金潮原因种铜藻外源无机碳利用特征初步研究

为揭示铜藻(Sargassum horneri)对无机碳利用的基本特性及铜藻在漂浮过程中生物量迅速累积并最终发展为金潮的生理生态学机理,以我国近海金潮原因种铜藻为研究对象,在不同pH (6.5、8.0和9.5)条件下研究了添加TRIS缓冲剂、碳酸酐酶抑制剂(AZ、EZ)和阴离子交换蛋白抑制剂(DIDS)后藻体的固碳速率、光合作用-无机碳响应曲线(P-C曲线)及pH漂移曲线。结果显示,TRIS缓冲剂对铜藻的固碳速率无显著影响(P>0.05),而3种抑制剂均显著(P<0. 05)抑制铜藻的固碳速率且抑制效率从大至小依次为DIDS> EZ>AZ。藻体的固碳速率随着外源无机碳浓度的增加而增加,并渐趋饱和。此外,藻体的最大固碳速率(V_max)随着pH的升高而降低,而半饱和常数(K_0.5)则随着pH的升高而升高,藻体的pH补偿点为9.0左右。结果表明,铜藻既可以利用海水中的CO_2也可以利用HCO_3^-进行光合作用;并且铜藻对HCO_3^-的吸收存在通过阴离子交换蛋白直接转运吸收和利用碳酸酐酶将HCO_3^-转化为CO_2后再吸收两种方式。对HCO_3^-的高效吸收利用能力可能是铜藻保证维持较高光合作用、快速积累生物量并最终演变为金潮的重要因素之一。     

抗生素对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻生长的影响

为抑制萱藻丝状体扩增过程中出现的膨胀色球藻的生长,采用实验生态学方法,研究了链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素和氯霉素等5种常用抗生素对共培养条件下的萱藻丝状体和膨胀色球藻生长的影响。结果显示,(1)链霉素浓度为100μg/mL时可以显著抑制膨胀色球藻生长,而不影响萱藻丝状体的生长;(2)氨苄青霉素和庆大霉素对膨胀色球藻产生明显抑制作用的浓度均为100μg/mL,对萱藻丝状体产生抑制作用的浓度分别为100和500μg/mL;(3)10μg/mL卡那霉素可强烈抑制膨胀色球藻生长,而萱藻丝状体没有出现被抑制的现象;(4)氯霉素对膨胀色球藻和萱藻丝状体均有较强的抑制作用,10μg/mL可以对膨胀色球藻的生长产生显著抑制,浓度达到50μg/mL后,萱藻丝状体生长受到抑制。研究表明,链霉素(100μg/mL)、卡那霉素(100μg/mL)和氯霉素(10μg/mL)可以用于降低萱藻种质保存和扩增过程中萱藻丝状体被膨胀色球藻污染的风险。     

萱藻丝状体的种质保存技术

采用液体保存法和胶囊化低温保存法对萱藻丝状体进行保存,探讨了液体培养法中温度、光照强度以及胶囊化低温保存法中胶球含水量对萱藻丝状体种质保存的影响。结果显示:(1)在液体保存法中,温度对萱藻丝状体的保存影响较小,当光强为5.4μmol/(m2·s)时,6~18℃均可实现萱藻丝状体的长期保存;(2)光照强度对萱藻丝状体的液体保存影响显著,16.2μmol/(m2·s)及以上的光强不利于种质的保存,5.4μmol/(m2·s)对萱藻丝状体的液体保存最有利;(3)在6~18℃,5.4μmol/(m2·s)条件下保存萱藻丝状体60 d后,萱藻丝状体细胞状态良好且存活率仍在97%以上;(4)胶球含水量过高或过低均会降低萱藻丝状体胶囊化低温保存后的存活率,15%是萱藻丝状体胶球的最适含水量,在该条件下,萱藻丝状体保存1个月后的存活率仍在50%以上。研究证明,在适宜条件下,液体保存法和胶囊化低温保存法均可实现萱藻丝状体的种质保存。     

