苜蓿根瘤菌转Sm nifA基因研究初报

外源固氮调节基因nifA的导入对根瘤菌的结瘤固氮效率有较明显的促进作用.首先构建带有Sm nifA基因的重组质粒,再利用三亲本杂交技术将重组质粒转移至苜蓿根瘤菌XM-1中,得到组成型表达Sm nifA基因的菌株,侵染苜蓿后,植株鲜重、干重、含氮量、结瘤数、固氮酶活等指标均优于原始出发菌.     

大豆快生根瘤菌SfHH103_03182基因突变体的构建和共生固氮表型分析

以大豆快生根瘤菌HH103中glnK同源基因SfHH103_03182为研究对象,采用pK19mob单插入失活技术构建该基因的插入失活突变体,菌落PCR和测序分析表明突变体构建正确。植物盆栽试验结果显示,与接种野生型菌株HH103相比,突变体接种植株的根瘤数量增多,植株鲜质量和根瘤鲜质量增加,根瘤固氮酶活无显著差异。在不同浓度氮素处理和盆栽条件下,对共生表型的检测表明突变体接种植物的根瘤数量没有显著变化。     

以luxAB为报告基因的大豆根瘤菌的竞争结瘤研究

将来自pHN101的luxAB基因和来自pTR102的parCBA /DE基因,经过一系列中间载体整合到PLAFR3上构建成广宿主、稳定性质粒PHN158。通过三亲本杂交将pHN158导入费氏中华根瘤菌得到4株能在癸醛的激发下发出荧光的转移接合子WZRL、HWRL、HZRL和WWRL。将它们与3株大豆慢生根瘤菌WHB1、WHB2和WWB组配成12对组合,并以黑龙33和Williams为宿主以luxAB为报告基因进行竞争结瘤试验。结果表明,费氏中华根瘤菌与大豆慢生根瘤菌之间的平均竞争结瘤能力相当;同类型根瘤菌不同菌株之间的竞争结瘤能力存在着显著的差异;同时根瘤菌的竞争结瘤能力也明显受到宿主的影响。表明费氏中华根瘤菌与大豆慢生根瘤菌之间的竞争结瘤是一个菌株之间、菌植之间复杂的相互作用的过程。     

接种根瘤菌后3个紫花苜蓿品种耐盐性综合评价

研究苜蓿中华根瘤菌共生3个耐盐性高的紫花苜蓿品种,以选育适宜在内蒙古盐渍土地区大量种植的紫花苜蓿品种。以内蒙古地区常见的3个紫花苜蓿品种(中苜1号、金皇后、阿尔冈金)为试验材料,利用不同浓度NaCl溶液(0、50、150 mmol/L)模拟盐害环境,对3个紫花苜蓿品种接种苜蓿中华根瘤菌,测定紫花苜蓿品种的地上部分鲜质量、根鲜质量、根瘤数、有效根瘤数、丙二醛(MDA)质量摩尔浓度、可溶性糖质量分数6项指标,依据隶属函数法进行耐盐性综合评价。当盐浓度达到50 mmol/L时,3个紫花苜蓿品种中金皇后与苜蓿中华根瘤菌共生耐盐效果最好,相比于不接种地上部分鲜质量增加6.14 g,MDA质量摩尔浓度低至0.91mmol/g,可溶性糖质量分数高达21.65 mg/g,在3个紫花苜蓿品种中膜脂过氧化程度最低,渗透调节能力最强。当盐浓度达到150 mmol/L时,接种苜蓿中华根瘤菌对3个紫花苜蓿品种影响微弱。耐盐性强弱依次为金皇后(接种RM)、中苜1号(接种RM)、阿尔冈金(接种RM)、中苜1号(未接种RM)、金皇后(未接种RM)、阿尔冈金(未接种RM)。不同盐浓度(0、50、150 mmol/L)对3个紫花苜蓿品种生长均有抑制作用,且抑制效果随盐浓度升高而增强。在轻度盐害(50 mmol/L)环境下,接种苜蓿中华根瘤菌有效缓解盐对紫花苜蓿的伤害,其中金皇后耐盐性最强。当重度盐害(150 mmol/L)发生时,接种苜蓿中华根瘤菌对紫花苜蓿作用效果不明显甚至不起作用。     

