MEF2C基因RNA干扰质粒的构建及干扰效率测定

为了构建猪MEF2C基因的RNA干扰重组质粒,并筛选出最佳干扰效率的序列,本试验采用RNAi技术,设计并合成了3条针对猪MEF2C基因的RNA干扰序列,构建了RNA干扰重组质粒(命名为siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),将其转染到小鼠C2C12细胞,并用实时定量PCR检测细胞中MEF2C基因mRNA的表达,Western blot测定细胞中MEF2C基因蛋白的表达。结果表明:重组质粒经PCR扩增后显示产物大小与预期一致,产物经双酶切及测序鉴定该序列与NCBI提供的序列一致。重组质粒转染C2C12细胞后,MEF2C基因mRNA表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(33.67±2.51)%、(21.00±3.60)%、(71.67±4.04)%。Western blot结果表明MEF2C基因蛋白表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(47.33±0.05)%、(38.25±0.16)%、(67.27±0.12)%。本试验成功构建猪MEF2C基因干扰重组质粒,最终确定干扰质粒(siRNA-3)具有最佳干扰效果,证实MEF2C基因的干扰质粒能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为探讨该基因与肌肉肉质性状的关系提供理论基础。     

干扰Mtmr3基因对C2C12细胞增殖与分化的影响

旨在探究肌管相关蛋白3(myotubularin related protein 3,Mtmr3)对C2C12细胞增殖与分化的调控作用及机制。本试验以小鼠成肌细胞系(C2C12)为试验材料，分别使用qRT-PCR和免疫荧光染色检测Mtmr3基因在成肌细胞生长期与分化期的mRNA表达水平和分化第6天时的分布形态。合成Mtmr3的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),试验分为siRNA NC对照组和Mtmr3 siRNA处理组(n=3),利用EdU、CCK-8、qRT-PCR、Western blot技术检测Mtmr3 siRNA对成肌细胞增殖与分化的影响，并通过信号通路研究调控成肌细胞增殖与分化的机制。结果显示，Mtmr3在生长期的mRNA水平表达量总体呈下降趋势，而在分化期的表达量呈逐渐上升趋势，Mtmr3免疫荧光染色呈肌管状。干扰Mtmr3后，细胞内Mtmr3基因的mRNA和蛋白表达水平均极显著地降低(P<0.01);在增殖试验中，转染细胞Mtmr3 siRNA后，极显著地增加了EdU阳性细胞占总细胞的比率和细胞活力(P<0.01);干扰...     

丝切蛋白CFL2基因低表达对小鼠成肌细胞C2C12肌纤维信号通路关键成分的影响

探讨低表达丝切蛋白CFL2基因对小鼠成肌细胞C2C12信号通路关键成分的影响。采用RNAi技术,将猪CFL2基因真核表达shRNA重组体稳定转染至小鼠成肌细胞C2C12后提取其总RNA和总蛋白质,采用Real-time PCR和Western blot检测CFL2基因低表达后成肌细胞C2C12信号通路关键成分(MEF2C、sk MLCK、Rho A、AMPKα2、p38和Ca M)的表达情况。结果表明:在3个稳转细胞株中MEF2C、Ca M、p38和AMPKα2的mRNA表达均为极显著下调(P0.01),sk MLCK的mRNA表达为极显著上调(P0.01),其它成分不显著;MEF2C和Ca M的蛋白表达在3个稳转细胞株中均为显著或极显著下调(P0.05或P0.01),其他4种成分(p38、Rho A、AMPKα2和sk MLCK)均差异不显著(P0.05),说明CFL2低表达显著下调信号通路关键成分MEF2C和Ca M的表达,CFL2与Ca M和sk MLCK分别呈显著正相关和负相关。     

