鸭疫里氏杆菌PCR方法初步建立及应用

为了建立针对鸭疫里氏杆菌的病原学检测方法,试验根据已发表的鸭疫里氏杆菌的外膜蛋白A(OmpA)的基因序列(GenBank登录号为AF104937)设计1对引物,对7株不同血清型鸭疫里氏杆菌进行扩增并建立PCR方法.结果表明:均扩增出与预计大小一致的目的片段,PCR方法敏感性可达到8.6 Pg;而多杀性巴氏杆菌、沙门菌、...     

鸭疫里氏杆菌的分离与16 S rRNA的鉴定

从疑似患有鸭疫里氏杆菌病的病死鸭群中采取的肝脏、心脏、脑等病料中分离病原,进行生化鉴定,自6只病死鸭的12份病料中分离鉴定出6株鸭疫里氏杆菌。根据鸭疫里氏杆菌16 S rRNA基因的保守序列设计特异引物,对6株鸭疫里氏杆菌进行PCR扩增,均能扩增出680 bp的特异条带;从凝胶中回收DNA目的条带并测序,测序结果与GenBank中鸭疫里氏杆菌相应序列相似率达到99.99%。     

3株鸭疫里氏杆菌的分离鉴定

对广东某鸭场疑似传染性浆膜炎病鸭进行细菌分离鉴定和致病性考察。从濒死鸭脑、肝脏和心血中进行细菌分离,通过鉴别培养、染色镜检、生化试验和PCR检测进行细菌的鉴定,将最终确定为鸭疫里氏杆菌的分离菌株进行扩增培养后,进行动物回归试验,考察其致病性。结果显示分离到的3株细菌均为鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer),动物回归试验中试验组鸭均发病,并表现典型传染性浆膜炎症状,甚至死亡。表明所分离的3株鸭疫里氏杆菌具有较强的致病性。     

安徽省部分地区鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

2007年3月～12月从安徽省不同地区临床疑似鸭疫里氏杆菌感染病/死鸭中分离到26株鸭疫里氏杆菌,通过细菌形态、PCR鉴定、培养特性、生化试验和动物试验,鉴定为鸭疫里氏杆菌.各地区分离株表现为较一致的形态特征和相似的生理生化特性.对不同地区分离到的26株鸭疫里氏杆菌进行了14种常用抗菌药物的药敏试验,结果26株鸭疫里氏杆菌分离株对青霉素G、氨苄青霉素、先锋噻肟、阿莫西林和罗红霉素等几种药物敏感性较高,对庆大霉素和卡那霉素的耐受率最高,对阿米卡星、复方新诺明、链霉素和新霉素等均不同程度地产生了耐药性.本研究为安徽省鸭疫里氏杆菌病的药物防治提供了理论依据.     

鸭疫里氏杆菌九种氨基糖苷类修饰酶基因的检测

用PCR技术对在革兰氏阴性菌中常见的9种氨基糖苷类修饰酶基因进行检测,从1株鸭疫里氏杆菌种检测到了ant(3″)-Ⅰ基因,说明修饰酶已经在中国的鸭疫里氏杆菌中存在。     

鸭疫里氏杆菌耐药性及分子生物学检测方法的研究进展

鸭疫里氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎,是由鸭疫里氏杆菌引起的主要侵害雏鸭的一种急性败血性传染病。近几年,该病的发病率和死亡率不断升高,迄今为止还主要靠药物治疗。了解鸭疫里氏杆菌的耐药机制及其快速准确检测,其污染是控制鸭疫里默氏杆菌感染传播及其疾病治疗的关键环节。因此本文对鸭疫里氏杆菌的耐药现状、耐药机制以及分子生物学检测方法做了总结概述,以期为临床合理用药防治鸭疫里氏杆菌病,减缓耐药菌株的产生提供依据。     

