超声波直接转导外源基因转化八棱海棠的技术研究

应用超声波直接转导法,对八棱海棠进行rolC基因转化,同时,利用gus基因瞬间表达的方法研究了超声波处理时间、处理功率和转化缓冲液中二甲基亚砜(DMSO)对rolC基因转化率的影响.结果表明:当DMSO为5%(体积分数)时,用80 W功率处理20 min,能够获得最佳的转化效果.在超声波最佳处理条件下转化486个八棱海棠叶片,共得到237个抗性愈伤组织和9株抗性苗,转化率为1.85%.GUS染色、PCR及Southern blotting检测结果显示,有8个八棱海棠株系的基因组中整合了完整的外源rolC基因.     

转rolC基因八棱海棠组培苗生物学特性的研究

【目的】通过研究转rolC基因八棱海棠不同株系的转基因拷贝数，在转录水平上的表达丰度，以及转基因组培苗的生物学特性，为进一步深入阐明rolC基因在八棱海棠中的表达机制和培育优良的苹果砧木奠定理论基础。【方法】以通过gus染色和PCR检测的3个转rolC基因八棱海棠株系组培苗为试材。Southern杂交鉴定rolC基因整合拷贝数。Northern杂交鉴定rolC基因在转录水平上的表达丰度。调查转基因植株组培苗在含有不同种类和浓度的植物生长调节剂的培养基上茎段增殖、叶片再生、生根能力等生物学特性；将生根后的组培苗进行炼苗，移入温室4个月后，研究株高、节间数、节间长度、叶面积等生物学特性。【结果】Southern杂交结果表明，rolC基因分别整合进入3个八棱海棠株系基因组，其中株系20a和33a分别获得了1个rolC基因拷贝，株系20b获得了2个rolC基因拷贝。Northern杂交结果表明，3个转基因株系中的rolC基因均在转录水平上得到了表达，且该基因在单拷贝株系的表达丰度高于双拷贝株系。转基因组培苗生物学特性研究结果表明：（1）3个转rolC基因八棱海棠株系茎段增殖系数、叶片再生率、生根所需外源激素浓度均显著低于对照植株，单拷贝株系的以上指标亦显著低于双拷贝株系。（2）3个转基因八棱海棠株系组培苗平均生根数显著高于转基因株系，双拷贝株系显著低于单拷贝株系；根长情况正好相反；对照植株根粗和转基因株系根粗之间均无显著差异。（3）3个转基因八棱海棠株系的株高、节间长度、节间数、叶面积均显著小于对照植株。其中单拷贝株系显著小于双拷贝株系。【结论】rolC基因整合进入3个八棱海棠转基因株系基因组，并分别在转录水平上得到表达。外源rolC基因的表达导致转基因植株体内内源激素含量和植株形态学的改变，且rolC基因的整合拷贝数对它的表达有一定的影响。     

超声波辅助农杆菌转化OT百合‘罗宾娜’的研究

【目的】通过超声波处理辅助农杆菌转化OT百合小鳞片,提高农杆菌介导法转化百合的效率。【方法】以OT百合‘罗宾娜’(Lilium tenuifoliumoriental×tumpet‘Robina’)的再生小鳞片为外植体,分别以80W功率的超声波处理1,2,3,4,5min,通过超声波处理辅助根癌农杆菌进行外源基因的转化,同时以未进行超声波处理为对照;利用GUS组织化学法,分别检测转化脱菌后筛选培养7d的外植体和筛选培养60d后形成的潮霉素抗性再生植株叶片、小鳞片、根系的GUS瞬时表达和稳定表达,提取潮霉素抗性植株基因组DNA进行GUS和HPT基因的PCR扩增分析。【结果】超声波处理的农杆菌介导转化的百合外植体经GUS组织化学染色,多数可见蓝色斑点,且以3min超声波处理的蓝色最深;3min超声波处理的外植体对潮霉素的抗性率最高达48.85%,未经超声波处理的仅为15.56%,二者差异达显著水平。从53个潮霉素抗性再生植株的DNA样品中扩增得到了GUS基因和HPT基因的扩增片段,其中超声波处理3min的PCR阳性植株转化率最高,为28.30%,而未进行超声波处理的PCR阳性植株转化率仅为5.66%,初步证明外源基因可能整合到百合基因组中。【结论】20℃条件下80W功率超声波处理3min,可以有效提高农杆菌介导法转化OT百合的效率。     

八棱海棠耐盐碱性评价

为探明八棱海棠的耐盐碱性种质资源价值,以实生苗为试材,采用水培的方法评价了八棱海棠耐盐性和耐碱性.结果表明:1)0.4％ NaCI处理30 d时,八棱海棠的盐害指数为51.1,根据耐盐性评价标准判定为中等耐盐型树种;其实生个体间存在广泛的抗性分离现象,极强、强、中、弱和极弱耐盐型植株分别占群体总数的20.6％、23.9％、37.0％、12.0％和6.5％.2)pH9.5碱处理(Na2CO3)30 d时,八棱海棠的碱害指数为16.3,根据耐碱性评价标准判定为极强耐碱型树种;其实生个体间存在广泛的抗性分离现象,极强、强、中、弱和极弱耐碱型植株分别占群体总数的79.1％、15.3％、4.2％、1.4％和0％.八棱海棠中存在极强耐盐型和极强耐碱型植株,是优异的耐盐/碱型种质资源树种.     

