌多重耐调控基因SdiA与不同动物源性及多重耐药水平之间的关系,选取,临床分离的不同动物源性大肠杆菌5株及大肠杆菌药敏质控株ATCC25922,在对其进行主要治疗药物耐药性检测的基础上,分别以其染色体DNA为模板,通过PCR反应扩增出大肠杆菌多重耐药调控基因SdiA,将该片段分别与克隆载体pMD18-T连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,对经酶切与PCR反应鉴定为阳性的克隆质粒进行插入片段的核苷酸序列测定。测序结果表明不同动物源性大肠杆菌的SdiA基因的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GenBank中该基因序列的同源性较高,不同源性大肠杆菌的SdiA基因的核苷酸序列及氨基酸序列变化与其动物源性无关,该基因的核苷酸序列及氨基酸序列的个别突变位点可能影响AcrAB-TolC外排泵的表达水平,进而影响其多重耐药水平。     

加减三黄汤对耐药大肠杆菌acrA mRNA表达水平的影响

为了解加减三黄汤对大肠杆菌耐药性的影响,采用实时荧光定量方法检测了外输泵acrA mRNA表达水平的变化。将100只昆明系小鼠分为阳性组(感染耐药性大肠杆菌2 751株和2 952株),阴性组,攻毒治疗组(2 751株+加减三黄汤,2 952株+加减三黄汤),8d后将鼠随机剖杀,取肝组织抹片培养大肠杆菌,做药敏试验,同时提取质粒,检测大肠杆菌外输泵基因acrA的mRNA表达量。结果显示,经加减三黄汤在体治疗后的大肠杆菌耐药性下降了,每μL中mRNA拷贝数为2 751株最高达1016,2 952株1015;用药后各菌株均有下降;相差极显著(P≤0.01),耐药性越大的拷贝数越多。表明加减三黄汤对耐药大肠杆菌外输泵基因acrA的mRNA表达水平影响与耐药性有一定的相关性。     

安妥沙星体外诱导大肠埃希菌耐药研究

为了探讨耐药外排泵AcrAB-TolC在大肠埃希菌对安妥沙星的诱导耐药中的发生机制,试验采用微量肉汤稀释法测定安妥沙星对大肠埃希菌标准菌株(ATCC25922)的最小抑菌浓度(MIC),以1/2 MIC为起点采用浓度递增法对ATCC25922进行体外诱导,并将诱导后的细菌在不含药的培养基上传代培养5次,每次传代后测定MIC值,以获得稳定耐药的菌株。并检测安妥沙星诱导前后大肠埃希菌株外排泵AcrAB-TolC基因序列的突变和mRNA表达量的变化。结果表明,诱导后的耐药菌株acrA有8处、acrB有40处、tolC有27处发生了碱基突变,其中acrB和tolC所编码的氨基酸序列也发生了改变,并且诱导后的菌株耐药外排泵AcrAB-TolC的基因acrA、acrB、acrZ、tolC的mRNA表达量极显著增加。     

竞争性RT-PCR在定量分析沙门菌acrA基因mRNA表达中的应用

应用竞争性RT-PCR技术测定mRNA的表达量,具有高灵敏度、快速、准确、简单等优点,它是Gilland等人于1990年首先发明的,现在已经得到了广泛应用.Girud等人研究表明,沙门菌存在由acrAB外输泵介导的耐药机制,外输泵的活动性与耐药水平有一定的相关性.     

大肠杆菌群体感应系统的研究进展

群体感应(quorum sensing,QS)是细菌中以种群规模进行特定交流的方式,通过这一机制,细菌以多细胞形式发挥不同生物学功能。群体感应参与对致病菌毒力因子表达、与宿主互作、抗生素耐药性及细菌素合成等方面的调控,与细菌生理特性密切相关。大肠杆菌是广泛存在于自然界中的一类菌株,致病性大肠杆菌可导致人与动物严重腹泻或肠道外疾病。群体感应与大肠杆菌密切相关,现将大肠杆菌群体感应系统分为5类,对其最新研究进展进行综述,为进一步探索大肠杆菌致病机制打下基础。     

福氏志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR从志贺菌基因组DNA中扩增得到志贺菌外输调节蛋白基因marA,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建原核表达重组质粒pET-30a-marA,重组子经限制性内切酶分析、PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果经鉴定证实原核表达载体pET-30a-marA构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了MarA与His的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。结论MarA在大肠杆菌中获得了高效的表达,为进一步研究其免疫学特性和功能奠定了基础。     

