猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据猪乙型脑炎病毒(JEV)基因序列,设计合成了一对引物,以JEV疫苗株为模板,建立了检测JEV的RT PCR方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为430 bp的特异性目的片段;RT PCR产物测序结果与文献报道的JEV不同毒株的序列同源性达到98%~100%;敏感性测定该RT PCR可扩增到10 pg的JEV-RNA。结果表明,建立的RT PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强。     

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到10~3拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7N基因、猪乙型脑炎病毒（JEV）NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、 特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV0.2ng/L、JEV 0.4ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。     

猪呼吸与繁殖综合症病毒RT-LAMP检测方法的建立

【目的】建立一种适用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速、灵敏、特异性检测方法,即一步反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)。【方法】设计3对针对PRRSVN基因的8个位点的特异性引物,用优化后的反应体系检测RT-LAMP的特异性、灵敏性并对临床样本进行检测。【结果】RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测仅需要70min,肉眼即可观察检测结果,该方法具有良好的特异性,灵敏度是RT-PCR的10000倍,在对50份猪血液样本RNA的检测中,该方法与传统的RT-PCR检测方法具有很好的统一性(κ=0.83)。【结论】RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测。     

乙型脑炎病毒可视化快速检测方法的建立

利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了简便、可靠的快速检测乙型脑炎病毒JEV(Japanese encephalitis virus)的可视化方法。根据Gen Bank数据库中JEV Henan-09-03毒株(Gen Bank ID:GQ336809.1) E蛋白序列,设计了3对特异性LAMP引物,建立Bst DNA Polymerase等温扩增体系,优化后的反应体系可高灵敏性、特异性检测JEV。本方法通过在扩增产物中加入SYBR Green I染料后用石蜡进行封闭,在可见光下根据反应液荧光的颜色深浅来判断JEV扩增阳性强弱。结果显示,该方法的灵敏度可达5copies·m L-1,且与其他病毒,如乙型肝炎病毒HBV(Hepatitis B virus,HBV)无交叉反应。     

猪乙型脑炎病毒E-Ⅲ抗原域蛋白间接ELISA的建立及应用

该研究利用纯化后的流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)E-Ⅲ抗原域蛋白,将其作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法.试验的最佳反应条件为:最佳抗原包被浓度为17.5 μg/mL,血清抗体稀释度为1∶4,酶标二抗稀释度为1∶5 000,封闭液和稀释液用含0.4％ BSA的PBST.采用该方法对127份临床样品进行检测,结果显示,与商品试剂盒检测结果比较符合率达到90.00％.因此,该研究建立的流行性乙型脑炎间接ELISA检测方法具有良好的稳定性和可重复性,并具有较高的特异性和敏感性.     

6种虫媒病毒PCR-Mass检测方法的建立

建立了一种可快速、同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)、西尼罗病毒(WNV)、森林脑炎病毒(TBEV)和圣路易脑炎病毒(StLEV)等6种虫媒病毒的PCR-Mass检测方法.根据GenBank登录的上述6种病毒的序列信息,经过分析比对,设计6组扩增引物和延伸探针,初步建立针对上述6种病毒的PCR-Mass检测体系.采用上述6种虫媒病毒和其他常见致病性病毒为检测对象,确定PCR-Mass体系的特异性；通过对重组质粒的定量检测,确定该体系的检测灵敏度;并利用该体系对12份TBE阳性和10份JEV阳性脑脊液样本进行检测,评价检测方法的实用性和临床应用价值.结果表明:PCR-Mass检测方法可同时检测上述6种虫媒病毒,而对其他病毒检测均为阴性,无交叉反应现象；6种虫媒病毒的最低检出浓度均为102copies·mL-1；对22份阳性样本的检测结果均呈阳性.本研究建立的PCR-Mass检测方法可实现对6种虫媒病毒的快速、同时检测,具有良好的特异性和较高的灵敏度.     

牛病毒性腹泻病毒一步RT-LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,为诊断与监测BVDV提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测BVDV的RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100copies/μl的病毒RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。     

牛病毒性腹泻病毒一步 RT-LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法,为诊断与监测BVDV 提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套 LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测 BVDV的 RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100 copies/μl的病毒 RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。     

猪日本乙型脑炎及猪细小病毒复合PCR检测方法的建立

根据GenBank上登录的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)与猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)参考基因序列,设计合成2对特异性引物,在建立优化单项PCR检测方法的基础上,建立了PPV-JEV复合PCR检测方法,可扩增出预期的238 bp和152 bp特异性片段。该方法敏感性高、稳定性好、特异性强,临床样品检测结果与单项PCR检测结果符合率100%,该方法适合JEV和PPV的联合检测和鉴别诊断。     