鸭疫里氏杆菌南昌分离株的16S rDNA鉴定与药敏分析

为了对从南昌某疑似鸭疫里氏杆菌病的病死雏鸭大脑、肝脏中分离得到的1株菌株进行16S rDNA鉴定,并筛选敏感药物,试验采用染色镜检、PCR扩增、测序与序列比对分析及药敏纸片扩散法等对分离株进行研究。结果表明:经染色镜检,分离菌呈革兰氏染色阴性,菌体为单个或成双排列的小杆菌,无芽孢,将其命名为NC-RA1;PCR扩增得到大小约为1 500 bp的条带;分离株NC-RA1与鸭疫里氏杆菌16S rDNA基因同源性高达99%;分离株NC-RA1对氟苯尼考、替卡西林-克拉维酸、头孢噻肟敏感,对四环素中度敏感,对庆大霉素、卡那霉素等药物耐药。说明该分离株为鸭疫里氏杆菌,并且可以用氟苯尼考、替卡西林-克拉维酸、头孢噻肟对其进行防治。     

1型鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及其ompA基因B细胞表位预测

本研究从贵州发病鸭中分离到1株致病菌,经生化试验、16S rRNA序列分析、血清学试验和动物回归试验,鉴定为1型鸭疫里氏杆菌(RA),药敏试验结果表明,其对头孢拉定、头孢曲松钠、头孢噻肟和氟苯尼考高度敏感;同时根据GenBank中鸭疫里氏杆菌ompA基因序列,设计1对引物,成功克隆出鸭疫里氏杆菌ompA基因,扩增产物大小为1149 bp。采用DNAStar Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对鸭疫里氏杆菌ompA基因的氨基酸序列进行了B细胞表位预测,为进一步研究鸭疫里氏杆菌表位疫苗和分子诊断技术的建立奠定基础。     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

鸭疫里默氏杆菌假定溶血素相关蛋白基因Riean_0415的原核表达及溶血活性检测

为了分析鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)假定的含CBS结构域的溶血素相关蛋白(hypothetical hemolysinrelated protein,HRP)的功能,本研究根据血清10型鸭疫里氏杆菌HXb2株Riean_0415基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,采用PCR扩增了Riean_0415基因,并进行了序列测定与分析。然后将Riean_0415基因克隆到原核表达载体p ET-43.1a,再用亲和层析纯化获得诱导表达的重组蛋白r HRP。溶血活性检测结果表明表达的重组蛋白r HRP具有裂解鸭红细胞的活性。本研究结果为进一步研究r HRP蛋白的功能和鸭疫里默氏杆菌的溶血机制等奠定了基础。     

鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病多重PCR诊断方法的建立

参考GenBank中鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,应用PrimerPremier5.0软件在二者高度保守区设计了2对引物,建立了适合鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的快速检测的多重PCR检测方法。以该方法对已分离并保存的鸭疫里默氏菌和大肠杆菌进行PCR扩增,分别扩增出与试验设计相符的670、408bp的特异性DNA片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果表明分别为鸭疫里默氏菌和大肠杆菌OmpA基因序列。该方法对鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的检测下限分别为4×104CFU/mL和3×104CFU/mL。表明所建立的PCR方法具有特异、快速和敏感的特点,可用于诊断鸭疫里默氏菌、大肠杆菌以及两者的混合感染。     

鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的克隆及序列分析

本研究根据鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子(RaDtxR)基因序列特征设计特异性引物,利用PCR方法从已鉴定为2型鸭疫里默氏菌RA-FJ株的基因组DNA中扩增目的基因片段,胶回收PCR扩增片段,克隆到pMD18-T载体后进行序列测定.采用生物信息学软件对测序结果进行分析,结果表明所获得的RaDtxR基因编码完整的开放阅读框,全基因长度为654 bp,编码217个氨基酸.所编码的蛋白大小为24.82 ku,理论等电点为5.69,不稳定系数为38.45,属于稳定蛋白质类.将其与GenBank中已发表的RaDtxR基因序列进行核苷酸同源性比对分析,结果显示其与鸭疫里默氏菌疫苗株RA-CH-1株(GenBank登录号:CP003787)的核苷酸同源性为100.0%,与其他4株核苷酸同源性均为99.8%,仅在186位处存在无义突变.利用该基因对福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的鸭大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌进行扩增,结果显示均未扩增到条带,对福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的1型、2型、3型、11型和13型鸭疫里默氏菌均可扩增出特异性目的条带,表明RaDtxR基因可作为鸭疫里默氏菌鉴别诊断的靶基因.试验结果表明,本研究成功克隆到鸭疫里默氏菌RaDtxR基因,为研究其功能奠定基础.     