NaCl胁迫对八棱海棠和山定子电导率和抗氧化酶活性的影响

[目的]研究不同浓度NaCl处理对八棱海棠和山定子电导率和抗氧化酶活性的影响.[方法]试验以盆栽的八棱海棠和山定子为试验材料,检测不同NaCl处理后的电导率、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性.[结果]随着NaCl浓度的增加,八棱海棠和山定子的相对电导率均表现出逐渐升高的趋势;八棱海棠的SOD活性先上升后下降,山定子的SOD活性逐渐下降;八棱海棠的POD活性表现出先下降后上升的趋势,山定子POD的变化不明显;山定子的CAT表现出先上升后下降的趋势,而八棱海棠CAT的变化不明显;0.5; NaCl处理第14 d,山定子的叶片全部干枯.[结论]八棱海棠对NaCl的耐受性比山定子强,八棱海棠对NaCl胁迫的适应SOD和POD起主要作用,山定子对NaCl胁迫的适应CAT起主要作用.     

rolC基因对转Ri质粒三倍体毛白杨的遗传转化

通过对Ri质粒转化三倍体毛白杨植株转入rolC基因,使外源基因rolC在植物体内形成多拷贝,从而对rolC基因表达产生干扰,而减少Ri质粒转化三倍体毛白杨造成的不良形态变异.本研究建立了转Ri质粒三倍体毛白杨的叶片再生体系,筛选出叶片再生的最佳培养基为:MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1;确定了卡那霉素(Km)和抑菌抗生素头孢噻肟钠(CTX)的临界浓度为30 mg·L-1和400 mg·L-1;采用农杆菌介导的叶盘法,将rolC基因转入经发根农杆菌Ri质粒30148转化的三倍体毛白杨植株中,获得了18个Km抗性系,对其中14个株系进行了PCR检测,表明rolC基因已整合进再生植株中.与转Ri质粒三倍体毛白杨和未转基因三倍体毛白杨相比,部分转Ri质粒三倍体毛白杨在转rolC基因后发生了形态特征变异,比如部分无性系的叶片由原来的皱缩变为平展,部分无性系的茎由原来的直立变为弯曲,侧枝增多,节间距明显缩短.     

钼对八棱海棠幼苗吸收和利用硝态氮的影响

运用同位素示踪技术,以苹果砧木八棱海棠幼苗为试验材料,研究钼对八棱海棠幼苗吸收和利用硝态氮的影响以及钼对幼苗生长状况的影响。结果表明:供钼处理的八棱海棠幼苗的根系活力高于对照。培养4 d时,八棱海棠幼苗两种处理的叶片NR活性上升至最高值,然后下降。培养8 d内供钼处理根系硝酸还原酶活性一直高于对照,且与对照差异显著。供钼处理提高了八棱海棠幼苗生物量和叶绿素含量。钼明显影响幼苗的15N利用率和分配率,供钼处理15N利用率为14.97%,比对照提高63.06%;供钼处理幼苗茎和叶片15N分配率为18.40%和24.34%,分别为对照的1.32倍和1.16倍。     

PEG模拟干旱胁迫对4种海棠幼苗生理特性的影响

对八棱海棠、西府海棠、珠美海棠、红果海棠幼苗进行PEG模拟干旱胁迫,以了解其耐旱性差异。结果表明:轻度干旱(5%浓度的PEG)胁迫下,4种海棠表现基本正常,中、重度干旱(15%、25%浓度的PEG)胁迫下,八棱海棠受害程度最轻,红果海棠最重;随干旱胁迫程度增加,参试植物呈现出根系活力下降、MDA含量和色素含量上升、可溶性糖含量和过氧化物酶(POD)活性先升后降、超氧化物歧化酶(SOD)活性先降后升的趋势;八棱海棠的隶属函数平均值最大,红果海棠的最小。综合分析认为,4种海棠幼苗的耐旱性强弱依次为八棱海棠、珠美海棠、西府海棠、红果海棠。     

