ACC脱氨酶对大豆快生根瘤菌及苜蓿中华根瘤菌共生固氮与竞争结瘤的影响

利用大肠杆菌S17-1与根瘤菌进行两亲本接合转移,将苜蓿中华根瘤菌Sm1021中的ACC脱氨酶基因导入大豆快生根瘤菌HH103,在苜蓿中华根瘤菌Sm1021中过表达ACC脱氨酶基因,探讨ACC脱氨酶对根瘤菌共生固氮及竞争结瘤的影响。结果显示:接种过表达ACC脱氨酶的重组根瘤菌Sm1021,宿主植物地上部分鲜质量与结瘤数量有所增加;接种外源导入ACC脱氨酶的重组根瘤菌HH103,能够增加结瘤数,提高植物地上部分干质量且竞争结瘤能力增强。但是,接种2种重组根瘤菌后,宿主植物的根瘤鲜质量和根瘤固氮酶酶活性无明显变化。     

苜蓿中华根瘤菌共生固氮相关基因突变体的分离和鉴定

为了阐明豆科植物共生反应与免疫反应的协调机制,揭示参与植物细胞侵染、定殖及固氮过程中根瘤菌基因的功能,以苜蓿中华根瘤菌Sm2011为材料,构建了约8 000株Tn5-sacB转座子插入的突变体库。利用巢式PCR检测技术,从中鉴定和筛选出nodC、nifH、smc01188和smc04024等4个特定目标基因的插入突变体及其插入位点。通过结瘤试验考察突变体共生及固氮表型,结果显示:植株接种smc01188突变体28d后,与对照植株相比,该基因突变导致根瘤固氮酶活下降,与慢生型大豆根瘤菌该基因突变体的表型类似;smc04024基因突变不影响植株生长,根瘤发育基本正常;接种nifH突变体后,植株呈缺氮表型,生长发育受阻,根瘤为白色;接种nodC突变体后植株不结瘤,说明Tn5-SacB的插入导致nifH、nodC基因功能丧失。利用PCR检测、鉴定和分离目标基因突变体是一种行之有效的方法。     

华癸中慢生根瘤菌7653R SraG sRNA的共生固氮功能

基于前期对华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653RsRNA(small non-coding RNA,sRNA)的生物信息学预测,经Northern blot验证获得SraGsRNA。本研究采用RACE与转录组高通量深度测序确定了SraG全长,并分别利用RNAfold软件和TargetRNA软件预测了SraG二级结构和靶位点,进而构建了M.huakuii 7653R的SraG插入失活突变体(M.huakuii SraGmut),并对突变体接种紫云英的共生表型进行了检测。盆栽试验结果表明,与野生型菌株M.huakuii 7653R相比,接种突变株M.huakuii SraGmut的固氮能力显著下降,突变株固氮酶活性下降约40%,植株鲜质量和根瘤数目也显著降低。结果表明,SraG的功能与M.huakuii 7653R的共生固氮过程相关,作为sRNA可能参与根瘤菌的共生固氮调控过程。     