鸭疫里默氏杆菌PCR检测方法的建立

本研究根据鸭疫里默氏杆菌16S rRNA基因的保守序列设计一对特异性引物,建立了鸭疫里默氏杆菌的PCR检测方法。结果表明,此方法具有敏感性高、特异性好等优点,从而为鸭疫里默氏杆菌的诊断提供了有效的工具。     

鸭疫里默氏杆菌PCR快速检测方法的建立

在鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白保守区设计了一对特异性引物,建立PCR方法,对5株已知血清型的鸭疫里默氏杆菌纯培养菌和6株临床分离未定型的里默氏杆菌菌株以及病死鸭病料组织进行检测,结果表明不同样品都可扩增出592bp的特异目的条带,而对鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌的扩增结果均为阴性,说明该PCR法具有较好的特异性,可用于快速鉴定鸭疫里默氏杆菌,也适用于病料的直接检测.     

鸭疫里默氏杆菌原生质体的制备研究

鸭疫里默氏秆菌是一种非常难以转化的细菌,国内外未见关于其质粒转化的报道,试验以鸭疫里默氏杆菌OD600为0.7时为受体菌,在高渗缓冲液中,经溶菌酶5 mg/ml于37℃作用50 min,制备的原生质体再生于再生双层固体培养基,原生质体成功再生.研究为鸭疫里默氏杆菌的质粒转化提供了一条新途径.     

荧光定量PCR方法检测鸭疫里默氏菌在组织中的分布规律

为揭示鸭疫里默氏菌在鸭组织中的分布规律,用荧光定量PCR检测法,对人工感染鸭疫里默氏菌鸭组织中鸭疫里默氏菌进行检测。结果表明,获得的熔解曲线为单一的峰,扩增曲线为"s"形,标准曲线扩增效率为99.7%。人工感染鸭疫里默氏菌1、2、3、5、9、14 d鸭脾脏、脑、心脏、肺脏和肝脏组织中的鸭疫里默氏菌载菌量均在2 d达定殖高峰,载菌量多少按组织排序依次为脑>心>脾>肺>肝,按时间排序依次为2 d>3 d>1 d>5 d>9 d>14 d。     

鸭疫里默氏杆菌大罐发酵培养条件优化及验证

为进一步了解鸭疫里默氏杆菌的生长特性,本研究利用改良酵母肉汤培养基运用正交设计的方法,在10L的小型发酵罐中对鸭疫里默氏杆菌各种发酵条件进行了优化。随后将优化结果在GMP生产车间,利用200L大型发酵罐规模化试生产3批鸭疫里默氏杆菌抗原进行验证,结果显示,鸭疫里默氏杆菌活菌数比优化前提高30%,为鸭疫里默氏杆菌产业化奠定了基础。     

鸭疫里氏杆菌外膜蛋白研究进展

综述了鸭疫里氏杆菌外膜蛋白的研究进展。鸭疫里氏杆菌病为危害养鸭业最严重的疾病之一。外膜蛋白作为鸭疫里氏杆菌不同血清型的共同免疫原性蛋白,可同时诱导机体的体液免疫和细胞免疫,具有异种血清型的免疫交叉保护作用,其与鸭疫里氏杆菌毒力密切相关,且在鸭疫里氏杆菌诊断及疫苗研制中具有重要的应用价值。     

Exclusion of strain 670/89 as type strain for serovar 20 of Riemerella anatipestifer

Classical phenotypic characterisation and numeric analysis of whole-cell fatty acid patterns of twenty-one type strains of hitherto reported Riemerella anatipestifer serovars revealed that the type strain of serovar 20 does not belong to the species Riemerella anatipestifer sensu stricto and, therefore, it has to be excluded as a representative Riemerella anatipestifer serotype strain.     

鸭疫里默菌实验室诊断方法研究进展

鸭疫里默菌病是危害养鸭业的重大疾病之一,在临床初步诊断的基础上,实验室诊断必不可少。目前已报道的鸭疫里默菌实验室诊断方法主要有细菌的分离鉴定、琼脂扩散试验、凝集试验、荧光抗体试验、间接ELISA、PCR、间接免疫酶组化法等7种,文章对这些方法进行了综述。