甘草酸对多重耐药大肠杆菌的抗菌增敏作用

多药外排泵转运子AcrB是大肠杆菌产生多重耐药性（MDR）的重要原因和生物学基础。筛选针对大肠杆菌外排泵AcrB的抑制剂有助于解决大肠杆菌多重耐药问题,本试验借助虚拟筛选工具AutoDock Vina以大肠杆菌多药外排泵转运子AcrB为靶点进行筛选,得到结合作用较好的中药单体成分甘草酸,应用DS Visualizer进行相关作用力分析,通过联合抑菌试验验证甘草酸与抗生素的联合抑菌作用,通过尼罗红外排试验、内膜质子梯度影响试验与外膜渗透稳定性试验验证甘草酸抑制外排泵转运子AcrB的作用机制,最后通过实时荧光定量PCR检测甘草酸对AcrB表达相关基因的影响。结果表明,甘草酸与AcrB蛋白多个氨基酸残基形成了疏水作用力,并且还与对接部位形成多个氢键,其结合作用力为47.720 4 kJ·mol^-1;3.125 mg·mL^-1甘草酸与头孢噻肟钠、磷霉素钠对大肠杆菌E320的FICI≤0.5,具有协同作用;甘草酸有明显阻滞尼罗红的外排作用且与已知的AcrB抑制剂PAβN具有相同的趋势;3.125 mg·mL^-1甘草酸对外膜渗透性、内膜质子梯度浓度均无明显影响;甘草酸能够显著提高负调控子AcrR、MarR mRNA的表达。综上表明,甘草酸具有成为降低多重耐药大肠杆菌耐药性外排泵抑制剂的潜质。     

不同动物源性大肠杆菌多重耐药调控基因rob的同源性分析

为研究大肠杆菌多重耐药调控基因rob与不同动物源性及多重耐药水平之间的关系，选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌5株及大肠杆菌药敏质控株ATCC25922，在对其进行主要治疗药物耐药性检测的基础上，分别以其染色体DNA为模板，通过PCR反应扩增出大肠杆菌多重耐药调控基因rob，将该基因分别与克隆载体pMD18-T连接，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，对经酶切与PCR反应鉴定为阳性的克隆质粒进行了核苷酸序列测定。测序结果表明：不同动物源性大肠杆菌的rob基因与Gen-Bank中该基因的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列的同源性较高。不同源性大肠杆菌的rob基因的核苷酸序列与其动物源性有关，该基因的核苷酸序列的个别突变位点可能影响AcrAB外输泵的表达水平，进而影响其多重耐药水平。     

沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达致死大肠杆菌的初探

为探究沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达对大肠杆菌宿主菌的影响,本研究将鼠伤寒沙门氏菌flhDC基因克隆于具有超强调控能力的pN15E6质粒中,通过观察重组大肠杆菌在对照和含IPTG诱导剂培养基中的生长情况,初步判定flhDC基因过表达对大肠杆菌的影响。结果显示过表达flhDC双基因致死大肠杆菌宿主菌,而过表达flhD或flhC单个基因不致死宿主菌,同一细胞中同时过表达flhD和flhC两个基因致死宿主菌;为探究沙门氏菌flhDC基因在大肠杆菌中的调控功能,本实验将flhDC基因克隆于具有严谨调控能力的p BAD33质粒中,通过测定含不同浓度阿拉伯糖半固体培养基上重组大肠杆菌菌落的直径,评估沙门氏菌flhDC在大肠杆菌宿主菌中调控鞭毛活性的能力。结果显示在一定范围内随着阿拉伯糖诱导剂浓度的提高,重组菌动力增大。表明沙门氏菌flhDC基因在低浓度表达时可以促进大肠杆菌宿主菌鞭毛活性。本实验为进一步研究flhDC基因过表达致死宿主菌的机理奠定了基础。     

鸡大肠杆菌O78对喹诺酮类药物高耐药株的分子鉴定

就临床分离的鸡大肠杆菌O78对喹诺酮类药物的最低抑菌浓度（MIC）进行了测定，得到对喹诺酮类药物有不同耐药水平的细菌23株。根据GenBank已公布的QRDRs序列，设计了分剐扩增gyrA、gyrB、parC和parE基因的4对引物，以筛选的23株耐药菌DNA为模板，进行了PCR扩增。序列分析及AcrA的Western blotting检测结果表明，临床分离的鸡大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药水平与GyrA和ParC的突变密切相关，而AcrAB外输泵的表达水平无显著变化。提示临床分离的鸡大肠杆菌O78的耐药水平与喹诺酮类药物的选择性压力有关，它诱导了DNA旋转酶和拓扑异构酶IV的基因突变，可能不能激活AcrAB外输泵。     