五种培养液对萱藻丝状体生长发育的影响

提要 本文以实验室保存的萱藻丝状体为材料,采用实验生态学方法,探讨了L1、PES、F1、f/2以及ESNW等五种培养液对萱藻丝状体生长发育的影响,并以去除氮或磷成分的L1培养液为基础,研究了不同外加浓度氮和磷对萱藻丝状体生长发育的影响。结果显示:(1)五种培养液中,L1培养液最有利于萱藻丝状体的生长发育,培养28天后,丝状体生物量增重倍比可达560.48%,孢子囊枝比例高达46.88%,孢子囊直径为18.95μm;(2)萱藻丝状体生长发育最适添加NO3--N浓度为6.00mg/L,在此NO3--N浓度条件下,萱藻丝状体生长速度最快,培养20天后,孢子囊枝比例高达46.78%,孢子囊直径可达18.78μm。在添加NO3--N浓度为0.00mg/L和高氮(96.00mg/L、192.00mg/L)条件下,萱藻丝状体生长速度均相对较慢,培养20天后,孢子囊枝比例分别仅为0.00%、9.06%和7.65%,孢子囊直径仅9.00~10.00μm;(3)萱藻丝状体生长发育的最适外加PO43--P浓度为1.32mg/L,在此PO43--P浓度条件下,萱藻丝状体生长速度最快,培养20天后,孢子囊枝比例高达47.12%,孢子囊直径可达18.89μm。外加PO43--P为0.00mg/L时,培养20天后,孢子囊枝比例仅为10.12%,孢子囊直径仅有9.78μm。外加PO43--P高于15.84mg/L时,均没有孢子囊枝的形成。研究证明,在萱藻丝状体的生长发育过程中,选择一种合适的培养液以及适时地控制硝酸盐与磷酸盐的浓度,使其维持在一定范围内,从而促进萱藻丝状体的快速生长,提高其孢子囊枝比例、增大孢子囊直径。     

四种抗生素对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻的影响

为抑制或消除萱藻丝状体扩增阶段出现的膨胀色球藻,本研究探讨了头孢噻肟钠、阿莫西林、四环素和红霉素4种抗生素对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻产生的影响。结果显示,浓度为50和100 mg/L的头孢噻肟钠均显著抑制膨胀色球藻的生长,进而保证萱藻丝状体正常生长与发育;浓度为50~1 000 mg/L的阿莫西林对膨胀色球藻和萱藻丝状体均无抑制作用,阿莫西林不适于去除共培养体系中的膨胀色球藻;浓度为100和200 mg/L的四环素对膨胀色球藻有显著的抑制作用,但此浓度下萱藻丝状体细胞质萎缩,生长状况较差;浓度为0.10~1.00 mg/L的红霉素对膨胀色球藻的生长均有显著的抑制作用,但当其浓度超过0.50 mg/L时,萱藻丝状体的生长亦受到抑制,甚至死亡。     

应用响应曲面法优化萱藻丝状体扩增条件

为优化萱藻丝状体扩增条件,提高萱藻丝状体的扩增速率,本研究以实验室萱藻种质库保存的丝状体为实验材料,在单因素实验的基础上,应用Box-Behnken设计对萱藻丝状体扩增条件进行了响应曲面优化探索。以增重倍比为指标,确定了扩增萱藻丝状体的最佳条件：温度20.45℃, 光照强度78.13μmol/(m_².s),外加氮磷比16.19。在该条件下扩增10d,萱藻丝状体增重倍比为(299.21%±13.58%),显著高于单因素实验和Box-Behnken设计实验条件下获得的萱藻丝状体增重倍比。实验结果与理论预测值的相对误差小于5%,模型可靠。为评价优化培养后萱藻丝状体的发育情况,对丝状体进行了20d的诱导,结果显示：优化培养后的萱藻丝状体呈深褐色,细胞质充盈,孢子囊比例(26.37%±5.22%)比对照组的孢子囊比例(18.10%±3.51%)提高了45.69%；优化条件下的孢子囊直径平均为(19.75μm±0.21μm),高于对照组的孢子囊直径(16.91μm±0.36μm)。本研究结果表明,在萱藻丝状体扩增过程中,对扩增环境条件进行有目的性的调控,设置合适的营养盐浓度配比,不仅可以实现较高的扩增速率,还可以促进丝状体的孢子囊发育。     

