金黄色葡萄球菌ClfA基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中ClfA基因序列设计特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得了约2 300 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建了克隆质粒pMD18-ClfA.用BamHⅠ和EcoR Ⅰ双酶切pMD18-ClfA和pET28a(+),将纯化的基因ClfA亚克隆至pET28a(+),构建重组质粒pET28a-ClfA,并将其转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在87 000处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带,Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性.     

Stx1A-LHRH融合毒素基因的构建及高效表达

通过PCR方法,从肠出血性大肠杆菌O157:H7的基因组DNA中扩增出Stx1A基因序列,并将之与编码LHRH的基因序列连接起来,构建编码Stx1A-LHRH的重组融合基因片段,并定向克隆到表达质粒pET28a的NcoⅠ和EcoRⅠ位点之间,构建重组表达质粒pET28a::stx1A-LHRH,将重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中。对重组菌株用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明重组菌株表达出了23700的目的融合蛋白Stx1A-LHRH,目的蛋白为包涵体表达,经薄层扫描分析表明表达量约占菌体总蛋白的37.6%。为了将来更好的进行目的蛋白的功能研究,本研究再将融合基因片段克隆到表达质粒pMAL-p2x中实现了重组蛋白的可溶性表达,表达的重组蛋白经amylose亲和层析柱一步纯化后纯度可达93.4%,为下一步进行重组蛋白的活性分析及其生物学作用研究奠定了基础。     

犬瘟热病毒贵州株融合蛋白基因原核表达质粒的构建

为了研究犬瘟热病毒贵州株(CDV-GZ1)完整融合蛋白(F),试验采用PCR方法以pMD18-F质粒为模板,利用特异性引物扩增获得大小为1 989 bp的目的 DNA,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32a(+)-F。结果表明:目的基因插入位置和阅读框均正确,说明F基因原核表达质粒构建成功;质粒pET32a(+)-F在BL21(DE3)中经诱导表达未获目的蛋白,说明CDV融合蛋白可能不适合在该表达系统中进行完整蛋白的表达。     

金黄色葡萄球菌FnBA活性基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(FnBA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了1 735 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-FnBA.以HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切pMD18-T-FnBA和pET28a(+),将纯化的基因FnBA亚克隆至pET28a(+)中,构建了原核表达质粒pET28a-FnBA,并将其转化至E.coli BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约85 000处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带.又经Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性.     

重组人γ-干扰素表达菌株的构建

从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出hIFN-γ基因.构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET32a(+)-hIFN-γ).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pET32a(+)-hIFN-γ含有hIFN-γ基因,且基因序列和阅读框架正确.经Western blot鉴定证实为hIFN-γ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达.表达产物占菌体总蛋白的52%.同时对其抗病毒活性进行了测定,从而为hlFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据.     

牛白细胞介素2基因原核表达及多克隆抗体制备

根据GenBank发表的牛白细胞介素2(BoIL-2)基因序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增出重组牛白细胞介素2(rBoIL-2)基因。将克隆片段与pMD18-T载体连接,并经过酶切及PCR鉴定,测序结果显示,克隆的BoIL-2基因与GenBank发表的BoIL-2基因序列同源性为98.7%。将测序正确的克隆片段与pET30a(+)载体连接,构建重组表达质粒pET30a(+)-rBoIL-2,通过双酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒进行序列测定后在大肠杆菌的表达,分子质量约为23.49 ku;表达产物主要分布在包涵体中。Western blotting证实所得到的重组蛋白为BoIL-2重组蛋白。用镍离子亲和树脂对所得的BoIL-2重组蛋白进行纯化,并免疫新西兰兔成功制备兔抗rBoIL-2多克隆抗体,为下阶段的研究提供了重要的试验材料。     

牛支原体p30蛋白的原核表达与鉴定

为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30(登录号为AIA33998.1)基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建的重组质粒pET28a(+)-p30转化至BL21(DE3)工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。     

