分子伴侣Jiv90基因的克隆及其在猪脐静脉血管内皮细胞中的表达

为研究分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制的影响,克隆了分子伴侣Jiv90基因,构建了真核表达载体并在猪脐静脉血管内皮细胞中表达。根据牛的Jiv90基因序列和真核表达载体pEGFP-C1设计引物,经PCR扩增,成功克隆到猪Jiv90基因,回收后与pEGFP-C1载体连接,构建重组表达载体pEGFP-C1-Jiv90,提取质粒并采用脂质体法转染猪脐静脉血管内皮细胞。转染24 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,经G418抗性筛选得到阳性克隆。本研究成功构建了pEGFP-C1-Jiv90真核表达载体,得到稳定表达Jiv90的细胞株,为今后开展分子伴侣对猪瘟病毒复制影响的研究奠定了基础。     

靶向O型口蹄疫病毒shRNA转基因猪体细胞抗病毒活性研究

为研究靶向O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因shRNA转基因猪体细胞的抗病毒活性,本实验在成功培育转基因克隆猪的基础上,通过分离与培养转基因猪体细胞,对其shRNA进行PCR和Southern blot检测,并将FMDV感染体细胞中,通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光试验(IFA)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析转基因猪体细胞抗FMDV活性。结果表明,转基因猪体细胞基因组DNA中携带有靶向FMDV VP1基因的shRNA基因片段。与非转基因猪体细胞相比,接种FMDV转基因猪体细胞其出现CPE的时间延迟,细胞内病毒含量显著降低,细胞感染病毒36 h时,对细胞中FMDV VP1基因抑制效率为53.6%。表明该靶向FMDV shRNA转基因克隆猪体细胞在体外具有良好的抗病毒活性。本研究为进一步在体内评价转基因动物的抗病毒活性奠定了基础。     

转录靶向猪瘟病毒3′-UTR shRNA细胞株干扰猪瘟病毒增殖的检测

对筛选的转录猪瘟病毒石门株3-′UTR shRNA的PK-15细胞株P-1（114-132位）、P-2（136-154位）和P-3（209-227位）分别接种猪瘟病毒（CSFV）,在接毒后第72和96小时用半定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测CSFVNS3基因及-βactin基因,以研究构建细胞株在转录水平上对CSFV增殖干扰的效果;接毒后第72、96和148小时以酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测细胞NS3蛋白表达量,通过OD490值分析构建细胞株在病毒蛋白表达水平上对CSFV增殖的影响。检测结果表明：（1）接毒后第72和96小时P-1、P-2和P-3细胞株中NS3基因的量明显减少,与接毒的空白PK-15细胞比较差异显著（P〈0.05）,说明P-1、P-2和P-3细胞株转录的shRNA能干扰CSFV RNA的转录;（2）接毒后第72和96小时P-1、P-2、P-3细胞株中NS3蛋白的表达量明显少于接毒的PK-15细胞（P〈0.05）,说明转录的shRNA在病毒蛋白水平上能干扰CSFVNS3基因的表达,但接毒后第148小时干扰效果有所降低。     

Myostatin基因沉默绵羊成纤维细胞系的建立

旨在获得肌肉生长抑制素( Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础.针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染成纤维细胞,采用RT-PCR进行筛选;构建慢病毒干扰载体,包装病毒,感染成纤维细胞,采用流式细胞技术分选阳性细胞,阳性细胞予以测序鉴定并检测沉默效果.结果,获得Myostatin基因沉默效率约90％的RNA干扰片段PSL1,包装病毒获得滴度为1×108的病毒颗粒,流式细胞技术分选得到纯度达99％的Myostatin基因沉默成纤维细胞系.采用慢病毒感染接合流式细胞术分选,能较快获得无抗性标记的转基因阳性细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊及探索Myostatin的调控机理奠定基础.     