广西猪乙型脑炎血清流行病学调查分析

【目的】了解广西地区猪乙型脑炎（JE）的感染情况及流行态势,为制定广西猪群JE监测和防控体系提供参考依据。【方法】2008～2010年,采集广西边境14市未经JE疫苗免疫的2597份猪血清,采用LAT检测乙型脑炎病毒（JEV）血清抗体,并对不同区域、季节和年龄段等猪群JE流行状况进行分析。【结果】广西受检猪群JEV血清抗体平均阳性率为60.65%;感染率以桂南地区最高（72.15%）,桂北地区最低（35.71%）;夏秋季节（5～11月）是主要流行季节,平均JEV血清抗体阳性率达70.67%,3～4月仅为26.75%;2008～2010年,猪群JEV血清抗体阳性率总体呈上升趋势。【结论】广西受检猪群JE感染较普遍,有一定的地域性及季节性,且感染率呈逐年上升趋势。猪是JEV重要的贮存宿主及传染源,应采取有效的监测与防控措施,杜绝猪JE的流行传播。     

广西猪乙型脑炎血清流行病学调查分析

【目的】了解广西地区猪乙型脑炎（JE）的感染情况及流行态势,为制定广西猪群JE监测和防控体系提供参考依据。【方法】2008～2010年,采集广西边境14市未经JE疫苗免疫的2597份猪血清,采用LAT检测乙型脑炎病毒（JEV）血清抗体,并对不同区域、季节和年龄段等猪群JE流行状况进行分析。【结果】广西受检猪群JEV血清抗体平均阳性率为60.65%;感染率以桂南地区最高（72.15%）,桂北地区最低（35.71%）;夏秋季节（5～11月）是主要流行季节,平均JEV血清抗体阳性率达70.67%,3～4月仅为26.75%;2008～2010年,猪群JEV血清抗体阳性率总体呈上升趋势。【结论】广西受检猪群JE感染较普遍,有一定的地域性及季节性,且感染率呈逐年上升趋势。猪是JEV重要的贮存宿主及传染源,应采取有效的监测与防控措施,杜绝猪JE的流行传播。     

水环境中诺如病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用

[目的]基于诺如病毒(NV)基因保守区,设计一套RT-LAMP简并引物,建立能简便、特异、灵敏检测水环境样品中NV的一步法RT-LAMP技术。[方法]通过试验,优化反应温度(64℃)、反应时间(40 min)、Mg2+浓度(2 mmol/L)等参数,建立反应体系。[结果]该方法只需1台水浴锅在1 h内即可完成检测,可直接用肉眼观察结果,检测灵敏度比普通RT-PCR高100倍;简并引物的设计增强了特异性,可检测多个血清型的NV。[结论]在样品检测中,RT-LAMP技术的灵敏度达97.7%,高于RT-PCR的90.7%,更适用于野外样品和简陋实验室的快捷检测。     

肠炎沙门氏菌SDA-琼脂糖凝胶电泳检测技术研究

[目的]建立肠炎沙门氏菌的SDA快速检测方法。[方法]根据肠炎沙门氏菌invA基因片段设计链置换扩增(SDA)引物,建立肠炎沙门氏菌的SDA快速检测方法,并对设计的引物的灵敏度和特异性进行研究。[结果]成功建立了肠炎沙门氏菌的SDA快速检测方法,SDA反应成功扩增了目标序列。建立的SDA检测技术对肠炎沙门氏菌的检测灵敏度达到7.0×103cfu/ml,且特异性良好。[结论]试验选取的序列和引物具有较高的特异性,可用于肠炎沙门氏菌的特异性检测。     

水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立一种快速、灵敏的逆转录环介导等温扩增方法（RT-LAMP）检测寄主植物和传毒介体体内的水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）。【方法】合成4条针对RBSDV S10核苷酸序列6个位点的特异性引物。分别对引物浓度、MgSO4浓度、反应温度和时间进行优化。将感病水稻总RNA梯度稀释后进行灵敏性检验并与RT-PCR比较分析。选择RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）验证该方法的特异性。用本RT-LAMP方法检测田间病株。【结果】RT-LAMP检测方法可排除SRBSDV的干扰而特异地检测植物和飞虱体内的RBSDV,与RT-PCR灵敏性基本一致。检测结果易于判定。【结论】RT-LAMP检测方法适合寄主植物和介体体内RBSDV的快速检测。     

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立

【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein／MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIVRT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。