薄壳山核桃MADS—box基因保守片段的克隆与序列分析

【目的】克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS—box家族基因及其发育的分子机理奠定基础。【方法】以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT—PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS．box家族基因进行系统发育分析。【结果】分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65．7％-98．5％,其推导氨基酸序列中有11个存在差异。系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归人拟南芥MADS．box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因。【结论】薄壳山核桃中存在多种MADS．box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因。     

薄壳山核桃MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

[目的]克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS-box家族基因及其发育的分子机理奠定基础.[方法]以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT-PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析.[结果]分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137 bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65.7%~98.5%,其推导氨基酸序列中有11个存在差异.系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因.[结论]薄壳山核桃中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因.     

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。     

胡萝卜MADS-box基因的克隆及表达分析

植物MADS-box基因家族基因编码高度保守的转录因子,参与包括花发育在内的多种发育进程。为进一步研究胡萝卜花器官的发育,根据MADS-box基因保守区序列,设计简并引物,并利用3’-RACE法从胡萝卜(Daucus carrot)中克隆两个MADS-box基因家族的cDNA片段,根据克隆出的片段设计引物进行5’-RACE扩增以获得cDNA全长序列。序列分析和系统进化分析表明,这两个基因分别与金鱼草的DEFH49和拟南芥的AGL6序列有很高同源性。从而将两个基因分别命名为DcSEP1和DcAGL6。序列比对分析表明这些基因编码的蛋白质都包含高度保守的MADS结构域、I结构域和K结构域,同时每个基因均有其比较保守的C-末端功能域。基因表达分析结果显示,DcSEP1和DcAGL6在营养器官根、茎、叶和萼片中均无表达,而在心皮和雄蕊中有微量表达。     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

棉蚜HSP70基因cDNA片段的克隆和序列分析

【目的】克隆棉蚜HSP70基因cDNA片段,并分析其基因序列。【方法】采集黄色型和绿色型棉蚜,实验室饲养4~5代形成单克隆系,温度处理后提取总RNA备用。根据已知昆虫HSP70基因的保守性区域,设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增棉蚜HSP70基因的部分序列,测序后进行核苷酸和推导的氨基酸序列分析。【结果】RT-PCR扩增得到一条长度783 bp左右的HSP70基因cDNA片段。测序结果显示,所得cDNA片段长度为783bp(GenBank登录号为:EU109426),且黄色型和绿色型棉蚜的核苷酸序列一致,编码261个氨基酸残基。由棉蚜该片段推导的氨基酸序列与其他昆虫的同源性较高。【结论】获得了棉蚜HSP70基因783 bp的cDNA片段,该片段编码261个氨基酸残基。     

洋葱花器官B类MADS-box基因AcPI的克隆及表达分析

【目的】克隆洋葱花器官B类PI/GLO家族MADS-box基因,分析其序列特征及时空表达模式,为探讨其在洋葱花发育过程中的分子遗传机制奠定基础。【方法】以洋葱花蕾总RNA为模板,根据同源克隆策略设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得AcPI的全长cDNA序列。用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用RT-PCR和Real-time PCR分析AcPI在花蕾整个生长过程中的时空表达模式。【结果】克隆获得洋葱AcPI基因（GenBank登录号：JX679083）的cDNA全长931 bp,包含615 bp的完整开放阅读框,编码205个氨基酸。蛋白分析表明,AcPI蛋白具有植物MADS-box蛋白典型的MADS和K结构域;与水仙的NTPI、风信子的HoMADS2有78%、75%的相似性,与金鱼草的GLO也有52%的相似性。系统进化树分析表明,AcPI属于B类MADS-box蛋白家族的PI亚家族。RT-PCR表达分析表明,AcPI只在生殖器官花蕾中表达,但主要在花的第一、二、三轮花器官中表达,而在营养组织根、茎和叶中不表达。Real-time PCR进一步分析表明,AcPI在花芽整个生长过程中,在心皮中微弱表达,但表达丰度呈递增趋势;而在外轮被片、内轮被片和雄蕊中强烈表达,其表达丰度除了在外轮被片中呈先增后减的趋势外,在内轮被片和雄蕊中都呈递增趋势。【结论】AcPI在洋葱第一轮花器官中的表达支持了van Tunen提出的修正的ABC模型;但AcPI在洋葱第四轮花器官中也有表达,这表明AcPI除了调控外轮被片、内轮被片和雄蕊发育外,还可能在心皮的形成发育过程中起着重要作用。     

葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄VviSEP2基因的完整开放阅读框(ORF)序列,明确其与胚珠败育型无核葡萄胚珠败育的关系。【方法】通过RT-PCR技术在‘无核白’葡萄中克隆葡萄VviSEP2基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析VviSEP2的表达模式。【结果】克隆得到一个无核葡萄胚珠发育相关基因,该基因cDNA序列长度为1 132bp,ORF为741bp,编码246个氨基酸。氨基酸多序列比对和进化树分析确认,该基因是E类MADS-box基因家族成员,命名为VviSEP2。表达分析结果表明,VviSEP2只在花蕾、花和胚珠中有表达,而在根、茎、叶中无表达,并且该基因在有核葡萄‘黑比诺’花与花蕾中的相对表达水平明显高于无核葡萄‘无核白’,同时VviSEP2基因在‘黑比诺’胚珠发育各时期的相对表达水平均高于‘无核白’,为后者的3~5倍。【结论】VviSEP2基因与无核葡萄的胚败育可能存在一定关系。     

白及GMP基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

【目的】克隆白及GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase)基因(Bs GMP)cDNA全长序列,分析该基因生物学信息,为该基因功能的进一步鉴定提供依据。【方法】基于同源序列克隆GMP基因中间片段,并采用RACE技术扩增GMP基因cDNA全长,用DNAMAN、Tmpred及Softberry等软件进行编码多肽序列、理化性质及亚细胞定位等分析。【结果】从白及叶片中克隆到的GMP基因全长1523 bp,其中包含1086 bp的开放阅读框(ORF),编码361个氨基酸,理论蛋白分子量为39.35 k Da,理论等电点为6.03。进一步分析发现该基因具有跨膜结构,亚细胞定位分析发现该基因主要分布于细胞质和线粒体。蛋白三级结构预测显示,Bs GMP蛋白有11个α螺旋,33个β折叠,46个β转角;该蛋白第1~24个氨基酸含有醛酮还原酶的保守结构域,第256~335个氨基酸含有Lbeta H家族保守区。BLAST多重序列分析表明,Bs GMP氨基酸序列与铁皮石斛、蝴蝶兰的亲缘性最高,分别达到95%和92%。【结论】成功克隆到白及GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(Bs GMP),并进行相关生物信息学分析,为该基因的进一步功能研究奠定了基础。     

慈竹4CL基因的克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆慈竹木质素生物合成酶4CL基因,研究其序列特征,为今后利用该基因调控慈竹木质素的生物合成研究奠定基础。【方法】参照其他物种4CL基因保守区,设计简并引物,以慈竹幼笋cDNA为模板,克隆到1条750 bp的4CL基因保守区片段。以这条保守区片段为模板,结合5′RACE和3′RACE克隆4CL基因全长序列,并对其进行了生物信息学分析。【结果】成功克隆了慈竹4CL基因全序列,该序列CDS区全长为1 674 bp,编码558个氨基酸;氨基酸序列中存在两大4CL氨基酸保守域(SSGTTGMPKGV和GEICIRG),其中前一个氨基酸保守域的第7个氨基酸位点变为M,与常见的L不同,表明慈竹的4CL基因发生了一定变异。系统进化分析表明,该基因(Na4CL)与水稻的Os4CL4和黑麦草的Lp4CL2具有很高的同源性。【结论】克隆了慈竹木质素合成酶4CL基因全长序列,在GenBank上注册为EU327341,可能与慈竹木质素生物合成有关。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

山核桃MADS-like基因的克隆与分析

MADS-box基因在植物花发育的整个阶段起到了极为关键的作用。根据山核桃Carya cathayensis雌花芽454测序得到的基因片段,采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术,获得了1条Cc MADS-like基因。序列分析结果表明:Cc MADS-like开放阅读框(ORF)长度为609 bp,编码202个氨基酸,具有典型的MADS-box结构域,包括高度保守的MADS盒和K区以及I区、C区。Cc MADS-like与拟南芥Arabidopsis thaliana,金鱼草Antirrhinum majus,美洲黑杨Populus deltoides,欧洲大叶杨Populus trichocarpa等的同源基因所编码的蛋白质同源性分别达到48%,65%,69%,71%。山核桃不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)结果表明:Cc MADS-like基因在花芽中表达量远远高于其他组织,暗示该基因极有可能参与山核桃成花发育。酵母单杂交实验表明,Cc MADS-like蛋白具有转录激活活性。     