转录靶向猪瘟病毒3''''-UTR shRNA细胞株的初步建立

利用质粒载体在细胞内转录并加工成siRNA的方法，设计3对针对猪瘟病毒3＇-UTR不同位点的干扰片段，分别与干扰载体pGenesil-1连接，转化DH5a，筛选阳性克隆得到重组干扰质粒pGene-1，pGene-2和pGene-3，脂质体介导转染重组干扰质粒于PK-15细胞，G418抗性筛选得到转录靶向猪瘟病毒3＇-UTRshRNA的PK-15细胞株，为今后应用RNAi研究猪瘟病毒Y-UTR调控病毒复制的功能以及抑制猪瘟病毒增殖的研究奠定了基础。     

山羊ATF6基因重组慢病毒干扰载体的构建及鉴定

为了研究ATF6通路介导的山羊胎盘滋养层细胞(goat trophoblast cell,GTC)凋亡的作用机制,需要构建激活转录因子6(ATF6)基因慢病毒干扰载体用于试验。采用RNA干扰技术,设计合成以山羊ATF6基因CDS区为靶点的shRNA,构建重组慢病毒载体、慢病毒包装、慢病毒转染、RT-qPCR和Western blot等方法,筛选出干扰效率达60%的shRNA干扰片段,构建出可用于今后ATF6通路相关研究的重组慢病病毒干扰载体,为山羊妊娠相关研究提供材料。     

METTL21C下调对小鼠成肌细胞分化的影响

为探究甲基转移酶样21C(methyltransferase like 21C,METTL21C)在小鼠成肌细胞分化过程中的功能,设计2组METTL21C的shRNA干扰序列,构建靶向METTL21C的干扰载体。用慢病毒法侵染小鼠C2C12细胞,筛选获得稳定干扰METTL21C的C2C12细胞株并检测干扰效率,经过20 mL/L马血清诱导细胞分化后用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测成肌分化相关基因表达。结果表明,成功构建两组靶向METTL21C的慢病毒干扰载体,实时荧光定量PCR及Western blot结果显示干扰组细胞中METTL21C表达水平均极显著降低(P0.01),shRNA1组干扰效率最高(73.6%)。干扰组细胞中成肌分化标志基因MyoG、MyoD、Myf5、MRF4表达水平均极显著降低,MEF2C表达水平下调更为明显(P0.01)。慢肌标志基因MYH7表达水平也极显著降低(P0.01)。说明METTL21C促进小鼠成肌细胞分化,其通过调控MEF2的表达影响MRFS家族基因从而影响成肌分化。     

猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定

为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。     

分子伴侣Jiv蛋白在瘟病毒感染中的作用

Jiv蛋白是近年来发现的一种与瘟病毒感染密切相关的细胞内分子伴侣。研究发现,分子伴侣Jiv蛋白上的一段编码90个氨基酸的序列(Jiv90)在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的NS2-3聚合蛋白切割中起着关键的作用,能促使NS2-3聚合蛋白切割成NS2和NS3单体蛋白。将Jiv90基因片段插入猪瘟病毒(CSFV)强毒株Alfort-p447中构建的嵌合病毒Alfort-Jiv感染细胞后,检测发现CSFV NS3蛋白的表达量明显升高。这些都提示,Jiv蛋白在瘟病毒感染细胞过程中发挥着重要的调节作用,但对其确切的作用机制还有待深入研究。本文就Jiv蛋白的发现、对BVDV和CSFV感染的调节作用及Jiv蛋白功能的深入研究进行了展望,以期为Jiv蛋白的功能研究及其在瘟病毒感染过程中的作用机制的研究提供基础资料。     

质粒载体表达抑制猪瘟病毒shRNA在猪胚胎成纤维细胞上的复制

以质粒pSilencer3.1Hygro为基础,构建了针对猪瘟病毒Npro基因和NS4A基因mRNA的siRNA双表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞后,在潮霉素B的筛选压力下,获得5株稳定整合shRNA表达盒的猪胚胎成纤维细胞克隆.以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72 h后对感染细胞克隆进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的5株细胞克隆中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖明显降低,表明所构建siRNA双表达载体转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制.本试验为研究猪瘟病毒的防治和通过RNAi建立猪的抗病育种提供了新的方法.     