大豆根瘤菌HH103 rhcN突变对结瘤能力的影响

【背景】大豆是重要的经济作物,能够为人类提供大量的植物蛋白和油脂。大豆在生长过程中,能够与根瘤菌形成共生体系进行共生固氮,该形式的共生固氮能够将空气中的氮气还原成氨,为大豆生长发育提供丰富氮源。根瘤菌Ⅲ型分泌系统是根瘤菌中重要的蛋白分泌结构,能够通过分泌Ⅲ型效应因子在共生体系建立过程中发挥重要调控作用。根瘤菌rhcN编码一种ATP转移酶,是根瘤菌Ⅲ型分泌系统的重要组成部分,能够保障根瘤菌Ⅲ型效应因子向宿主细胞的正常分泌。【目的】探索rhcN突变情况下对根瘤菌结瘤能力的影响,提高大豆-根瘤菌共生体系的固氮效率,为大豆农业生产提供必要的参考和支持。【方法】通过三亲杂交和同源重组,在rhcN起始密码子ATG下游插入了一个Km抗性基因,利用PCR扩增和Southern blot对插入情况进行验证,从而构建rhcN插入突变体HH103ΩrhcN。利用大豆染料木苷（Genistin）对野生型根瘤菌HH103及HH103ΩrhcN突变体进行诱导,并对处理组合对照组进行胞外蛋白纯化,通过Western blot检测rhcN突变对根瘤菌III型效应因子NopC及NopT分泌的影响。利用双层钵植物培养系统对大豆Williams82进行野生型根瘤菌HH103和HH103ΩrhcN突变体接种,分析rhcN突变对根瘤表型的影响。利用前期收集的100份基因型差异的大豆品种进行结瘤能力鉴定,分析根瘤菌Ⅲ型效应因子分泌异常情况下在不同基因型大豆品种中的结瘤表现。【结果】通过PCR扩增和Southern blot验证了成功构建的HH103ΩrhcN突变体,胞外蛋白鉴定表明rhcN突变能够抑制根瘤菌Ⅲ型效应因子NopC和NopT分泌。利用HH103ΩrhcN突变体和野生型HH103在Williams82进行结瘤鉴定,结果表明,rhcN突变能够显著抑制根瘤数和根瘤干重。对100份基因型差异的大豆品种进行结瘤鉴定,结果表明,rhcN突变能够引起其中80份大豆资源根瘤数目降低,13份根瘤数目显著升高,7份不发生显著性变化。【结论】rhcN突变能够引起根瘤菌Ⅲ型效应因子的异常分泌,进而能够影响共生体系的建立。根瘤菌III型效应因子在大豆-根瘤菌共生体系形成过程中发挥着重要作用,并且不同基因型大豆遗传背景对根瘤菌Ⅲ型效应因子具有不同应对反应。     

华癸中慢生根瘤菌7653R MCHK_8182基因的共生固氮功能

根据华癸中慢生根瘤菌7653R全局转录组分析结果,获得在共生固氮阶段显著上调表达的基因MCHK_8182;设计重叠延伸PCR引物,构建MCHK_8182双交换突变重组质粒载体;通过三亲本杂交,将突变载体导入7653R;在蔗糖压力培养下进行筛选,最终获得MCHK_8182双交换突变株。PCR及测序验证双交换突变株构建成功。植物盆栽试验结果显示,与7653R野生型接种的植株相比,MCHK_8182突变菌株接种的植株根瘤数减少,但固氮酶活未见明显差异。     

拟南芥抗根结线虫和蚜虫的功能基因鉴定

为了鉴定出增强植物对根结线虫和蚜虫抗性的功能基因,从9个抗蚜虫的拟南芥激活标签突变体中筛选增强根结线虫抗性的突变体。利用反向PCR技术定位激活标签在基因组上的插入位点,并通过荧光定量PCR技术分析插入位点上、下游基因表达水平,结合根结线虫和蚜虫在过量表达转基因植株上的表现验证基因功能。结果显示接种根结线虫后7 d,侵入3个拟南芥突变体根系的根结线虫数量明显少于野生型。其中2个突变体中的激活标签插入位点只相差2个碱基,SKS13基因表达水平提高;另一个株系中激活标签导致PERK2基因的表达水平提高。与野生型植株相比,分别过量表达SKS13和PERK2的转基因植株能明显减少侵入根系的根结线虫数量,同时蚜虫的繁殖数量也较低。     

利用EMS筛选豆科模式植物百脉根的根瘤突变体及突变部位

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,被根瘤菌感染后形成根瘤,根瘤菌固定氮素变换成铵态氮,植物利用铵态氮进行营养生长,而根瘤菌利用植物供给的碳酸同化产物为能源。为获得根瘤的成熟、维持的基因,本研究利用化学诱变试剂EMS处理百脉根MG-20得到多种突变体,筛选根瘤成熟、维持有异常的突变植株,利用SSR标记和dCAPS标记进行基因定位。结果表明:约10万M2百脉根植株中获得nup85突变体2株,nup133突变体4株,pollux突变体6株,ccamk、symrk、castor、nin、nfr1、nfr5突变体各1株等不结瘤突变体(Nod~-)18株;结无效根瘤突变体(Fix~-)6株并确定了突变体的突变部位。     