敲低RACK1基因抑制C2C12细胞中MyoG和MHC基因表达

本实验旨在研究RNA干扰(RNAi)RACK1基因对C2C12成肌细胞中肌分化标志基因MHC和MyoG表达的影响。将人工合成的靶向RAKC1基因的3条si RNA(1,2,3)转染C2C12细胞,用RT-qPCR方法检测并筛选干扰效率最高的1条siRNA。将筛选出的si RNA转染C2C12成肌细胞并诱导细胞分化,通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光方法在mRNA及蛋白水平检测RACK1基因沉默后对MHC和MyoG表达的影响。此外,Western blot方法检测RACK1基因沉默后对PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活的影响。结果表明:RACK1-si RNA-2干扰效率最高,转染48 h后抑制率可达70%。随后,C2C12细胞转染si RNA-2,诱导分化48h后RTqPCR表明,MHC和MyoG的m RNA表达均显著性下调(P<0.05);诱导分化72 h后,Western blot和免疫荧光结果表明MHC和MyoG的蛋白表达明显低于对照组,但AKT和Erk磷酸化水平未见明显变化。上述结果表明,干扰RACK1能显著抑制MHC和MyoG的表达,提示RACK1正向调控C2C12成肌细胞的分化。     

RNF20及其介导的组蛋白H2B单泛素化对小鼠棕色脂肪细胞分化的影响

旨在研究RNF20及其介导的组蛋白H2B第120位赖氨酸的单泛素化(H2Bub)对小鼠棕色脂肪细胞成脂分化的影响。采集1日龄和2月龄雄性C57BL/6小鼠的棕色脂肪组织(n=3),用Western blot方法检测RNF20的表达及其介导的H2Bub水平。利用胶原酶消化法分离获得1日龄小鼠的棕色前体脂肪细胞。分别诱导棕色前体脂肪细胞和C3H10T1/2细胞系成脂分化,通过油红O染色检测其分化效果,进一步通过Western blot检测细胞分化前后(0和8 d)RNF20的表达及其介导的H2Bub水平。通过siRNA干扰Rnf20基因在C3H10T1/2细胞系中的表达,油红O染色方法观察Rnf20基因对成脂分化的影响,利用qPCR和Western blot技术检测Rnf20基因的干扰效率及其介导的H2Bub水平。结果显示,2月龄小鼠棕色脂肪组织中RNF20表达量及其介导的H2Bub水平均显著高于1日龄小鼠。脂肪细胞分化标记蛋白PPARγ和CEBPα的表达水平,RNF20表达量及其介导的H2Bub水平在棕色前体脂肪细胞及C3H10T1/2细胞成脂分化后均显著增加。此外,在C3H10T1/2细胞中敲降Rnf20基因后,与阴性对照组相比,RNF20及其介导的H2Bub水平显著降低,成脂分化后脂滴明显减少。综上表明,RNF20对小鼠棕色脂肪细胞的分化是必需的,敲降Rnf20基因导致组蛋白H2Bub水平显著降低,且降低了C3H10T1/2细胞的成脂分化效率。本研究丰富了小鼠棕色脂肪细胞分化过程中的表观遗传调控研究,为深入理解动物脂肪细胞分化提供了新的基因素材。     

关岭牛MEF2C基因克隆与差异表达性分析

旨在分析牛肌细胞增强因子MEF2C(myocyte enhancer factor 2C)基因的分子特征和在不同组织中的表达特性。以关岭牛为试验材料,扩增MEF2C基因CDS区,对MEF2C基因序列和蛋白结构进行分析,RT-qPCR检测MEF2C在不同组织中的表达特性。结果显示：牛MEF2C基因的CDS区全长为1 326 bp,编码441个氨基酸。MEF2C蛋白相对分子质量约为48 kDa,理论等电点为7.71,主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,含有1个MADS结构域,亚细胞定位显示MEF2C主要位于细胞核(60.90%)。牛MEF2C基因与牦牛同源性较近,与火鸡的同源性较远。RT-qPCR结果表明,MEF2C基因在关岭牛和杂交牛的7个组织中皆可表达,在肺脏和脾脏中差异极显著(P<0.01);心脏和肝脏以及背最长肌中差异显著(P<0.05);在成年牛的脾脏和心脏中表达量极显著高于犊牛(P<0.01);其他组织在犊牛阶段的表达量极显著高于成年牛阶段(P<0.01)。在成肌细胞分化过程中,MEF2C基因的表达量在0,12,24,48 h呈逐渐上升趋势,不同时间段的表达...     