大豆根瘤菌HH103 rhcN突变对结瘤能力的影响

【背景】大豆是重要的经济作物,能够为人类提供大量的植物蛋白和油脂。大豆在生长过程中,能够与根瘤菌形成共生体系进行共生固氮,该形式的共生固氮能够将空气中的氮气还原成氨,为大豆生长发育提供丰富氮源。根瘤菌Ⅲ型分泌系统是根瘤菌中重要的蛋白分泌结构,能够通过分泌Ⅲ型效应因子在共生体系建立过程中发挥重要调控作用。根瘤菌rhcN编码一种ATP转移酶,是根瘤菌Ⅲ型分泌系统的重要组成部分,能够保障根瘤菌Ⅲ型效应因子向宿主细胞的正常分泌。【目的】探索rhcN突变情况下对根瘤菌结瘤能力的影响,提高大豆-根瘤菌共生体系的固氮效率,为大豆农业生产提供必要的参考和支持。【方法】通过三亲杂交和同源重组,在rhcN起始密码子ATG下游插入了一个Km抗性基因,利用PCR扩增和Southern blot对插入情况进行验证,从而构建rhcN插入突变体HH103ΩrhcN。利用大豆染料木苷（Genistin）对野生型根瘤菌HH103及HH103ΩrhcN突变体进行诱导,并对处理组合对照组进行胞外蛋白纯化,通过Western blot检测rhcN突变对根瘤菌III型效应因子NopC及NopT分泌的影响。利用双层钵植物培养系统对大豆Williams82进行野生型根瘤菌HH103和HH103ΩrhcN突变体接种,分析rhcN突变对根瘤表型的影响。利用前期收集的100份基因型差异的大豆品种进行结瘤能力鉴定,分析根瘤菌Ⅲ型效应因子分泌异常情况下在不同基因型大豆品种中的结瘤表现。【结果】通过PCR扩增和Southern blot验证了成功构建的HH103ΩrhcN突变体,胞外蛋白鉴定表明rhcN突变能够抑制根瘤菌Ⅲ型效应因子NopC和NopT分泌。利用HH103ΩrhcN突变体和野生型HH103在Williams82进行结瘤鉴定,结果表明,rhcN突变能够显著抑制根瘤数和根瘤干重。对100份基因型差异的大豆品种进行结瘤鉴定,结果表明,rhcN突变能够引起其中80份大豆资源根瘤数目降低,13份根瘤数目显著升高,7份不发生显著性变化。【结论】rhcN突变能够引起根瘤菌Ⅲ型效应因子的异常分泌,进而能够影响共生体系的建立。根瘤菌III型效应因子在大豆-根瘤菌共生体系形成过程中发挥着重要作用,并且不同基因型大豆遗传背景对根瘤菌Ⅲ型效应因子具有不同应对反应。     

以luxAB为报告基因的大豆根瘤菌的竞争结瘤研究

 将来自pHN101的luxAB基因和来自pTR102的parCBA /DE基因,经过一系列中间载体整合到PLAFR3上构建成广宿主、稳定性质粒PHN158。通过三亲本杂交将pHN158导入费氏中华根瘤菌得到4株能在癸醛的激发下发出荧光的转移接合子WZRL、HWRL、HZRL和WWRL。将它们与3株大豆慢生根瘤菌WHB1、WHB2和WWB组配成12对组合,并以黑龙33和Williams为宿主以luxAB为报告基因进行竞争结瘤试验。结果表明,费氏中华根瘤菌与大豆慢生根瘤菌之间的平均竞争结瘤能力相当;同类型根瘤菌不同菌株之间的竞争结瘤能力存在着显著的差异;同时根瘤菌的竞争结瘤能力也明显受到宿主的影响。表明费氏中华根瘤菌与大豆慢生根瘤菌之间的竞争结瘤是一个菌株之间、菌植之间复杂的相互作用的过程。     