金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ型蛋白的表达研究

为了研究金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ型的检测方法,诱导融合表达并纯化金黄色葡萄球菌肠毒素Ⅰ型蛋白,试验根据Gen Bank中SEⅠ的序列设计一对特异性引物,采用PCR技术从金黄色葡萄球菌中扩增出新型肠毒素Ⅰ型基因,亚克隆入p EASY-E1载体中,构建重组质粒p EASY-E1-SEⅠ,以IPTG诱导表达,镍柱纯化表达蛋白,用His标签单克隆抗体进行免疫印迹分析验证融合蛋白的表达。结果表明:成功扩增出SEⅠ基因,片段大小为507 bp,重组质粒高效表达SEⅠ融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定成功表达了分子质量约为26 ku的重组蛋白,Western-blot检测表明目的蛋白具有良好的免疫原性。说明表达系统p EASY-E1/BL21能高效表达金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ蛋白。     

塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化

利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792 bp SVV VP1与717 bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50 000 pET32a-VP1重组蛋白以及48 000 pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6 mmol/L诱导剂诱导5 h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌β-溶血素基因的克隆及原核表达载体的构建

根据GenBank中的金黄色葡萄球菌β-溶血素（hlb）基因序列,设计合成1对引物,采用PCR方法扩增出与预期设计大小相符的hlb基因特异性条带,将扩增出的DNA片段克隆到pMD18-T载体中,转化感受态细胞,经平板筛选,酶切鉴定,获得阳性重组质粒,对重组质粒进行序列测定,结果表明：金黄色葡萄球菌β-溶血素基因全长982bp,不含终止密码子的目的基因,插入的位点、大小与读码框均正确。将hlb基因插入到原核表达pET-32a中,转化到BL-21感受态细胞中,获得了表达hlb基因的阳性重组质粒。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的克隆与表达

构建pET32a重组表达载体,转化到BL21(DE3),诱导表达牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白。用已发表的IBRV的gD基因序列设计一对特异性引物,通过PCR方法扩增一条766bp的目的基因gD,将gD基因克隆到原核表达载体pet32a,得到重组表达载体pet32-gD,转化到BL21(DE)中,通过IPTG诱导获得融合蛋白。重组表达蛋白经纯化后,免疫印迹分析。结论证明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性分析

将从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)核酸进行PCR扩增,获得vp1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了CIAV vp1基因重组质粒,命名为pET32a-vp1。将 pET32a-vp1转化E.coli plys,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果表明,vp1基因在大肠杆菌中成功表达。纯化的蛋白质作为包被抗原,ELISA鉴定结果表明具有良好的抗原性。本试验结果为进一步研究用重组抗原制备CIAV ELISA诊断试剂盒奠定了基础。     

牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。     

重组鲢鱼抗菌肽parasinⅠ原核表达、纯化与抗菌活性

本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。     

猪β-防御素-2基因在大肠杆菌中的融合表达及抑菌活性检测

将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。     

禽呼肠孤病毒σC基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARV σC基因.将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达裁体pET32a-σC.该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h得到最佳表达.表达重组蛋白的相对分子质量为54 000,以包涵体形式存在.经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性.     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及反应原性分析

研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。     

新城疫病毒HN基因功能结构域的原核表达

本研究对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)分离株sc05的HN基因进行了克隆、序列测定,在此基础上将其C端功能结构域76－571 aa片段亚克隆到pET32a(＋)表达载体上,构建重组表达质粒pET32a-HN,鉴定正确后转化进BL21 plysS(DE3)细胞,筛选出阳性克隆,用1 mmol/L IPTG 诱导表达,并对表达产物进行鉴定。SDS-PAGE电泳结果显示,HN基因功能结构域片段在 BL21 plysS(DE3)细胞中实现融合表达,表达产物大小约为76 ku,Western blotting试验证实其能与NDV阳性血清反应。本研究为进一步研究HN蛋白功能结构域的免疫原性和研制鸡新城疫HN基因工程疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型CC株ORF3基因的克隆与原核表达

为原核表达猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF3编码蛋白,本研究采用PCR方法以PCV2的CC株的基因组DNA为模板扩增ORF3基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白约为31ku,并且以包涵体形式存在;western blot分析表明,ORF3重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达的ORF3重组蛋白具有良好的反应原性.