不同施肥条件下接种根瘤菌对鲜食大豆结瘤和产量的影响

为探索不同根瘤菌和减施氮肥对鲜食大豆结瘤和产量的影响,通过盆栽试验,设置不接种根瘤菌常规施肥(CK1)、不接种根瘤菌减氮施肥(CK2)、接种慢生型大豆根瘤菌USDA110常规施肥(U1)、接种慢生型大豆根瘤菌USDA110减施氮肥(U2)、接种费氏中华根瘤菌CCBAU45436常规施肥(C1)和接种费氏中华根瘤菌CCBAU45436减施氮肥(C2)处理,研究不同施肥水平和根瘤菌接种水平下鲜食大豆的根瘤数、根瘤质量、根瘤固氮酶活性和产量的差异.结果表明,在常规施肥水平下,花荚期C1处理的根瘤数大于CK1处理,差异极显著;根瘤质量、根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.采青期C1处理根瘤数大于CK1处理,差异极显著,C1处理的根瘤鲜质量、根瘤干质量也显著大于CK1,根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.减氮施肥水平下,花荚期U2处理的根瘤数显著大于CK2处理;U2处理的根瘤鲜质量、根瘤干质量显著大于C2处理,与CK2无显著差异;根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.采青期C2处理的根瘤数显著大于U2处理,根瘤鲜质量、根瘤干质量和根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.不接种根瘤菌水平下,花荚期和采青期CK1、CK2处理的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量和根瘤的固氮酶活性无显著差异.接种USDA110根瘤菌水平下,花荚期U2处理的根瘤固氮酶活性显著高于U1处理,采青期差异不显著;花荚期、采青期的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量在U1处理与U2处理间均无显著差异.接种CCBAU45436根瘤菌水平下,花荚期C2处理的根瘤固氮酶活性显著高于C 1处理,采青期差异不显著;花荚期、采青期的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量在C 1处理与C2处理间均无显著差异.综合说明,接种根瘤菌影响了鲜食大豆的结瘤情况,但对根瘤的固氮酶活性影响不大.减施氮肥影响了花荚期鲜食大豆根瘤的固氮酶活性,但对结瘤影响不大.不同施肥水平和根瘤菌接种水平下各处理间产量均无显著差异,但U2、C2处理的鲜食大豆单株鲜籽粒产量比CK1处理分别提高了4.61％、4.24％,在减施氮肥后接种根瘤菌提高了鲜食大豆的产量.     

基因激活标签体系及其在植物功能基因组学研究中的应用

利用传统的基因缺失产生的突变体的方法来鉴定基因的功能效率很低,因为对于发育早期的基因特别是配子发育相关的基因以及冗余基因,这种突变体显得无能为力,前者基因纯合突变体导致死亡、而后者由于冗余基因之间的功能互补而不显示任何表型。而通过基因激活标签技术可以获得显性突变体即功能获得型突变体,为研究这类基因的功能提供了一个重要的手段。基因激活标签技术是指含有35S增强子或启动子的T-DNA或转座子若插入基因内,可导致插入突变,引起插入失活突变体的产生;若插入基因附近（上游或下游）,则可能激活正常情况下不表达或表达极弱的基因,导致显性功能获得（dominantgain-of-function）性突变。近年来通过T-DNA或转座子介导的方法建立了多种植物的基因激活标签突变体库,在植物基因功能研究中发挥了重要作用,使一些由多个基因或基因家族决定的功能的研究获得突破性进展。就植物基因激活标签技术的原理,特点和创制方法以及在植物生长发育、代谢等一系列方面研究中的应用进行了阐述,并对该技术的发展趋势进行了较为详细的探讨。     

百脉根无效根瘤突变体的生物量及无效根瘤的电镜观察分析

百脉根是研究豆科植物根瘤形成和共生固氮分子机理的一种重要模式植物.为探索百脉根根瘤的形成机制,以EMS诱导野生MG-20突变并筛选的No.1006,No.486和No.2568等3种无效根瘤突变体为材料,测定其突变体植株生物量、根瘤数及固氮能,并对无效根瘤中根瘤菌感染的细胞进行电镜观察.结果表明:No.1006是根瘤原基突变体,No.486是白色无效根瘤突变体,No.2568是绿色无效根瘤突变体;这3种无效根瘤突变体植株生长至30d时,根瘤数和固氮能以及株高、地上部干质量、根干质量和根长等生物量与MG-20野生株差异无统计学意义(p0.05),但生长至40d开始均显著低于野生株(p0.05).No.486的白色无效根瘤和No.2568的绿色无效根瘤,经切片后在电镜下观察,无效根瘤细胞均存在不同程度的破坏;其中No.2568的绿色无效根瘤的细胞和由根瘤菌转化来的类菌体的破坏程度远大于No.486的白色根瘤.     