猪瘟病毒感染细胞中分子伴侣Jiv基因的表达检测与分析

Jiv蛋白是与猪瘟病毒(CSFV)细胞内复制密切相关的伴侣分子,为探究Jiv在CSFV感染细胞内的表达规律,应用实时荧光定量RT-PCR分别对3个猪源细胞株(SUVEC、PK-15、ST)在感染CSFV后不同时间Jiv和CSFV基因表达进行检测,分析两者的相关性。结果显示,3种猪源细胞株的Jiv和CSFV的基因在0~72h的表达逐步上调,72h~96h出现下降,二者变化趋势基本一致;此外,Jiv基因在0~48h上调幅度较其他时间段更为显著,ST细胞在不同时间段的Jiv表达均高于同时段的其他两种细胞,与ST细胞中CSFV复制趋势一致。结果表明,在CSFV感染细胞中Jiv基因的表达与CSFV复制呈正相关,即CSFV复制水平越高,Jiv基因表达水平也越高。本研究初步探明细胞Jiv蛋白在CSFV复制中的调节作用,为进一步明确Jiv蛋白参与CSFV复制的机制提供了新的资料。     

shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JXA1-R株在Marc-145细胞中复制及抗PRRSV细胞株的建立

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是世界上主要的猪传染性疾病之一,目前,疫苗和抗病毒药物只能提供有限的保护。本研究选择猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）JXA1-R株ORF1a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7的保守区域为靶序列,利用pSilencer2.1-U6 neo构建shRNA表达载体并转染Marc-145细胞。经实时荧光定量PCR、细胞病变及病毒滴度分析,结果显示,ORF1a-4-shRNA、ORF3-1-shRNA、ORF6-2-shRNA干扰质粒能明显抑制病毒基因的转录,并有效抑制PRRSV在Marc-145上的增殖,显著降低病毒滴度。最后筛选ORF6-2-shRNA表达质粒转染猪胎儿成纤维细胞,构建稳定转染细胞株,为抗PRRSV转基因猪的生产奠定了基础。     

绵羊NYD-SP27基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiLox3.7(PLL3.7)中,得到4个shRNA干扰载体NYDSP27-shRNA及1条阴性对照载体NC-shRNA,同时将构建好的干扰载体及辅助质粒瞬时共转染至HEK-293FT细胞中,收集病毒液纯化后感染SP27-21细胞,48h后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NYD-SP27相对表达量,将干扰效果最好的载体用于进一步的研究中。结果表明,构建了重组慢病毒干扰载体,并成功包装成干扰慢病毒NYDSP27-shRNA-LV以及用来感染BHK-SP27-21细胞,48h后用实时定量PCR筛选出高效干扰绵羊NYD-SP27的片段NYDSP27-shRNA-1。为进一步研究NYD-SP27基因表达下调对绵羊精子发育的影响奠定了基础。     

小鼠ERO1α基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。     

慢病毒介导siRNA抑制O型口蹄疫病毒ON株病毒复制

探究RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对口蹄疫病毒复制的抑制作用,本研究选取O型口蹄疫病毒ON株,以ON株口蹄疫病毒3C、3D、VP1蛋白基因作为靶基因。对每一个靶基因设计并合成两对小片段发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)引物,分别命名为VP1-1、VP1-2、3C-1、3C-2、3D-1、3D-2,依据RNAi的原理构建6个shRNA的重组表达质粒,转染BHK21细胞后并接种ON口蹄疫病毒,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测筛选出能高效抑制ON口蹄疫病毒复制的重组质粒;将能够高效抑制ON口蹄疫病毒复制的重组质粒进行慢病毒的制备并筛选稳定的BHK21细胞系,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测慢病毒干扰载体对ON口蹄疫病毒复制的抑制作用。结果显示,构建的6个shRNA重组表达质粒抑制率均在71.5%~93.2%,其中PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效果最为明显,分别为93.2%和90.8%;慢病毒干扰载体PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效率在88.3%~95.49%。对研究结果表明,在细胞的水平上挑选出有效抑制ON口蹄疫病毒复制的基因干扰片段,并成功制备慢病毒干扰载体,为后续抗口蹄疫病毒的转基因羊生产培育奠定了实验基础。     

绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。     

猪MyD88基因干扰重组慢病毒载体的构建、病毒包装及效果评价

髓性分化因子88(MyD88)作为TLRs/IL-1R信号通路中重要的接头蛋白,在免疫应答和疾病防御中起重要作用,作者拟通过慢病毒介导的RNA干扰技术获得MyD88基因沉默的猪小肠上皮细胞,为致病菌引起肠道疾病机制研究提供有效模型。共构建4个靶向猪MyD88基因的shRNA表达载体和1个MyD88基因高表达载体,通过实时荧光定量PCR方法鉴定瞬时共转染293细胞中MyD88基因转录水平,筛选获得干扰猪MyD88基因效率最高的shRNA表达载体,将其包装成慢病毒载体,用于建立MyD88基因稳定沉默的猪小肠上皮细胞。最终成功获得MyD88基因沉默效率达到69.3%的小肠上皮细胞,达到基因功能分析的要求。MyD88基因稳定沉默猪肠上皮细胞的获得,为猪肠道病原微生物所引起的TLRs/IL-1R信号通路作用机制的研究提供了宝贵材料。     

