笃斯越桔rbcL基因克隆与系统发育分析

以汪清县兰家林场采集的笃斯越桔叶片为样本,采用PCR方法扩增rbcL基因,分析rbcL序列在笃斯越桔及其近缘植物的序列差异,分析其系统发育关系。结果表明:克隆得到的笃斯越桔rbcL基因片段长599bp,编码199个氨基酸残基。核苷酸多序列比对发现,笃斯越桔与欧洲越桔和小叶越桔在第68和390碱基位置有差异,并从构建的系统发育树中得出笃斯越桔和卵叶越桔首先聚为一类,说明笃斯越桔和卵叶越桔亲缘关系更近。     

甘蓝脂质转运蛋白基因BoLTP的克隆与表达分析

[目的]克隆甘蓝脂质转运蛋白基因(BoLTP)的cDNA及DNA片段,为进一步研究其生物学功能奠定基础.[方法]根据NCBI数据库中脂质转运蛋白基因的信息,克隆甘蓝不同组织BoL TP基因,对其核酸序列及预测蛋白进行生物信息学分析;检测甘蓝多种组织中BoLTP的表达情况.[结果]克隆获得甘蓝BoL TP的cDNA序列为720 bp,无内含子,编码102个氨基酸.生物信息学分析发现,甘蓝BoLTP具有脂质转运蛋白家族共有特征,具有显著的疏水区,并存在信号肽结构域、AAI结构域.RT-PCR检测结果表明,BoL TP主要在甘蓝雄蕊中表达,在雌蕊、萼片、花瓣、花茎及叶片中均无表达.[结论]甘蓝BoLTP基因可能与甘蓝雄蕊中花粉的发育相关.     

小麦TaMlo8基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小麦Mlo基因家族新成员,分析其编码蛋白的结构、进化地位以及其在小麦根、茎、叶组织和生物胁迫下的表达模式。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从小麦品种"水源11"中分离出1个Mlo的cD-NA序列基因,对其进行克隆和序列分析;利用InterProScan、TMpred、SignalP等在线分析工具,预测TaMlo蛋白的保守结构域、跨膜结构、信号肽、细胞定位等特征;采用DNASTAR软件分别进行氨基酸序列同源性比对和进化树分析,并利用qRT-PCR技术对其表达谱进行分析。【结果】以玉米ZmMlo8基因为种子序列,克隆了小麦新基因TaMlo8(暂命名)cDNA序列,该序列长1 897bp,ORF为1 497bp,编码499个氨基酸;InterProScan和SignalP预测结果显示,其为Mlo家族成员,含信号肽和7个跨膜区;BLASTX结果显示,TaMlo8与玉米ZmMlo8蛋白的相似性达78%;系统进化树显示,TaMlo8与玉米ZmMlo8处于同一分支下,而与小麦其他Mlo家族成员处于不同的分支上,进一步说明TaMlo8为小麦Mlo家族的新成员;表达谱分析表明,TaMlo8是组成型低表达,在小麦根、茎、叶组织中的表达量基本一致,在小麦与条锈菌互作的非亲和体系中诱导表达,在小麦与白粉菌的感病反应中诱导表达。【结论】克隆到1个小麦Mlo基因新成员TaMlo8,其在小麦与条锈菌的抗性反应和小麦与白粉菌的感病反应中起一定作用,说明TaMlo8基因对条锈菌和白粉菌的抗病路径可能不同,为进一步研究其在小麦生物胁迫反应中的潜在功能奠定了基础。     

‘辽宁2号’DELLA蛋白编码基因的克隆及表达分析

以‘辽宁2号’核桃的叶片为试材,通过同源克隆和RACE技术克隆DELLA家族蛋白的编码基因,并进行了同源性分析和氨基酸序列的多重比对;通过实时荧光定量PCR分析了该基因在‘辽宁2号’核桃中的组织特异性表达情况。主要研究结果如下:获得了DELLA蛋白编码基因的cDNA全长,命名为JrGAI(Genebank:JF766606),cDNA全长为2 361bp,包含1 842bp编码区序列,推测其编码的蛋白包含613个氨基酸,分子量为66.78kDa。同源性分析及氨基酸序列的多重比对结果表明该蛋白与其他物种的DELLA蛋白高度相似,并且具有完整的DELLA、TVHYN、VHIID、RVER和SAW等结构域;实时荧光定量PCR结果显示JrGAI基因在‘辽宁2号’核桃的叶芽、混合花芽、叶片、雄花、茎段和果实中普遍表达,并且在休眠期组织中具有较高的表达量,其中以休眠期的混合花芽中的表达量最高。     

蕙兰CfMADS1基因的克隆及其时空表达特性

【目的】对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究,为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】以蕙兰萼片cDNA为模板,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,克隆获得CfMADS1全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料,利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540),其cDNA序列全长1 061bp,开放阅读框长744bp,编码247个氨基酸,分子式为C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性(85.43%),与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域,极可能位于细胞核内,具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa),而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML),二级结构中α-螺旋所占比例较高(55.63%),三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈,花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈,子房和营养期根中表达较弱,其余器官组织中表达痕量。【结论】从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1cDNA全长序列,CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。     

绒山羊胚胎期和兴盛期皮肤毛囊差异表达基因研究

应用抑制性消减杂交技术成功构建了内蒙古绒山羊胚胎期和兴盛期皮肤毛囊的消减cDNA文库.从两个文库中分别随机挑取50个克隆测序分析,测序结果经Genbank同源性比对.表明在胚胎期消减cDNA文库中得到15个特异表达基因片段,包含1个未知新序列;在兴盛期消减cDNA文库中得到19个特异表达基因片段.包含2个未知新序列.     