猪MEF2C基因慢病毒表达载体构建及C2C12细胞转染条件的优化

MEF2C基因能够控制肌细胞分化过程中的基因转录,特别在骨骼肌、心肌和平滑肌中介导细胞的分化。本研究将猪 MEF2C 基因化学合成后经 Bam HI 和 Asc I 双酶切后克隆到慢病毒表达载体 pLen-ti6.3_MCS_IRES2-EGFP中,获得的重组质粒用限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;利用慢病毒阴性对照侵染靶细胞C2C12来确定最佳MOI值以及靶细胞最适抗生素Blasticidin剂量。结果显示猪MEF2C基因成功克隆到慢病毒表达载体中;该重组质粒侵染靶细胞C2C12的最佳MOI值为300;靶细胞抗生素的筛选剂量为4μg/mL,维持剂量为3μg/mL上述试验为建立MEF2C稳定过表达细胞系提供了前期工作基础。     

关岭牛MEF2A基因干扰载体构建及其转染对成肌细胞的影响

旨在构建肌细胞增强因子MEF2A(myocyte enhancer factor 2A)基因的重组干扰载体,探究MEF2A基因对牛成肌细胞的影响。本研究选择3头健康的3日龄雌性关岭牛,体重约为21 kg,采集背最长肌组织成功培养成肌细胞。设计MEF2A基因的4对shRNA干扰序列和1对NC阴性对照序列,将其连接至pGPU6-GFP-Neo载体上,转染重组载体至关岭牛成肌细胞。采用qRT-PCR法筛选干扰效率最佳的载体,并检测干扰MEF2A基因对肌生成因子MEF2B、MEF2C、MEF2D,周期与凋亡因子CDK2、CCNA2、BCL2 mRNA表达水平的影响;随后利用流式细胞仪与酶标仪探究干扰载体对成肌细胞增殖生长的影响,各试验组别设置3个生物学重复。同时运用在线软件预测牛MEF2A蛋白理化性质与网络谱图。结果显示,本研究成功筛选出干扰效率最佳的shRNA-MEF2A-3载体(P<0.01)。MEF2A基因被抑制后,成肌细胞中MEF2B、MEF2C与MEF2D基因表达量均极显著上调(P<0.01);CDK2与BCL2表达量皆显著下调(P<0.05),CCNA2表达量极显...     

RNF20及其介导的组蛋白H2B单泛素化对小鼠棕色脂肪细胞分化的影响

旨在研究RNF20及其介导的组蛋白H2B第120位赖氨酸的单泛素化（H2Bub）对小鼠棕色脂肪细胞成脂分化的影响。采集1日龄和2月龄雄性C57BL/6小鼠的棕色脂肪组织（n=3），用Western blot方法检测RNF20的表达及其介导的H2Bub水平。利用胶原酶消化法分离获得1日龄小鼠的棕色前体脂肪细胞。分别诱导棕色前体脂肪细胞和C3H10T1/2细胞系成脂分化，通过油红O染色检测其分化效果，进一步通过Western blot检测细胞分化前后（0和8 d）RNF20的表达及其介导的H2Bub水平。通过siRNA干扰Rnf20基因在C3H10T1/2细胞系中的表达，油红O染色方法观察Rnf20基因对成脂分化的影响，利用qPCR和Western blot技术检测Rnf20基因的干扰效率及其介导的H2Bub水平。结果显示，2月龄小鼠棕色脂肪组织中RNF20表达量及其介导的H2Bub水平均显著高于1日龄小鼠。脂肪细胞分化标记蛋白PPARγ和CEBPα的表达水平，RNF20表达量及其介导的H2Bub水平在棕色前体脂肪细胞及C3H10T1/2细胞成脂分化后均显著增加。此外，在C3H10T1/2细胞中敲降Rnf20基因后，与阴性对照组相比，RNF20及其介导的H2Bub水平显著降低，成脂分化后脂滴明显减少。综上表明，RNF20对小鼠棕色脂肪细胞的分化是必需的，敲降Rnf20基因导致组蛋白H2Bub水平显著降低，且降低了C3H10T1/2细胞的成脂分化效率。本研究丰富了小鼠棕色脂肪细胞分化过程中的表观遗传调控研究，为深入理解动物脂肪细胞分化提供了新的基因素材。     