盐碱土高效固氮蚕豆根瘤菌的筛选

通过对云南玉溪澄江大白豆(宿主植物)的根瘤采集及根瘤菌的分离纯化,获得了36株蚕豆(Vicid faba Linn)根瘤菌。为进一步探讨所得根瘤菌的结瘤固氮能力,采用土壤盆栽的方法 ,将这些根瘤菌回接到蚕豆小青皮上。植物生长70 d以后,观察生长状况,综合株高、地上部分干重、结瘤数等生长指标,筛选出2株高效固氮根瘤菌菌株Hbu610041和Hbu610055,为蚕豆的实际生产准备了根瘤菌接种菌株资源。     

苜蓿中华根瘤菌共生固氮相关基因突变体的分离和鉴定

为了阐明豆科植物共生反应与免疫反应的协调机制,揭示参与植物细胞侵染、定殖及固氮过程中根瘤菌基因的功能,以苜蓿中华根瘤菌Sm2011为材料,构建了约8 000株Tn5-sacB转座子插入的突变体库。利用巢式PCR检测技术,从中鉴定和筛选出nodC、nifH、smc01188和smc04024等4个特定目标基因的插入突变体及其插入位点。通过结瘤试验考察突变体共生及固氮表型,结果显示:植株接种smc01188突变体28d后,与对照植株相比,该基因突变导致根瘤固氮酶活下降,与慢生型大豆根瘤菌该基因突变体的表型类似;smc04024基因突变不影响植株生长,根瘤发育基本正常;接种nifH突变体后,植株呈缺氮表型,生长发育受阻,根瘤为白色;接种nodC突变体后植株不结瘤,说明Tn5-SacB的插入导致nifH、nodC基因功能丧失。利用PCR检测、鉴定和分离目标基因突变体是一种行之有效的方法。     

不同施肥条件下接种根瘤菌对鲜食大豆结瘤和产量的影响

为探索不同根瘤菌和减施氮肥对鲜食大豆结瘤和产量的影响,通过盆栽试验,设置不接种根瘤菌常规施肥(CK1)、不接种根瘤菌减氮施肥(CK2)、接种慢生型大豆根瘤菌USDA110常规施肥(U1)、接种慢生型大豆根瘤菌USDA110减施氮肥(U2)、接种费氏中华根瘤菌CCBAU45436常规施肥(C1)和接种费氏中华根瘤菌CCBAU45436减施氮肥(C2)处理,研究不同施肥水平和根瘤菌接种水平下鲜食大豆的根瘤数、根瘤质量、根瘤固氮酶活性和产量的差异.结果表明,在常规施肥水平下,花荚期C1处理的根瘤数大于CK1处理,差异极显著;根瘤质量、根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.采青期C1处理根瘤数大于CK1处理,差异极显著,C1处理的根瘤鲜质量、根瘤干质量也显著大于CK1,根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.减氮施肥水平下,花荚期U2处理的根瘤数显著大于CK2处理;U2处理的根瘤鲜质量、根瘤干质量显著大于C2处理,与CK2无显著差异;根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.采青期C2处理的根瘤数显著大于U2处理,根瘤鲜质量、根瘤干质量和根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.不接种根瘤菌水平下,花荚期和采青期CK1、CK2处理的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量和根瘤的固氮酶活性无显著差异.接种USDA110根瘤菌水平下,花荚期U2处理的根瘤固氮酶活性显著高于U1处理,采青期差异不显著;花荚期、采青期的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量在U1处理与U2处理间均无显著差异.接种CCBAU45436根瘤菌水平下,花荚期C2处理的根瘤固氮酶活性显著高于C 1处理,采青期差异不显著;花荚期、采青期的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量在C 1处理与C2处理间均无显著差异.综合说明,接种根瘤菌影响了鲜食大豆的结瘤情况,但对根瘤的固氮酶活性影响不大.减施氮肥影响了花荚期鲜食大豆根瘤的固氮酶活性,但对结瘤影响不大.不同施肥水平和根瘤菌接种水平下各处理间产量均无显著差异,但U2、C2处理的鲜食大豆单株鲜籽粒产量比CK1处理分别提高了4.61％、4.24％,在减施氮肥后接种根瘤菌提高了鲜食大豆的产量.     