表达抗流感病毒基因重组慢病毒滴度测定及感染效率分析

分别将靶向禽流感病毒(AIV)多靶点siRNA和鸡Mx基因克隆到p201慢病毒表达载体,采用鸡β-actin启动子替换p201慢病毒载体CMV启动子构建重组慢病毒载体p201-β-Mx-siRNA。并将其与辅助包装质粒共转染293T细胞,72h后收集细胞上清,实时荧光定量PCR测定重组慢病毒(rLV-MX-siR-NA)与对照组重组慢病毒(rLV-GFP)CT值,两者比较确定rLV-MX-siRNA滴度。rLV-Mx-siRNA以MOI=4感染猪胎儿成纤维细胞(PEF)并传代培养,提取后代细胞RNA检测外源基因转录以及应用间接免疫荧光试验检测鸡Mx蛋白的表达。结果表明,rLV-Mx-siRNA浓缩后滴度与已知滴度的rLV-GFP相等,为2×108 TU/mL,感染PEF效率>95%。感染rLV-Mx-siRNA的细胞传至第5代和第10代检测到外源基因转录以及鸡Mx蛋白的表达。表达鸡Mx基因和靶向AIV多靶点siRNA重组慢病毒滴度的测定与感染效率的分析,其结果为研究抗AIV转基因猪及其抗AIV的体外评价奠定了基础。     

表达miR-150shRNA细胞株的初步建立

为了探讨融合microRNA重组干扰载体构建的方法,为今后mi R-150对猪瘟病毒(CSFV)潜在的调控进行研究,利用生物信息学技术筛选出mi R-150,设计并合成了表达mi R-150的两条shRNA序列的DNA单链,将其退火后与干扰载体pGenesil-1连接,构建了含有mi R-150shRNA和绿色荧光蛋白基因的重组干扰质粒pGene-mi R-150shRNA,提取并纯化质粒后,采用脂质体法将重组质粒转染PK-15细胞,用G418抗性筛选。经过酶切鉴定和测序鉴定,表明成功构建了重组干扰质粒pGene-mi R-150shRNA,并在转染24 h后即可检测到绿色荧光。本研究成功得到稳定表达mi R-150的细胞株,所建的方法可以应用于各种microRNA的构建。     

慢病毒介导稳定表达抑制PRRSV复制的shRNA细胞系的建立

利用慢病毒表达技术将稳定持续抑制PRRSV复制的shRNA导入Marc-145细胞,建立稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA的Marc-145阳性细胞克隆,并从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因的干扰效果。采用LR重组技术,将pENTR/U6/Nsp9-4、pENTR/U6/Nsp9-6及pENTR/U6/-CON分别与pDEST载体进行LR重组,获得表达骨架,重组后的表达载体在转染试剂介导下与已经优化的辅助质粒Vira PowerTM Packaging Mix共转染293-FT包装细胞,获得慢病毒样粒子,并用其感染Marc-145细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过PCR、CPE、TCID50、Real-time PCR和间接免疫荧光试验等方法分别验证上述细胞株的稳定整合以及其表达的shRNA对PRRSV增殖的抑制效果。结果显示:优势干扰序列和无关序列被稳定整合在靶细胞基因组上,无论观察细胞病变效应、免疫荧光产生情况、致细胞半数感染量还是实时定量分析相对表达量,与正常Marc-145和整合有无关序列的两株阴性对照细胞相比,整合有NSP9-4和NSP9-6的两株细胞由于表达了靶向抑制PRRSV复制的shRNA,PRRSV对其易感性降低,而且差别显著,分别将其命名为Marc/pU6/NSP9-4和Marc/pU6/NSP9-6。经验证,本研究成功构建两株稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA细胞——Marc/pU6/NSP9-4、Marc/pU6/NSP9-6,同时获得一株表达无意义shRNA的Marc/pU6-CON辅助细胞,该细胞表达的shRNA具有明显抑制PRRSV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因,也为PRRSV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等研究提供资料。