AMPK调控绵羊肌内前体脂肪细胞分化的研究

旨在研究AMPK在羔羊肌内前体脂肪细胞分化中的作用及机制。本研究采集3日龄羔羊背最长肌,采用差速贴壁法分离肌束膜中原代细胞。改变AMPK与Wnt信号通路的活性并诱导细胞成脂分化,采用qRT-PCR和Western blot方法检测脂肪细胞分化关键基因及蛋白的表达,应用油红O染色观察成熟脂肪细胞的油滴情况。结果表明,AMPK激活明显减少了油红的着色,极显著抑制了PPARγ、C/EBPα和aP2成脂关键基因的mRNA表达及降低了对应的蛋白含量(P0.01),而抑制AMPK活性则表现出相反的结果。激活Wnt信号通路活性抑制了肌内前体脂肪细胞的分化,极显著降低PPARγ(P0.01)和C/EBPα(P0.01)mRNA表达,显著减少aP2的mRNA表达(P0.05),极显著降低了对应蛋白的含量(P0.01),而抑制Wnt信号通路活性则促进了细胞的成脂分化。AMPK的活性变化未影响β-catenin的转录,但极显著改变了β-catenin的蛋白表达水平(P0.01)。进一步研究表明,AMPK活化后极显著增加了GSK3β的磷酸化水平(P0.01),降低了其活性。结果显示,AMPK通过改变GSK3β的磷酸化水平影响胞内β-catenin稳定性,进而影响羔羊肌内前体脂肪细胞的成脂分化。     

猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定

为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。     

干扰Smad3促进山羊脂肪细胞分化

旨在克隆山羊Smad3的基础上,明确其组织和细胞表达谱,最终阐明干扰Smad3基因对山羊肌内和皮下脂肪细胞分化的影响。本研究选用5只体况良好的1周龄简州大耳羊,空腹24 h后屠宰并采集相应组织和细胞进行试验。利用RT-PCR技术克隆山羊Smad3基因cDNA区序列并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)技术检测Smad3基因的组织和细胞时序表达水平;并且合成靶向Smad3的siRNA,采用油红O染色从形态学上明确干扰Smad3对山羊前体脂肪细胞成脂分化的影响,利用qPCR检测干扰Smad3对脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、PPARγ、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15以及Smads相关基因Smad2、Smad4、Smad7和TGF-β1基因mRNA表达水平的影响,探讨可能的作用机制。结果,获得山羊Smad3基因1 449 bp,其中CDS区序列为1 278 bp,编码425个氨基酸;Smad3在山羊各组织中具有广泛表达特性,且在肾脏中的表达水平最高(P0.01);Smad3均在山羊肌内和皮下两种脂肪细胞诱导分化的36 h表达量最低,极显著低于在未分化前体脂肪细胞中的表达丰度(P0.01);干扰Smad3后发现显著促进了山羊肌内和皮下脂肪细胞中脂滴的聚集,且脂肪细胞分化标志基因、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15的表达水平显著上升(P0.05),Pref-1的相对表达水平极显著下降(P0.01),同时干扰Smad3基因下调了Smad2、Smad4和Smad7基因的相对表达水平(P0.05)。研究结果指出,干扰Smad3促进山羊脂肪细胞分化,且可能通过调控脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15等及协同Smad2、Smad4和Smad7的表达来实现的。     

干扰HNRNPAB对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的作用研究

为了研究核不均一核糖核蛋白AB （heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AB,HNRNPAB）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响。本研究以体外分离培养的鲁西黄牛胎牛原代骨骼肌卫星细胞为试验材料,体外诱导成肌分化,分别收取分化前和分化后第1、2、3天的细胞,提取RNA （每组设置4个重复）或蛋白质（每组设置3个重复）,通过qRT-PCR、Western blot检测HNRNPAB在成肌分化前后的表达情况。随后合成HNRNPAB的干扰RNA,并转染牛骨骼肌卫星细胞干扰HNRNPAB的表达,设置阴性对照组;在试验组和对照组中,分别利用EdU试验检测细胞增殖情况,qRT-PCR技术、Western blot技术检测HNRNPAB、增殖标志因子Pax7、Cyclin D1及分化标志因子MyoG、MyHC的mRNA表达水平及蛋白表达水平。结果显示,HNRNPAB在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中的mRNA表达呈现先升后降的趋势,在分化第1天表达量最高,分化前后蛋白表达水平也具有显著差异。干扰HNRNPAB后,EdU细胞阳性率极显著上升（P<0.01）,增殖标志因子Pax7、Cyclin D1的mRNA水平与对照组相比极显著下降（P<0.01）,Pax7蛋白表达水平极显著上升（P<0.01）;与对照组相比,分化标志因子MyoG、MyHC的mRNA表达水平极显著升高（P<0.01）,蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。本研究结果表明,干扰HNRNPAB后降低了牛骨骼肌卫星细胞增殖标志因子的转录水平,提高了Pax7的蛋白表达水平,并促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。     