IBA提高自然微型嫁接成活率效应的研究

为建立苹果无病毒苗快速繁育体系,以沁源山定子(MalusbaccataBorkh.)、八棱海棠(Malusmicroma lusMak.)营养钵苗和八棱海棠大田直播苗为砧木,脱毒丽红苹果(MaluspumilaMilll.cv.lihong)组织培养芽丛为接穗,采用自然茎尖嫁接法,研究IBA对自然微型嫁接成活率的影响。结果表明,IBA处理可明显提高嫁接成活率。IBA最佳浓度为1 5mg/kg,最高嫁接成活率达81 3%。不同砧木、不同砧苗培养方式,嫁接成活率有差异,以大田直播八棱海棠砧苗效果最好。     

干旱胁迫对海棠幼苗生长及生理特性的影响

采用盆栽试验法研究轻度、中度、重度干旱胁迫(土壤相对含水量分别为50%、35%、20%)对5种海棠幼苗生长及生理特性的影响,以期为园林绿化和苹果砧木的筛选提供优良的海棠品种。结果表明:随干旱胁迫程度加重,各海棠幼苗新梢相对生长量和根系活力均呈现下降趋势,在重度干旱胁迫下八棱海棠仍能维持高达79.649%的相对生长量,而红果海棠仅为34.820%;重度干旱胁迫下的八棱海棠根系活力降幅最小,为35.71%;重度干旱胁迫下,除八棱海棠外,其他品种丙二醛(MDA)含量均极显著高于对照(土壤相对含水量60%~80%),红果海棠最高,为对照的3.077倍;重度干旱胁迫下,珠美海棠超氧化物歧化酶(SOD)活性上升最快,为对照的1.119倍。综合各项指标和隶属函数分析结果,5种海棠幼苗耐旱性强弱依次为八棱海棠西府海棠平顶海棠珠美海棠红果海棠。     

苹果矮化中间砧SH40激素含量及生长素转运蛋白基因pin1表达

为探讨SH40作为苹果中间砧时激素含量及生长素转运蛋白基因pin1表达量变化与矮化的可能存在的关系,为今后致矮机理研究打下基础。在控制条件下,以矮化中间砧砧穗组合富士/SH40/八棱海棠、乔化自根砧砧穗组合富士/八棱海棠以及乔化苗八棱海棠和矮化苗SH40为试材,采用HPLC法测定分析了材料茎皮中生长素(IAA)和脱落酸(ABA)含量的变化,采用qRT-PCR研究了pin1基因表达量的变化。结果表明:无论砧木苗本身,还是嫁接品种后,SH40茎皮中ABA/IAA比值显著高于乔化砧木八棱海棠;SH40做中间砧时,其茎皮中IAA含量显著减少,可能与其中IAA转运蛋白pin1基因表达量显著降低有关。     

不同砧木绿宝苹果幼树对盐碱土的适应性

以八棱海棠(Malus robusta)、平顶海棠(M.prunifolia)、西府海棠(M.micromalus)、圆叶海棠(M.prunifolia var.ringo)、珠美海棠(M.zumi)为砧木嫁接绿宝苹果,研究不同砧木的嫁接苗对天津滨海地区盐碱土的适应性。对植株的生长、光合作用及生理指标进行了测定分析,结果表明,以八棱海棠、平顶海棠为砧木的绿宝苹果幼树,其新梢长度、叶面积、根可溶性糖含量均显著或极显著高于其他3种砧木,而丙二醛(MDA)含量及过氧化物酶(POD)活性均低于其他3种砧木;八棱海棠为砧木时,绿宝苹果幼树的净光合速率及叶绿素含量最高,圆叶海棠、平顶海棠、珠美海棠为砧木时相对较低;以八棱海棠为砧木时绿宝苹果幼树的隶属函数平均值最大,珠美海棠为砧木时最小。综合各项测定指标及幼树的形态表现,初步认为,5种不同砧木的绿宝苹果幼树在中度盐碱土壤上能正常生长,其适应性由强到弱的嫁接砧木依次为八棱海棠、平顶海棠、西府海棠、圆叶海棠、珠美海棠。     

重庆地区北美海棠砧木的筛选

以山荆子(Malus baccata)、八棱海棠(M.nicromaalu Makino)和小金海棠(M.xiaojinensis)作为北美海棠(M.micromalus cv."American")嫁接砧木,通过比较一年生播种苗的形态指标、根系指标、生长量、发芽率等指标,筛选适合在重庆地区推广的砧木。结果表明,在重庆地区规模化繁育北美海棠时,宜选择八棱海棠作为砧木。小金海棠的生长速度最快,地径(0.835 cm)、苗高(105.93 cm)、鲜重(15.813 g/株)和干重(10.920 g/株)等指标显著或极显著高于山荆子和八棱海棠,但其播种发芽率只有24.4%,极大限制了其推广。     