苹果山梨醇脱氢酶基因家族的克隆及表达分析

【目的】进一步探明苹果中山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase,SDH;EC 1.1.1.14）基因家族的分子特性。【方法】从‘嘎拉’苹果中克隆 SDH基因家族全长 cDNA 序列和gDNA 序列,检测它们在叶片和果实不同生长时期的表达模式。【结果】获得了12个苹果SDH基因家族cDNA序列,依次命名为MdSDH7-MdSDH18。除MdSDH18基因的全长gDNA序列由6个外显子和5个内含子组成,其余基因的全长gDNA序列由2个外显子和1个内含子组成。根据氨基酸序列相似性可以将这些SDH基因分为A和B两类。所有SDH基因在果实不同生长期均有表达,且中后期表达高于初期,但果实初期的SDH活性高于中后期。A类SDH基因在叶片不同生长时期的表达水平为幼叶＞衰老叶＞成熟叶,SDH活性也呈现出同样的趋势,但B类SDH基因在叶片不同生长时期的表达水平为衰老叶＞成熟叶＞幼叶。【结论】进一步证明了SDH基因在苹果中是以基因家族的形式存在的,且不同的基因家族成员在叶片和果实中有不同的表达特性。     

薄壳山核桃MADS—box基因保守片段的克隆与序列分析

【目的】克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS—box家族基因及其发育的分子机理奠定基础。【方法】以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT—PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS．box家族基因进行系统发育分析。【结果】分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65．7％-98．5％,其推导氨基酸序列中有11个存在差异。系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归人拟南芥MADS．box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因。【结论】薄壳山核桃中存在多种MADS．box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因。     

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。     

赤霞珠白藜芦醇合酶基因的克隆及酿酒酵母表达载体的构建

为克隆酿酒葡萄品种赤霞珠的白藜芦醇合酶基因并构建其酿酒酵母表达载体,利用改良CTAB法提取赤霞珠葡萄叶片组织中的DNA,根据文献报道的序列(Genbank登录号AF128861)设计引物扩增得到白藜芦醇合酶基因全长序列。将全长序列克隆至克隆载体后,通过重叠延伸PCR扩增到RS基因cDNA片段。然后分别将RS基因全序列和cDNA片段连接至真核表达载体pGBKT7,经克隆和测序分析后,构建两种真核表达载体pGBKT7/RSDNA和pGBKT7/RScDNA,用SD-trp选择培养基筛选出阳性克隆,菌落PCR验证得到阳性转化子。     

胡萝卜MADS-box基因的克隆及表达分析

植物MADS-box基因家族基因编码高度保守的转录因子,参与包括花发育在内的多种发育进程。为进一步研究胡萝卜花器官的发育,根据MADS-box基因保守区序列,设计简并引物,并利用3’-RACE法从胡萝卜(Daucus carrot)中克隆两个MADS-box基因家族的cDNA片段,根据克隆出的片段设计引物进行5’-RACE扩增以获得cDNA全长序列。序列分析和系统进化分析表明,这两个基因分别与金鱼草的DEFH49和拟南芥的AGL6序列有很高同源性。从而将两个基因分别命名为DcSEP1和DcAGL6。序列比对分析表明这些基因编码的蛋白质都包含高度保守的MADS结构域、I结构域和K结构域,同时每个基因均有其比较保守的C-末端功能域。基因表达分析结果显示,DcSEP1和DcAGL6在营养器官根、茎、叶和萼片中均无表达,而在心皮和雄蕊中有微量表达。     

薄壳山核桃MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

【目的】克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS-box家族基因及其发育的分子机理奠定基础。【方法】以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT-PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析。【结果】分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137 bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65.7%~98.5%,其推导氨基酸序列中有11个存在差异。系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因。【结论】薄壳山核桃中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因。     

薄荷GPPS基因的克隆与表达分析

牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS Geranyl diphosphate synthase)为短链异戊烯基合酶家族成员,催化1分子的IPP与DMAPP形成GPP,为单萜提供碳骨架。实验从我国薄荷品种"738"中克隆了GPPS大小亚基cDNA全长序列,对其进行序列分析,并研究GPPS基因在薄荷根、茎、叶、花中的相对表达量。结果:GPPS大亚基cDNA序列ORF全长1131 bp,编码377个氨基酸,GPPS小亚基cDNA序列ORF全长942 bp,编码313个氨基酸。研究获得的GPPS基因所编码氨基酸与薄荷属其他种的GPPS氨基酸序列高度相似。GPPS大亚基基因在薄荷品种"738"不同组织中均有表达,幼叶中的表达量最高。     