樟叶越桔VdARP7基因片段克隆与表达分析

基于樟叶越桔叶芽转录组测序数据,筛选获得ARP7基因cDNA片段,采用RACE-PCR技术克隆了樟叶越桔VdARP7基因cDNA序列,并应用半定量PCR技术分析了VdARP7基因在樟叶越桔不同组织中的表达特征。结果表明:克隆了VdARP7基因964 bp cDNA片段,包括3'UTR完整区域和Poly A尾巴特征,VdARP7属于Actin超级家族ARPs亚家族基因新成员,与多种高等植物已知ARP7基因具有较高的同源性,推导编码VdARP7蛋白的C-末端225个氨基酸残基序列,含1个NBD_sugar-kinase_HSP70_actin保守结构域。VdARP7基因能在樟叶越桔叶芽、嫩叶、老叶、花芽和花等组织中稳定表达,推测ARP7作为组成型表达的蛋白质在植物生长和发育等过程中发挥重要生理功能。     

茄子SmWOX13基因的克隆、亚细胞定位及序列分析

WUSCHEL-related homeobox基因编码保守的转录因子家族在植物发育中起着非常重要的作用。本文从茄子中克隆了SmWOX13基因,该基因cDNA序列全长1 233 bp,包含834 bp编码序列。推导氨基酸序列用于分析该基因的保守性及生成3D结构。扩增获得的基因组序列被用于该基因结构的分析。SmWOX13与GFP融合蛋白的亚细胞定位结果表明该蛋白被定位于细胞核。系统发生树显示茄子SmWOX13基因与番茄WOX8和拟南芥WOX13属于同一个分支。综上结果可表明茄子SmWOX13基因可能与之前报道的番茄和拟南芥WOX基因类似,参与了果实形状的控制。     

茄子SmWOX13基因的克隆、亚细胞定位及序列分析（英文）

WUSCHEL-related homeobox基因编码保守的转录因子家族在植物发育中起着非常重要的作用。本文从茄子中克隆了SmWOX13基因,该基因cDNA序列全长1 233bp,包含834bp编码序列。推导氨基酸序列用于分析该基因的保守性及生成3D结构。扩增获得的基因组序列被用于该基因结构的分析。SmWOX13与GFP融合蛋白的亚细胞定位结果表明该蛋白被定位于细胞核。系统发生树显示茄子SmWOX13基因与番茄WOX8和拟南芥WOX13属于同一个分支。综上结果可表明茄子SmWOX13基因可能与之前报道的番茄和拟南芥WOX基因类似,参与了果实形状的控制。     

大麦HvRBR基因克隆与序列分析

【目的】从栽培大麦(Hordeum vulgare)中分离并克隆对植物细胞周期起负调控作用的RBR(retinoblastoma-related),鉴定大麦RBR(HvRBR)分子特征,明确其与同源基因间的亲缘关系和分类地位,为探索动、植物生长发育过程中细胞增殖和分化相关调控途径的研究提供理论依据。【方法】通过对植物RBR生物信息学分析,根据RBR保守区域序列设计通用引物,采用PCR方法从栽培大麦DNA和苗期总cDNA中分别分段克隆,获得特征序列后在DNAMAN软件下进行序列分析、多重序列比对并构建系统树。【结果】从栽培大麦籽粒皱缩突变材料GSHO1854中获得全长为5547bp的大麦HvRBR序列(GU121481),其cDNA编码区(GU121480)全长3179bp,包含一个编码975个氨基酸的开放阅读框。由其推导的氨基酸序列与已报道的RBR蛋白序列有较高的一致性。在A、B保守区之间有一个间隔区,虽然同源性较低,但是所有氨基酸序列的相似位点都包含一个半胱氨酸残基,这说明该半胱氨酸残基形成的分子内或分子间二硫键可能对整个RBR蛋白的结构和功能产生重要的影响。系统进化分析表明HvRBR与水稻同源性最高(84.3%),与苜蓿、拟南芥等双子叶植物的同源性较低(50%)。【结论】首次从大麦中得到与植物细胞周期起调控、细胞增殖和分化相关的RBR蛋白编码基因HvRBR。对栽培大麦籽粒皱缩突变材料GSHO1854的HvRBR进行了分子克隆和鉴定,并通过系统进化分析将HvRBR归为植物RBR家族C亚族。     