紫花苜蓿根瘤菌研究进展

对苜蓿根瘤菌资源生物多样性采集与保藏、苜蓿根瘤菌的田间应用研究、苜蓿根瘤菌固氮机理的研究、影响苜蓿根瘤菌固氮效率的主要因子、苜蓿根瘤菌结瘤基因及其表达调控、结瘤基因与结瘤因子、根瘤菌分类研究历史与现状进行了综述,并对苜蓿根瘤菌的研究进展进行了浅评,提出广泛开展苜蓿根瘤菌资源调查,筛选和培育建立各个苜蓿品种的高效共生固氮体系、开辟苜蓿根瘤菌溶磷和分泌生长激素的研究是目前苜蓿根瘤菌研究的重点。     

根瘤菌竞争结瘤的研究进展

近年来已通过自然选育或基因工程技术获得了不少具有高效固氮能力的菌株。并在人工控制的条件下证明它们能够使豆科作物显著增产。但由于人工接种剂与土著根瘤菌的竞争结瘤问题一直未得到很好解决，阻碍了这些高效固氮菌株田间应用效果的发挥。尽管人们对这一问题已进行了大量的研究。但也根瘤菌结瘤基因的研究相比。我们对根瘤菌的竞争结瘤机制的认识仍非常有限。已有的研究结果表明，影响根瘤菌竞争结瘤的因素主要包括根瘤菌与宿主植物的遗传基因和生态学因素两个方面。     

紫云英根瘤菌不同菌株间结瘤竞争能力的比较

通过竞争结瘤试验研究紫云英根瘤菌不同菌株间的竞争结瘤能力,以紫云英宁波大桥品系为宿主植物,7株分离自不同生境紫云英根部瘤体内的菌株与中慢生华癸根瘤菌7653R为研究对象,采用单独接种、与7653R菌株1∶1混合接种方式,在30 d时采样,统计根瘤数量、根瘤质量、不同菌株的占瘤率、定殖能力等。结果发现,紫云英根瘤菌2号菌株的竞争能力与7653R相当,其他菌株的竞争性都不同程度地弱于7653R,尤其是1号菌株的定殖能力最弱,仅是7653R占瘤率的9%。在同时含有2种根瘤菌的瘤体内,7653R和竞争菌株的数量比例相近。不同生境根瘤菌的竞争结瘤能力存在差异,试验同时获得了1株与经典菌株7653R竞争能力相当的紫云英根瘤菌菌株。     

外源共生基因对紫云英根瘤菌共生效率的影响

 将豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI、含紫云英根瘤菌共生基因的重组质粒pRaZ15及含苜蓿根瘤菌共生基因的重组质粒pRmSL26导入紫云英根瘤菌野生型菌株7653R，然后对3种转移接合子的共生固氮效率进行了比较全面的测定。结果表明：转移接合子7653R（pJB5JI）的共生固氮能力较出发菌株7653R大幅度提高，而且表现出较高的竞争结瘤能力，转移接合子7653R（pRmSL26）在固氮酶活性、植物干重及结瘤数方面亦显著高于对照菌株7653R；转移接合子7653R（pRaZ15）虽然在固氮酶活性及植物干重方面没有发现显著性差异，但结瘤数显著减少。     

MCHK＿7135基因在华癸中慢生根瘤菌共生固氮中的功能

为研究MCHK＿7135基因在根瘤菌与宿主植物共生固氮中的功能,用同源重组的方法构建了MCHK＿7135基因的突变体及回补菌株,对突变菌株和回补菌株在人工培养条件以及与宿主植物紫云英共生下的各项表型进行了考察,结果显示：与野生型菌株相比,突变菌株对氧胁迫的敏感性增强;接种突变株的紫云英长势矮小,侵染线及根瘤原基数目减少,根瘤数量少,固氮酶活性低,而向突变菌株导入完整MCHK＿7135基因后,各项共生表型得到不同程度恢复。研究结果表明,华癸中慢生根瘤菌的过氧化物还原酶基因MCHK＿7135基因在根瘤菌与宿主植物共生固氮的过程中具有重要功能。     