FDFT1基因shRNA和过表达载体的构建及在牛胎儿成纤维细胞中的验证

构建了带有绿色荧光标记的法尼基二磷酸法尼基转移酶1(farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1,FDFT1)基因shRNA干扰载体以及过表达载体,将其转染牛胎儿成纤维细胞(bovine fetal fibroblasts,BFF),采用荧光定量PCR和Western blot的方法,检测FDFT1基因mRNA和蛋白的表达水平,在细胞水平验证了shRNA干扰载体的干扰效率和过表达载体的有效性。结果显示:shRNA组FDFT1-Bos-520的FDFT1基因mRNA表达水平降低至shRNA NC组的40.7%(P0.01),蛋白质表达水平降低至shRNA NC组的39.61%(P0.01);而FDFT1基因pBI-CMV3-FDFT1过表达组FDFT1基因mRNA的表达水平为pBI-CMV3空载体组的137.9倍(P0.01),蛋白表达水平升高至空载体组的2.34倍(P0.01)。本试验通过荧光定量PCR和Western blot的检测方法验证了FDFT1基因过表达载体及干扰载体转染BFF后,FDFT1基因表达量的变化,为进一步研究FDFT1基因对胆固醇代谢和脂质代谢的影响和作用机制提供了实验材料及分子依据。     

过表达MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

旨在探究肌球蛋白结合蛋白C1（myosin binding protein C1,MyBPC1）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究MyBPC1在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。本研究利用西门塔尔胎牛原代牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型模拟牛骨骼肌的生长发育过程。采用qRT-PCR和Western blot检测MyBPC1的细胞时序表达谱。试验分为两组。在RNA水平每组4个重复,每个重复20 μL;在蛋白水平每组3个重复,每个重复15 μg。采用qRT-PCR和Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞转染MyBPC1的过表达效果,并进一步检测细胞增殖期标志因子Pax7、Ki67以及细胞分化期标志因子MyHC、MyOG的表达变化情况,观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态。结果,MyBPC1在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在极显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后MyBPC1的mRNA和蛋白表达量均极显著高于增殖期（P<0.01）。过表达MyBPC1后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,增殖标志因子Pax7的mRNA水平和蛋白表达水平无显著差异,分化标志因子MyHC的mRNA水平和蛋白表达水平极显著高于对照组（P<0.01）。过表达MyBPC1可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化,为进一步开展MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞的调控机制奠定基础。     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素(MSTN)对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖(DCN)为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2(si-DCN)转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期(GM)牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天(DM3)的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),且EdU阳性细胞率显著增加(P<0.05),表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组(P<0.01;P<0.05),MyHC在mRNA水平显著降低(P<0.05),但在蛋白水平上极显著升高(P<0.01),免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组(P<0.05),说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

MiR-106a-5p靶向E2F3和SP-1抑制C2C12细胞成肌分化的研究

为探究miR-106a-5p对成肌分化的作用及潜在调控靶点,在线预测miR-106a-5p潜在靶基因,通过RT-qPCR及Western blot检测miR-106a-5p对靶基因的调控作用,利用双荧光素酶报告系统验证miR-106a-5p与靶基因之间的互作,并以C2C12细胞系为实验模型,采用过表达技术,在细胞形态学水平初步探索其对成肌分化的作用。在线预测发现E2F3和SP-1可能是miR-106a-5p的潜在靶基因;RT-qPCR分析表明,miR-106a-5p与E2F3和SP-1的表达模式相反;Western blots结果发现,miR-106a-5p抑制E2F3和SP-1蛋白翻译;双荧光素酶报告载体系统表明,E2F3和SP-1是miR-106a-5p调控成肌分化的靶基因;此外,超表达miR-106a-5p抑制C2C12细胞分化,肌管数目显著减少。结果表明,E2F3和SP-1是miR-106a-5p抑制C2C12细胞成肌分化的靶基因。     