光照对中国南北方萱藻丝状体生长发育影响的比较

通过分离、培养我国北方海域(烟台、青岛)和南方海域(舟山、温州)的萱藻丝状体,比较研究了不同光强[7.2、21.6、36.0、50.4、64.8、86.4、108.0和129.6μmol/(m2·s)]和不同光周期(8L:16D、10L:14D、12L:12D、14L:10D和16L:8D)对我国南北方萱藻丝状体生长及发育的影响。结果表明:(1)过高[≥108.0μmol/(m2·s)]或过低[≤21.6μmol/(m2·s)]光强条件均不利于我国南北方萱藻丝状体的快速生长;(2)我国南北方萱藻丝状体生长的最适光强条件相同,在64.8μmol/(m2·s)条件下培养20 d后,其丝状体的增重倍比和日均增长率均达到最大值;(3)我国南北方萱藻丝状体发育的最适光强条件均为36.0μmol/(m2·s),培养20 d后,烟台、青岛、舟山和温州的萱藻丝状体的孢子囊枝比例均达到最大值,分别为34.72%±0.91%、35.06%±1.17%、35.37%±0.59%和34.33%±0.41%;(4)我国南北方萱藻丝状体生长的最适光周期条件不同,培养20 d后,北方萱藻丝状体的增重倍比和日均增长率均在14L:10D条件下达到最大值,分别为82.75%±2.39%、3.00%±0.36%和81.28%±4.53%、3.04%±0.49%,而南方均在16L:8D条件下达到最大值,分别为89.52%±0.88%、3.18%±0.30%和88.66%±7.09%、3.22%±0.26%;(5)经过20 d的培养观察,我国北方萱藻丝状体发育的适宜光周期范围为8L:16D~10L:14D,而南方的适宜光周期范围为10L:14D~12L:12D。     

二氧化锗对共培养萱藻丝状体和硅藻生长的影响

为抑制萱藻丝状体保存和扩增过程中出现的小伪菱形藻与碎片菱形藻的生长,本实验应用实验生态学方法,分别建立了丝状体与小伪菱形藻、丝状体与碎片菱形藻、丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系,研究了1.00～4.00μg/mL二氧化锗(GeO_2)对共培养条件下丝状体生长发育及附生硅藻生长的影响。结果显示:(1)处理萱藻丝状体和硅藻共培养体系的适宜GeO_2浓度为1.00～2.50μg/mL,各实验组14 d的硅藻抑制率均高于67.33%±5.18%,且丝状体生长发育良好,2.00μg/mL为最适浓度,此浓度下丝状体日均增长率最高,在各培养体系中均大于11.00%,且诱导后孢子囊枝比例和孢子囊直径分别为57.47%±5.31%和(24.55±1.01)μm,与对照组差异不显著;(2) 3.50和4.00μg/mL GeO_2虽对硅藻抑制效果更佳,但同时也会抑制丝状体生长和后期孢子囊的形成与发育,其中4.00μg/mL GeO_2可导致丝状体死亡;(3)碎片菱形藻较小伪菱形藻对GeO_2更敏感。实验14 d,各浓度GeO_2对碎片菱形藻的抑制率为(82.10%±2.40%)～(96.35%±0.79%),均高于同浓度GeO_2对小伪菱形藻的抑制率;同时在丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系中,碎片菱形藻占硅藻比例随GeO_2浓度升高而相应下降。     

萱藻生活史中盘状体阶段生长特性

于2006年3-5月在大连沿海萱藻[Scytosiphon lomentaria(Lyngbye)Link]的繁殖期内,采集具有多室配子囊的成熟萱藻,采用阴干刺激方法获得配子并在室内培育形成盘状体.观察结果显示,在20℃和15℃下,盘状体表面细胞生长出丝状体和叶状体.叶状体经生长后沿藻体纵轴裂开又形成了丝状体.丝状体上与基质接触的细胞进行放射状分裂形成盘状体,未与基质接触的细胞在继续分裂增加藻体长度的同时,在丝状体上形成了许多节状细胞团,节状细胞团与基质接触后向周边分裂又形成了盘状体.由丝状体形成的盘状体在15℃和10℃下培养2个月后形成了单室孢子囊.单室孢子囊成熟后经阴干刺激可放出游孢子,游孢子附着后萌发为直立管状萱藻幼苗.实验结果表明,在萱藻生活史中的盘状体阶段还存在盘状体→丝状体→盘状体与盘状体→叶状体→丝状体→盘状体2个循环.盘状体阶段这2个循环的存在,改变了从配子或合子获得盘状体的单一途径.利用丝状体游离培养生长速度快以及节状细胞团切碎后能在短时间内形成盘状体的特性,在室内进行人工增殖丝状体,当节状细胞团出现后将丝状体切碎,可以获得大量盘状体,通过室内培养使盘状体形成孢子囊并放出孢子,经孢子采苗后在室内培育出萱藻幼苗.本研究旨在为萱藻人工育苗探索一条新路.     