费氏中华根瘤菌菌株HH103研究概述

大豆既可以与快生型根瘤菌又可以与慢生型根瘤菌共生固氮。在以往的研究中,已有很多从不同地区的大豆根部分离出来的快生型根瘤菌,这些快生型根瘤菌大多数属于费氏中华根瘤菌属。模式菌株费氏中华根瘤菌菌株HH103现被用于基因序列的研究。该研究从根瘤和根瘤菌的分类依据和主要类型入手,介绍了HH103的主要研究现状,并且讨论其研究方向。     

根瘤菌-豆科植物共生多样性与地理环境的关系

 根瘤菌与豆科植物形成的根瘤或茎瘤固氮共生体系在农、林、牧业的可持续发展中具有重要作用。 10 0多年前 ,在根瘤菌研究的起始阶段 ,人们提出的“宿主专一性”及“互接种族”2个概念一直流传至今。 2 0世纪 4 0年代 ,有学者根据实验室内豆科植物的交叉结瘤结果否定过“互接种族”的观念 ,70～ 80年代又发现某些根瘤菌在实验室条件下有广谱共生现象。但根瘤菌与豆科植物共生体与地理环境的关系却很少被涉及过。本文在对大量根瘤菌进行分类研究的基础上 ,结合宿主植物及其区域地理环境的综合分析 ,揭示出根瘤菌与豆科植物     

苜蓿中华根瘤菌Rm1021中gtrA基因的克隆、表达及纯化

对苜蓿中华根瘤菌中GntR家族转录因子基因gtrA进行了表达和纯化,以期进一步研究其功能.以苜蓿根瘤菌Rm1021的基因组为模板,PCR扩增出gtrA基因,并克隆到表达载体PET-28b(+)上.重组质粒经酶切和测序证实正确,然后转化大肠杆菌BL21.'SDS-PAGE显示经IPTG诱导后能得到和理论值大小一致的蛋白条带,通过进一步纯化得到gtrA的表达蛋白.     

gusA基因检测慢生花生根瘤菌竞争性的研究

采用大肠杆菌和根瘤菌接合的方法,将gusA标记基因分别导入了2株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中。结果表明,gusA基因在2株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中可以有效表达;对出发菌株和标记菌株的代时测定结果表明,二者之间没有显著差异;在标记菌株与出发菌株等量接种的前提下,比较了二者的竞争结瘤能力,结果表明,标记菌株形成的根瘤(蓝瘤)的占瘤率与出发菌株差异不显著;为了研究标记菌株与出发菌株的固氮有效性,测定了标记菌株与出发菌株各自共生植株的干重、全氮和叶绿素含量,结果表明,标记菌株与出发菌株的这3项指标之间没有显著差异。这说明利用gusA基因研究慢生根瘤菌的竞争结瘤能力是可行的。     

紫云英根瘤菌分子遗传学研究进展

总结了紫云英根瘤菌分子遗传学研究进展。这类根瘤菌的寄主范围较窄，早先根据互接种族概念将其定名为Rhizobium astragali。后来定名为Rhizobium huakuii。最近并入Mesorhizobium属，对大量菌株进行的16S和23SrDNAPCR-RFLP分析和代表菌株的部分16SrDNA碱基测序，揭示了7个不同基因型，表明这类菌具有遗传多样性。可以认为存在不同的种，它们都有质粒，数量1-5个，因菌株而异，可分为不同质粒型。共生基因常定位在最大的一个质粒上，即共生质粒，它们的结瘤基因具有独特结构。采用包括nodA,nodB。noC,nodD的苜蓿根瘤菌突变株进行基因互补，从紫云英根瘤蓖基因文库中获得了相应的转移接合子，这类结瘤基因的这种结构在7个基因型的菌株中都是一致的，说明结瘤基因的保守性。     

nolA基因在费氏中华根瘤菌中的验证及对结瘤的影响

根据已公布的大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)nolA基因序列(AF322013),设计了一对保守区的特异性引物和一对非保守区的全长基因引物,通过PCR扩增发现在个别费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)如HH21中也存在nolA基因。结瘤抑制实验结果表明:含有nolA基因的费氏中华根瘤菌HH21也有种群密度依赖性调节的结瘤抑制现象。