Hlcs干扰对C2C12细胞成肌成脂分化后糖酵解基因表达的影响

旨在研究全羧化酶合成酶（holocarboxylase synthetase,Hlcs）对糖酵解基因表达的影响,为进一步研究细胞糖酵解奠定基础。本试验以C2C12细胞为试验材料,采用siRNA技术干扰Hlcs基因,通过荧光定量PCR和Western blotting检测Hlcs基因干扰对糖酵解基因表达的影响。结果表明,在C2C12细胞分化过程中,Hlcs基因与Pfkm、Pkm、Hk-2基因的表达趋势一致,提示Hlcs基因与糖酵解具有相关性。干扰Hlcs后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,糖酵解限速酶Pfkm的mRNA水平显著降低（P<0.05）,而显著提高了Pkm的mRNA水平和蛋白表达水平（P<0.05）;生物素作为羧化酶的辅酶,能够显著上调Pkm、Hk-2的mRNA水平（P<0.05）。干扰Hlcs后,细胞分化形成的脂滴数量明显少于对照组,Pfkm的mRNA水平显著升高（P<0.05）,且Pkm的mRNA水平和蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;生物素的添加能够显著上调Pfkm、Pkm的mRNA水平（P<0.05）。综上所述,在C2C12细胞分化过程中,Hlcs基因与糖酵解基因表达趋势一致,且干扰Hlcs基因可以抑制成肌分化C2C12细胞中Pfkm和Hk-2基因的表达,促进Pkm的表达;而促进成脂分化C2C12细胞中Pfkm和Pkm的表达,抑制Hk-2基因的表达。     

miR-143在肌细胞中的表达及其影响

本试验旨在研究microRNA-143(miR-143)对小鼠肌细胞增殖和分化的影响。利用Real-time PCR方法对细胞不同分化时期进行检测,并且在小鼠肌细胞C2C12中通过转染miR-143 mimics和Inhibitor对标志基因myogenin(MyoG)进行检测,然后利用免疫荧光和Western blotting方法对组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因表达水平进行检测。结果表明,miR-143与肌细胞的增殖和分化密切相关,过表达miR-143后,肌细胞标志基因MyoG出现下调,敲低后结果相反,且在分化细胞中过表达miR-143,免疫荧光和Western blotting结果显示,标志基因MHC的表达水平下降。因此,miR-143是一个潜在的影响肌肉生长发育的microRNA,为以后肌肉发育和功能的研究提供了一个新的资料。     

白绒山羊PPARγ基因RNA干扰慢病毒载体的构建及对肌内脂肪细胞增殖分化的影响

本研究以绒山羊肌内脂肪细胞为试验材料,通过靶向阻断过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ基因,建立稳定干扰的肌内脂肪细胞株,探讨绒山羊PPARγ基因在肌内脂肪细胞增殖和分化过程中的功能。采用慢病毒质粒包装系统构建特异靶向白绒山羊PPARγ基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,用以建立PPARγ基因稳定沉默的肌内脂肪细胞株。利用实时定量和Western blot方法检测PPARγ基因在干扰组和对照组不同时间点的表达情况,并通过MTT和油红O染色法研究绒山羊PPARγ基因对肌内脂肪细胞增殖和分化的影响。经测序证实合成的含PPARγ-shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确,对肌内脂肪细胞的感染效率为80%以上,荧光定量和Western blot检测慢病毒介导的shRNA可以有效降低PPARγ的表达,其mRNA和蛋白水平作用的时间相隔24h。沉默PPARγ基因后,脂肪细胞内甘油三脂的浓度明显低于对照组,相反MTT检测干扰组中细胞增殖能力高于对照组。本研究构建了绒山羊shRNA-PPARγ慢病毒干扰载体,成功转染至肌内脂肪细胞后可明显抑制脂肪细胞的分化,而促进肌内脂肪细胞的增殖,为进一步研究PPARγ基因在绒山羊脂肪细胞代谢通路中的作用及脂肪沉积机制奠定基础。