光强对萱藻孢子萌发、幼苗早期发育及附生藻类动态变化的影响

模拟萱藻育苗条件,以萱藻丝状体为材料,沙滤天然海水作为培养液,研究了光照强度[7.2~126.0μmol/(m2·s)]对萱藻孢子萌发、幼苗早期发育及附生藻类动态变化的影响。结果显示:(1)本实验条件下,萱藻孢子萌发的适宜光强范围为27.0~72.0μmol/(m2·s)。其中,在45.0μmol/(m2·s)条件下,萱藻孢子萌发率较高,并在放散后的第16天萌发率达到(44.44%±11.00%);(2)在本实验条件下,萱藻幼苗早期生长的适宜光强范围为36.0~54.0μmol/(m2·s),其中45.0μmol/(m2·s)最适宜萱藻幼苗的生长,且附生藻类密度最低,孢子放散后第34天附生藻类密度为(38.4±0.6)×104个/cm2;(3)本研究共鉴定出附生藻类2门13属29种,主要优势种为碎片菱形藻、小伪菱形藻、艳绿颤藻、膨胀色球藻、耳形藻和新月菱形藻。其中碎片菱形藻在7.2~18.0μmol/(m2·s)条件下呈指数增长,而耳形藻与新月菱形藻在27.0~126.0μmol/(m2·s)条件下呈指数增长。研究表明,萱藻孢子萌发和幼苗早期发育的最佳光强为45.0μmol/(m2·s),且在萱藻育苗过程中应重点防治的附生藻类为耳形藻与新月菱形藻。     

小新月菱形藻碳酸酐酶活性和光合作用对高盐度胁迫的响应

以浮游硅藻小新月菱形藻为实验材料,研究其在不同盐度下的生长、胞外碳酸酐酶活性、光合速率和叶绿素a荧光参数的变化。结果显示,与正常海水培养相比,最高盐度(70)培养的细胞比生长速率下降了59.2%;同时,胞外碳酸酐酶活性、叶绿素a、c含量分别降低了66.3%、50.0%和45.7%。高盐度培养下,最大光合速率(P_{m)、光合效率(α)、最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学效率(Yield)和光化学淬灭系数(qP)下降,但非光化学淬灭系数(qN)升高,对无机碳的亲和力明显下降。以上结果表明,盐度升高对小新月菱形藻生长和光合作用具有明显抑制作用,但小新月菱形藻可以通过胞外碳酸酐酶活性变化、对无机碳的亲和力和调整光系统Ⅱ的能量流动与能量利用效率以应对高盐度的胁迫。}     

坛紫菜自由丝状体对无机碳的利用

Free-living Porphyra haitanensis conchocelis was cultured under continual light,then it was treated with Van,DIDS and SITS,the inhibitors of inorganic carbon utilization,to study the mechanism of inorganic carbon utilization in the conchocelis.The results indicate that Van inhibits the utilization of inorganic carbon most,with a rate of 71.3%,and the rates of DIDS and SITS are relatively lower,42% and 35.5% respectively.The inhibition rate of Az is 25.3%,which indicates the external CA is not an important part of its inorganic carbon uptake.A complementary conclusion is that the main part of inorganic carbon absorption in P.haitanensis conchocelis is through active transport of HCO3^- and CO2.     