马尾松谷胱甘肽过氧化物酶PmGPX基因的克隆及表达分析

克隆获得马尾松Pinus massoniana PmGPX基因,进行生物信息学分析以及在不同抗虫材料表达模式分析。在前期马尾松转录组测序获得该基因片段基础上,用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得基因全长,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术分析该基因在不同抗虫材料中的表达模式。克隆获得基因cDNA全长序列,命名为PmGPX。该基因包含741 bp开放阅读框,编码246个氨基酸。序列分析表明:该基因具有GPX家族典型的保守结构域,等电点PI 8.29,蛋白分子量27.08 kDa,与针叶植物北美云杉Picea sitchensis的同源性较高,为91%。与单子叶和双子叶植物同源性较差,大部分在64%~80%,而在GPX家族典型保守结构域的同源性较高,为82%~100%。qRT-PCR技术分析表明:PmGPX在所有组织中均有表达,在针叶中表达量最高,嫩叶的表达量是根的33.45倍,在根、花和球果中的表达量较低,不同材料日表达模式相似,总体上随时间出现"升—降—升"模式。该基因在抗虫材料中启动较早,且表达量高于对照。推测该基因参与了马尾松抗虫防御体系。     

薄壳山核桃MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

[目的]克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS-box家族基因及其发育的分子机理奠定基础.[方法]以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT-PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析.[结果]分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137 bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65.7%~98.5%,其推导氨基酸序列中有11个存在差异.系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因.[结论]薄壳山核桃中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因.     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

家蚕Bmugt3基因cDNA序列的克隆、表达与序列分析

【目的】克隆分析家蚕Bmugt 3基因cDNA序列,并对其在家蚕不同组织中的表达进行检测。【方法】以家蚕ak1和873为供试材料,采用生物信息学方法和RT-PCR技术,对家蚕Bmugt3基因cDNA序列进行克隆和组织表达谱研究,并通过XbaⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将Bmugt 3亚克隆至具有2个反向T7启动子,用于体外诱导合成双链RNA(dsRNA)的L4440载体。【结果】克隆得到了家蚕Bmugt 3基因1675bp的cDNA序列,编码462个氨基酸,编码蛋白的分子质量为52.3ku,等电点6.5;多序列比对显示,Bmugt 3基因缺失了C末端的跨膜结构域;聚类分析结果显示,其与家蚕phenol-UGT基因聚合在同一分支上。Bmugt 3基因主要在家蚕丝腺中表达。【结论】Bmugt 3基因是组织特异性表达基因,可能在家蚕类黄酮素的代谢中起作用。     

干旱和盐碱共胁迫下玉米EST文库的构建与分析

为了构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库,提取YQ7-96品系的雌雄分化期(12片真叶)的混合组织(叶、茎和花芽)总RNA,运用SMART技术构建pDNR-LIB载体的cDNA文库,随机挑选克隆进行表达序列标签(EST)序列的BlastX比对和MIPS归类分析。结果表明:表达频率10的只有1个独立基因,表达频率4以上的有17个独立基因,单拷贝基因有1 693个。在基因注释中发现了4个编码早期干旱诱导蛋白质的EST,在聚类分析后得到一个片段重叠群,命名为EDIP。重叠群与玉米、水稻的早期干旱诱导蛋白质相关基因有较高的同源性,表明在干旱和盐碱共胁迫的玉米EST数据库中,高频表达的基因较少,大部分为单拷贝基因;另外,已筛选出与干旱和盐碱共胁迫相关的玉米EST。     

菊花花瓣XTH基因cDNA序列的克隆与分析(英文)

[目的]为研究非乙烯敏感型菊科植物的木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(xyloglucan endo-transglycosylase/hydrolase,XTH)基因的结构特征。[方法]采用Trizol方法从菊花花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术和T/A载体克隆XTH基因的cDNA序列。[结果]测序结果表明,克隆的cDNA片段大小为911bp,编码293个氨基酸残基,具有XTH蛋白家族的7个活性位点,命名该基因序列为CmXTH(基因登录号为HM752243);其推导的氨基酸序列与其它19种植物的XTH具有较高的同源性,其中与非洲菊、蕃茄的亲缘关系最近,而与猕猴桃、草莓、胡杨等的亲缘关系较远。[结论]克隆片段确为XTH基因的cDNA序列,可能与菊花花瓣的生长与衰老过程有关。     

复叶槭FtsZ基因cDNA片段的克隆及RNA干扰载体的构建

利用简并引物RT-PCR,首次从复叶槭中克隆到569 bp的FtsZ基因cDNA片段,其与GenBank已经登录的FtsZ基因氨基酸序列的同源性为96.90%,并具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。从上述序列中选取300 bp的序列,分别克隆其正、反义基因片段,同时,克隆GUS基因的1个内含子,作为间隔区基因。将正义、间隔区和反义3个基因片段串联,插入到植物表达载体p3300-35ST中,构建复叶槭RNA干扰载体p35ST-AnFtsZi。为接下来遗传转化、培育复叶槭彩叶新品种奠定基础。