致病性大肠杆菌毒力基因调控的研究进展（二）

本文接上文继续就致病性大肠杆菌毒力因子协调表达的调控机理和纤毛表达，溶血素表达以及英膜表达的调控进行了综述。     

赤芍水提物及芍药苷对大肠杆菌抗菌增敏活性的影响

旨在考察中药赤芍水提物及其主要成分芍药苷对磷霉素钠的抗菌增敏活性,验证芍药苷对外排泵转运子AcrB的抑制作用,推测其抗菌增敏机制。首先,通过微量棋盘稀释法检测赤芍水提物及其主要成分芍药苷与磷霉素钠联合应用对临床分离的禽多重耐药大肠杆菌E320和质控菌株大肠杆菌ATCC35218的抑菌作用;其次,利用YASARA软件,以大肠杆菌多重耐药AcrAB-TolC系统中的外排泵转运子AcrB为靶标,与芍药苷进行分子对接模拟,探讨两者的识别机制;通过尼罗红外排试验验证芍药苷对外排泵的抑制作用;最后,通过实时荧光定量PCR验证芍药苷降低AcrB mRNA的表达量进而发挥抗菌增敏作用。试验结果证实赤芍水提物和芍药苷与磷霉素钠联合用药均具有协同抑制多重耐药大肠杆菌E320的作用(FICI≤0.5);分子对接结果显示芍药苷与AcrB蛋白受体的结合能达到8.333 kJ/mol,作用主要位点是AcrB蛋白受体上Phe628、Phe615、Val612、Ile277、Asn274、Gly179、Phe178等氨基酸残基,分子间主要作用力为疏水作用力;外排抑制试验结果显示芍药苷可以抑制耐药大肠杆菌外排泵活性,明显阻滞尼罗红的外排;实时荧光定量PCR结果显示芍药苷联合磷霉素钠比单独使用磷霉素钠显著降低大肠杆菌AcrB mRNA的表达量。本试验证明芍药苷通过作用外排泵转运子AcrB,使抗生素在菌体内积聚;并能显著降低AcrB mRNA的表达量进而起到抗菌增敏作用,为临床提供一种有效的抗菌增敏剂,对治疗耐药菌引起的细菌感染具有重要意义。     

F18大肠杆菌抗性型与敏感型苏太断奶仔猪十二指肠组织比较转录组分析

旨在揭示培育品种—苏太猪(杜洛克×梅山猪)F18大肠杆菌抗性的调控通路和重要候选基因,同时进一步探究中外猪品种F18大肠杆菌抗性调控遗传基础的差异。本研究以课题组前期获得的苏太猪和梅山猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型断奶仔猪全同胞个体为研究对象,通过转录组测序筛选苏太猪F18大肠杆菌抗性相关的调控通路以及重要候选基因,并在细胞水平,利用qPCR和Western blot分析F18大肠杆菌刺激小肠上皮细胞IPEC-J2后重要候选基因(蛋白)的表达变化,同时利用qPCR检测重要候选基因在苏太和梅山断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型个体十二指肠组织中的差异表达情况。结果显示:1)在苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型个体中筛选出238个差异表达基因,主要参与Toll样受体信号通路(toll-like receptor signaling pathway)和糖脂类通路(glycosphingolipid biosynthesis-lacto and neolacto series),其中TLR5、IL-1β、FUT2为重要候选基因;2)不同血清型F18大肠杆菌(F18ac、F18ab)菌体分别刺激小肠上皮细胞IPEC-J2后,FUT2、IL-1β、TLR5基因mRNA表达水平显著上调(P0.05),并且其蛋白表达水平也表现为明显的上调,由此表明,TLR5、IL-1β和FUT2在断奶仔猪F18大肠杆菌感染过程中发挥重要的调控作用;3)组织差异表达分析显示,TLR5、IL-1β和FUT2在苏太猪抗性型与敏感型个体十二指肠组织中表达差异均达到显著水平(P0.05),而梅山猪中TLR5、IL-1β表达差异达到极显著水平(P0.01),FUT2表达水平差异不显著(P0.05)。结合课题组前期关于梅山猪及外来引进品种F18大肠杆菌抗性相关分子机制研究及报道,本研究进一步证明中外猪品种F18大肠杆菌抗性调控的遗传基础确实存在差异,Toll样受体信号通路及CD14、TLR5等基因可能在中国地方品种—梅山猪抵抗F18大肠杆菌感染过程中发挥着免疫调控作用,而鞘糖脂合成通路及FUT2等基因可能在外来猪品种F18大肠杆菌受体形成过程中起关键作用。