海带配子体碳酸酐酶(CA)基因的克隆及其特征分析

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库2个长为376 bp的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),Blastn搜索发现它们与掌状海带的碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)基因序列(GenBank登录号:AJ130777)有70%的相似性,结合该EST以及掌状海带CA基因保守序列设计引物,扩增得到海带配子体CA基因部分开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,再以此为基础设计基因特异性引物,然后利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆得到一条长2 804 bp的cDNA序列(GenBank登录号:JF827608),其中5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长166 bp,3′-UTR长1 765 bp,且具有明显的polyA尾巴,ORF长873 bp。它编码一个由290个氨基酸组成的前体蛋白,预测在20 Gly-21 Val处有一个典型的信号肽酶切位点,酶切后的成熟蛋白由270个氨基酸组成,具有3个锌结合的His残基所构成的催化活性中心,其分子量为30.44 ku,等电点为5.06。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体CA基因都没有差异,且无内含子。Southern-blotting杂交结果显示,海带配子体CA基因为单拷贝基因。蛋白同源性搜索,发现该基因的编码蛋白与掌状海带的α-CA蛋白有87%的同源性。基于36个CA蛋白的氨基酸序列所构建的邻接(Neighbor-Joining)系统进化树显示,自海带配子体中所克隆的CA基因位于α-CA蛋白所组成的一支,推测它可能为α-型,因而不在线粒体中起作用。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)结果表明,在增加CO₂浓度的条件下,CA基因在海带雌、雄配子体中的日表达量均较未增加的条件下有所增加,由此推测该CA基因不属于胞外CA;基于海带配子体CA蛋白仅具有一个信号肽,可以推测它是定位于叶绿体外膜上,以泵的方式为叶绿体光合作用提供充足的CO₂。     

海带配子体γ-碳酸酐酶的基因克隆与功能鉴定

本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)等技术获得海带配子体细胞一个γ-亚型碳酸酐酶(CA)基因的cDNA及DNA全长序列。其cDNA长为1618 bp,编码由305个氨基酸组成的蛋白;DNA长为11812 bp,具6个内含子,将开放阅读框(ORF)分割成7个外显子;其具有一个gamma-CA的结构域,并具有一个独特的左手平行β-螺旋结构域;由36个CA的氨基酸序列所构建的聚类图显示,该CA与其他物种的γ-CA聚为一支。因而,将该克隆的基因命名为Sjγ-CA。为了解其编码蛋白的功能,将Sjγ-CA的ORF亚克隆至表达载体pET28a上,导入大肠杆菌表达菌株BL21中,培养并诱导目的基因表达,亲和层析以纯化重组蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)、免疫印迹和质谱技术鉴定结果表明,纯化所获得的重组蛋白是Sjγ-CA。利用电极法和分光光度计法分别检测重组的Sjγ-CA在CO2与示,重组Sjγ-CA的水合酶比活力为0.82 U/mg,但没有酯酶活性,从而从功能上鉴定了Sjγ-CA。该研究为后续探讨Sjγ-CA在海带配子体乃至孢子体细胞或组织中的亚细胞定位等研究奠定了基础。     

盐碱胁迫对尼罗罗非鱼鳃Na+/HCO3-共转运子、碳酸酐酶基因表达的影响

为了探讨盐碱胁迫条件下鱼类渗透生理调节机制,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为实验材料, PCR扩增得到了Na⁺/HCO₃^-共转运子(NBCe1)基因cDNA部分序列,比较了单盐(盐度10、盐度15)、单碱(1.5 g/L、3 g/L NaHCO₃)、盐碱混合(盐度10,碱度1.5 g/L;盐度15,碱度3 g/L)胁迫后不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h)血清渗透压、离子浓度(Na⁺、K⁺、Cl^-、Ca²⁺)以及鳃碳酸酐酶(CA)活性、CA与NBCe1基因mRNA表达变化。结果显示,不同胁迫条件下,血清渗透压、离子浓度、鳃组织CA酶活、CA与NBCe1基因mRNA表达变化均与胁迫强度呈正相关。随时间推移,血清渗透压、离子浓度呈现先上升后下降的变化趋势,单盐、盐碱混合组血清渗透压值较单碱组高。单盐、单碱、盐碱混合组中, NBCe1基因mRNA在鳃中均呈略微上调,但不显著(P>0.05)。单碱组和盐碱混合组鳃CA活性较单盐组高,低盐碱胁迫(盐度10,碱度1.5 g/L)下CA活性较晚达最高值;不同胁迫条件下, CA基因mRNA表达均表现上调,单碱、盐碱混合组更为显著(P<0.05),推测CA较NBCe1对体内HCO₃^-转运作用更为显著。研究结果为尼罗罗非鱼盐碱适应生理调节提供了基础资料。     