大麦HvRBR基因克隆与序列分析#br#

【目的】从栽培大麦（Hordeum vulgare）中分离并克隆对植物细胞周期起负调控作用的RBR（retinoblastoma-related）,鉴定大麦RBR（HvRBR）分子特征,明确其与同源基因间的亲缘关系和分类地位,为探索动、植物生长发育过程中细胞增殖和分化相关调控途径的研究提供理论依据。【方法】通过对植物RBR生物信息学分析,根据RBR保守区域序列设计通用引物,采用PCR方法从栽培大麦DNA和苗期总cDNA中分别分段克隆,获得特征序列后在DNAMAN软件下进行序列分析、多重序列比对并构建系统树。【结果】从栽培大麦籽粒皱缩突变材料GSHO1854中获得全长为5 547 bp的大麦HvRBR序列（GU121481）,其cDNA编码区（GU121480）全长3 179 bp,包含一个编码975个氨基酸的开放阅读框。由其推导的氨基酸序列与已报道的RBR蛋白序列有较高的一致性。在A、B保守区之间有一个间隔区,虽然同源性较低,但是所有氨基酸序列的相似位点都包含一个半胱氨酸残基,这说明该半胱氨酸残基形成的分子内或分子间二硫键可能对整个RBR蛋白的结构和功能产生重要的影响。系统进化分析表明HvRBR与水稻同源性最高（84.3%）,与苜蓿、拟南芥等双子叶植物的同源性较低（50%）。【结论】首次从大麦中得到与植物细胞周期起调控、细胞增殖和分化相关的RBR蛋白编码基因HvRBR。对栽培大麦籽粒皱缩突变材料GSHO1854的HvRBR进行了分子克隆和鉴定,并通过系统进化分析将HvRBR归为植物RBR家族C亚族。     

蕙兰CfMADS1基因的克隆及其时空表达特性

【目的】对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究,为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】以蕙兰萼片cDNA为模板,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,克隆获得CfMADS1全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料,利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540),其cDNA序列全长1 061bp,开放阅读框长744bp,编码247个氨基酸,分子式为C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性(85.43%),与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域,极可能位于细胞核内,具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa),而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML),二级结构中α-螺旋所占比例较高(55.63%),三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈,花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈,子房和营养期根中表达较弱,其余器官组织中表达痕量。【结论】从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1cDNA全长序列,CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。     

甜荞花同源异型基因FeMADS1的克隆和序列结构分析

采用同源克隆方法,并结合RACE技术,从甜荞花芽分离得到1个A类MADS-box基因FeMADS1的cDNA全长,GenBank登录号为KM386627,其cDNA全长1 107bp,包括1个编码234个氨基酸、长为705bp的开放阅读框。序列同源比对和分子系统发生分析表明,其蛋白与拟南芥AGL8(FUL)的相似性最高,属A类MADS-box基因亚家族中的euFUL进化系,含MADS、I、K和C末端4个明显的结构域,并且K结构域包含K1、K2和K3共3个保守的富含疏水氨基酸残基的亚结构域,C末端结构域含FUL型基因2个特有的模体:FUL motif和paleoAP1motfi。     

苎麻果胶合成关键酶GalAT基因的克隆及表达

 【目的】分离和克隆苎麻果胶合成关键酶GalAT基因部分序列,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用简并引物RT-PCR法克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究GalAT基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了986 bp的GalAT基因部分序列（GenBank注册号：EU131377）,可编码328个连续的氨基酸序列;核苷酸序列和推定的氨基酸序列与拟南芥的Galacturonosyltransferase 4同源性最高,分别为77%和83%;推定的氨基酸序列与拟南芥的Galacturonosyltransferase 4可聚为一类;GalAT基因在苎麻各个组织中都有表达,其中根部的GalAT表达量占大部分。【结论】确定所获得的序列是GalAT基因的cDNA序列;GalAT表达量为根部＞叶片＞韧皮部＞或≈木质部, 在根部的表达量占优势。