MCHK＿7135基因在华癸中慢生根瘤菌共生固氮中的功能

为研究MCHK＿7135基因在根瘤菌与宿主植物共生固氮中的功能,用同源重组的方法构建了MCHK＿7135基因的突变体及回补菌株,对突变菌株和回补菌株在人工培养条件以及与宿主植物紫云英共生下的各项表型进行了考察,结果显示：与野生型菌株相比,突变菌株对氧胁迫的敏感性增强;接种突变株的紫云英长势矮小,侵染线及根瘤原基数目减少,根瘤数量少,固氮酶活性低,而向突变菌株导入完整MCHK＿7135基因后,各项共生表型得到不同程度恢复。研究结果表明,华癸中慢生根瘤菌的过氧化物还原酶基因MCHK＿7135基因在根瘤菌与宿主植物共生固氮的过程中具有重要功能。     

大豆生长发育与根瘤形成的关系

为明确根瘤生长发育与大豆生长发育的关系,通过温室盆栽试验持续观察和研究了不同生长时期大豆根长、根系生物量、株高、植株生物量、根瘤重量和数量的变化关系。结果表明,大豆整个生育期内株高、植株干重、根系干重和根瘤鲜重的变化均从缓慢增长、迅速增加、到迅速下降、再到缓慢下降的过程。株高、植株干重、根系干重和根瘤鲜重的最大值分别出现在苗后的66天、72天、66天和60天。根长在出苗后一直处于较快增长期,到出苗后48天到78天均维持在一个不显著的缓慢增长期。而根瘤数量在出苗后的20天至30天迅速激增,然后经过一个缓慢增殖期,至54天达到最大值后开始下降。由此得出,大豆根瘤数量在植株生长早期迅速增长且在最大值附近维持较长时期;而根瘤鲜重生长规律同植株地下部或地上部干重的增殖规律相似。     

双接种对大豆利用不同有机磷源的影响

以有机磷为磷源,采用盆栽试验研究了接种根瘤菌、丛枝菌根真菌(AMF)和双接种对大豆吸收磷的影响。结果表明,不同磷肥处理植株干物重分别比对照增加了9.40%、7.28%和5.84%;双接种和单接种AMF真菌,大豆单个根瘤鲜重和单个根瘤干重显著增加;双接种比单接种真菌,大豆菌根侵染率显著提高。与相应的不接种对照相比,植酸钠和卵磷脂双接种处理植株吸磷量分别比对照增加了34.96%和33.78%,表明有机磷源双接种可显著提高植株有机磷的利用能力。菌根真菌和固氮微生物双接种对促进作物生长有重要意义。     

水稻卷叶突变体rlm1的基因克隆

叶片是植物光合作用的主要场所,优良的叶片形态有利于塑造理想的株型,提高光合效率。为了研究叶片形态建成的分子机制,自水稻T-DNA插入突变体库中筛选获得1个叶片半卷曲的卷叶突变体(roll leaf mutant,命名为rlm1),突变体rlm1主要特征为成熟叶片沿中脉向内卷,叶片最终卷成直立半圆筒状,叶片卷曲度达0.64,叶片直立参数达95,且光合效率显著优于野生型。通过图位克隆技术,确定突变体rlm1突变位点位于LOC_Os03g06654基因的第1个内含子,LOC_Os03g06654基因编码黄素单氧化酶(flavin-containing monooxygenase),RT-PCR表达分析表明LOC_Os03g06654基因因T-DNA插入而导致完全失活。该基因与已报道的水稻卷叶基因Os COW1(Constitutively Wilted 1)为等位基因,而且突变体rlm1所表现的农艺性状均佳,可期待利用该突变体进行高光合的育种实践。     