The conversion of plasma HCO 3 − to CO2 by rainbow trout red blood cells in vitro: adrenergic inhibition and the influence of oxygenation status

This study employed a recently developed radioisotopic assay (Wood and Perry 1991) to examine the inhibition, induced by catecholamines, of the conversion of plasma HCO ₃ ^– to CO₂ in acidotic trout blood, and the influence of oxygenation status on the response. Blood was incubated in vitro at P_{CO 2}= 2 torr, and 10^–6 M noradrenaline was employed as the adrenergic stimulus. In particular we investigated whether the inhibition of plasma HCO ₃ ^– conversion could be explained by a limited supply of H⁺s for the intracellular HCO ₃ ^– dehydration reaction because of competition by the adrenergically activated Na /H⁺ exchanger. Hypoxia (P_{O 2}= 15 torr) was employed as a tool to intensify this competition. Hypoxia raised RBC pHi, pHe, and plasma total CO₂ concentration (C_{CO 2}) by the Haldane effect, and increased the magnitude of Na⁺/H⁺ activation, expressed as the change in the transmembrane pH gradient (pHe-pHi). However hypoxia did not alter the inhibition of the conversion of plasma HCO ₃ ^– to CO₂ caused by noradrenaline. Hypoxia itself stimulated the RBC-mediated conversion of plasma HCO ₃ ^– to CO₂ by about 20% in the presence or absence of noradrenaline. The conversion rate was strongly correlated with pHe, pHe-pHi, and plasma C_{CO 2} in these experiments, but not with pHi. We conclude that adrenergically mediated inhibition in the conversion of plasma HCO ₃ ^– to CO₂ by trout RBCs is not due to competitive limitation on intracellular H⁺s, but rather to changes in the electrochemical gradient for HCO ₃ ^– entry and/or to CO₂ recycling from plasma to RBC. The deoxygenated condition helps to promote CO₂ excretion at the level of the RBC.     

三角帆蚌不同蚌龄外套膜细胞的增殖能力及其矿化功能

研究了淡水珍珠贝——三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)在不同蚌龄下外套膜组织的细胞增殖及生物矿化相关因子活性。选择5组不同蚌龄三角帆蚌(0.5龄、1龄、2龄、3龄、4龄),通过流式细胞技术分析了外套膜细胞的增殖指数(proliferation index,PrI)和胞内Ca~(2+)浓度,并应用实时荧光定量PCR检测了与生物矿化相关的碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)基因的表达并测定其酶活性。结果表明, 2龄蚌的外套膜细胞PrI及胞内Ca~(2+)浓度显著高于其他蚌龄(P0.05);生物矿化相关基因在不同蚌龄的外套膜组织中表达量不同, 1龄三角帆蚌CA基因表达量和CA酶活性最高(P0.05), ALP基因表达量和ALP酶活在0.5龄三角帆蚌中显著高于其他蚌龄(P0.05)。本研究旨为深入探讨三角帆蚌外套膜细胞增殖能力及人工育珠过程中供体蚌的选择奠定基础。     

Branchial carbonic anhydrase is present in the dogfish, Squalus acanthias

The distribution of branchial carbonic anhydrase (CA) in the shark, Squalus acanthias, was studied using in situ measurements of pH disequilibrium states in post-branchial saline, and immunological techniques, immunofluorescence microscopy and Western analysis, employing rabbit polyclonal antibodies against rat pulmonary membrane associated CA IV and chick retinal cytosolic CA II. In the in situ saline perfused gill preparation, the CA inhibitor acetazolamide produced a pH disequilibium (0.063 ± 0.022 pH units) while control and bovine carbonic anhydrase perfusions did not (0.012 ± 0.017 and 0.023 ± 0.018 pH units, respectively). These results indicate that the HCO₃ ^- dehydration reaction is accelerate by endogenous extracellular CA. Western analysis of saline perfused gill membrane preparations revealed an immunoreactive 48 kDa band with the CA IV probe. In crude gill homogenates, a 33 kDa and 31 kDa pair of bands is identified by the CA II probe. The pattern of immunolabeling for CA II in the gill epithelium was either diffuse or punctate within both lamellar and filament epithelial cells while eyrthrocytes and pillar cells displayed a diffuse staining pattern.