百脉根小GTPase ROPs 基因反转座子插入突变体的分离和鉴定

为研究ROP(Rho-related GTPase of plants,ROP)在豆科植物共生固氮过程中的功能和作用机制,从百脉根逆转录转座子LORE1插入突变体库(http://www.kazusa.or.jp/lotus)中搜索到6个ROP相关基因突变体,通过分离和鉴定,得到不同突变体的M1代和M2代纯合体种子,对M2代进行表型鉴定及统计分析。结果表明:在早期共生表型的鉴定中,突变体与野生型植株相比,rop-like1植株的根瘤原基数明显下降,rop-like4植株的侵入线数和侵入线密度也明显下降;但仅rop-like1植株在接种14d后的结瘤数明显减少。     

百脉根小GTPase激活蛋白的鉴定及突变体分离

以豆科植物百脉根为材料,利用蛋白质相互作用技术、基因表达分析和突变体表型观察研究了小GTPase激活蛋白RacGAP1和RacGAP3在侧根及根瘤发育中的功能。结果表明:百脉根小GTPase激活蛋白RacGAP1和RacGAP3能与ROP6~(CA)相互作用,RacGAP1和RacGAP3基因主要在根微管组织中表达,在接种根瘤菌后呈下调表达趋势。RacGAP1在侧根及根瘤原基中无表达;RacGAP3则能在侧根及根瘤基部表达。RacGAP1和RacGAP3的LORE1插入突变体表型观察显示,纯合突变体与Gifu野生型共生表型无明显差异,但RacGAP1突变体植株开花后,花朵枯萎掉落不结荚,而杂合体与野生型无差异,表明RacGAP1可能参与调控花粉发育过程,而RacGAP3在早期共生过程中可能起负调控作用。     

华癸中慢生根瘤菌焦磷酸硫胺素结合蛋白基因tpp的功能研究

在构建M.huakuii tpp基因突变株的基础上,通过自生生长和植物盆栽试验,研究焦磷酸硫胺素结合蛋白tpp基因在根瘤菌的生长及与紫云英宿主共生固氮过程中的功能。通过同源重组获得华癸中慢生根瘤菌tpp突变菌株HKtpp,并进一步研究tpp基因突变对菌株生长及共生固氮功能的影响。结果显示:tpp基因突变会减缓菌株生长,突变菌株胞内的谷胱甘肽还原酶活性显著降低。植物盆栽试验表明,突变菌株感染紫云英宿主形成有效的红色根瘤,但是其固氮酶活降低了26.4%。结果表明:tpp基因在根瘤菌的生长和共生固氮中发挥着重要作用。     

拟南芥LOF1基因在赤霉素调控开花过程中的功能

以拟南芥侧生器官融合基因LOF1的T-DNA插入突变体lof1-2和p35S:LOF1过表达转基因植株为研究材料,通过观察突变体和过表达转基因植株的表型及其对赤霉素的响应,探讨了该基因在赤霉素调控开花过程中的功能.结果表明,LOF1基因在拟南芥中的过表达导致转基因植物提前开花.突变体lof1-2对施加的外源赤霉素更加敏...     

香蕉枯萎病4号小种T-DNA 插入突变体 Focr4-1453表型特征及致病性分析

尖孢镰刀菌古巴转化型是引起香蕉枯萎病的主要病原菌,呈世界多态性分布,其致病机理尚不清楚。 Focr4-1453 为T-DNA 插入突变体库中筛选出的一株与致病性相关的突变体。在克隆出其失活基因之后,将“生型 菌株中的相同基因进行敲除和互补,得到敲除突变体驻Foc4-1453 和互补突变体驻Foc4-1453-cp-1。对获得的3 株 突变体进行生物学表型研究发现,这些菌株的菌落生长速度、产孢能力以及孢子萌发率较“生型菌株明显降低,且 无法透过玻璃纸进行生长。致病性测定试验表明,该基因失活会导致病原菌侵染能力显著减弱。     

CMV—Pf—CP基因表达载体的构建及转化西番莲（Passiflora edulis）的研究

以黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV)西番莲分离物的外壳蛋白基因（CMV－Pf-CP)为目的基因，插入pBI121质粒35S启动子后，构建了植物表达载体pBIC；以子叶和胚轴为外植体，初步建立了西番莲转基因体系，采用土壤根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导法进行西番莲转化研究，获得了抗卡那霉的转基因再生植株。通过对所获得的再生植株进行PCR扩增检测，结果表明CMV－Pf-CP基因已导入西番莲植株中。