不同激素和浓度对八棱海棠扦插成活率的影响研究

本研究以八棱海棠为试验材料,研究了不同激素浓度配比对八棱海棠扦插成活率及根系生长情况的影响,旨在筛选最适激素种类及相应浓度,以提高八棱海棠繁殖系数,更好地满足八棱海棠规模化生产的需求。结果表明:200mg/kgIBA处理的八棱海棠成活率最高,且最能促进其根系生长。     

盐胁迫对八棱海棠和新疆野苹果叶片解剖结构的影响

[目的]比较八棱海棠和新疆野苹果在不同盐浓度下叶片组织解剖结构的变化,分析其耐盐性,为我区南疆盐渍化土壤条件下苹果的商业化提供砧木资源.[方法]试验以盆栽的八棱海棠和新疆野苹果为试验材料,用8g/L的NaCl溶液进行盐胁迫处理,以只浇灌Hoagland完全营养液作为对照(CK),在处理第20天取样,采用石蜡制片法制作切片,测量出八棱海棠和新疆野苹果的叶片、上表皮、下表皮、栅栏组织和海绵组织指标,观察分析八棱海棠和新疆野苹果叶片的解剖结构.[结果]光镜显微结构表明,与对照相比,在盐胁迫环境下,八棱海棠和新疆野苹果的叶片厚度、上下表皮、海绵组织发生不同程度的加厚,而栅栏组织厚度减小.与新疆野苹果相比,8 g/L NaCl处理的八棱海棠叶片细胞结构损伤较小,能够较好地保持细胞结构的完整性.[结论]八棱海棠对盐胁迫的适应能力高于新疆野苹果,对盐胁迫表现出较强的适应性.     

不同苹果矮化中间砧组合适宜栽植密度试验

[目的]确定不同苹果矮化中间砧组合宽行密植栽培模式的合理栽植密度.[方法]选用2010年的定植天红2号/SH40/八棱海棠、烟富3/M9/八棱海棠、烟富3/M26/八棱海棠为试材,进行不同栽植密度试验,调查分析树体发育情况、枝类组成、果实品质、产量.其中,栽培密度：天红2号/SH40/八棱海棠0.75 m×4.00m、1.50m×4.00m、1.00m×4.00m、1.25 m ×4.00m;烟富3/M9/八棱海棠1.25m×4.00m、1.00m×4.00m、0.75 m×4.00m;烟富3/M26/八棱海棠1.50m×4.00m、1.25 m ×4.00 m、1.00 m ×4.00 m、0.75 m ×4.00m.[结果]3种砧穗组合所有处理树高均小于行距,行间均无交接现象,果胎枝所占比例0.75 m×4.00m和1.00m×4.00m处理较高.天红2号/SH40/八棱海棠以栽植密度0.75 m ×4.00 m处理产量最高,1.00m×4.00m处理果实硬度最高,1.25m×4.00m处理干截面积产量最低;烟富3/M9/八棱海棠以栽植密度0.75 m×4.00 m处理产量最高,并且果实品质优于其他处理;烟富3/M26/八棱海棠以1.25 m ×4.00 m处理干截面积产量较高,0.75 m×4.00m处理产量最高,并且果实品质优于1.25m×4.00m和1.50 m ×4.00 m处理.另外,0.75 m×4.00m栽植密度下,烟富3/M9/八棱海棠产量最高,烟富3/M26/八棱海棠次之,红2号/SH40/八棱海棠最低.[结论]烟富3/M26/八棱海棠和烟富3/M9/八棱海棠进行宽行密植栽培株行距选择0.75 m×4.00m为宜,天红2号/SH40/八棱海棠应选择0.75m ×4.00 m或1.00 m ×4.00 m.     

电导法协同Logistic方程进行6种苹果砧木抗寒性的比较

对八棱海棠、平顶海棠、圆叶海棠、西府海棠、珠美海棠和红果海棠进行低温(-3~-40℃)处理以比较其抗寒性,用电导法测定各低温处理后的电导率,计算电解质外渗率及外渗率与温度间的回归系数,并采用Logistic方程计算各植物的临界致死低温,同时对各植物低温处理后枝条横断面进行观察。结果表明,随着温度的降低,参试植物电解质外渗率均逐渐增加,其中红果海棠的电解质外渗率增加的幅度最大,其回归系数达-7.78;其次是西府海棠,为-6.67;而八棱海棠最小,为-2.86。根据各低温处理后横断面的表现可以看出,八棱海棠的受害程度最轻,红果海棠的受害程度最重。各植物的临界致死温度分别为:红果海棠-23.2℃、西府海棠-27.3℃、珠美海棠-33.5℃、圆叶海棠-35.5℃、平顶海棠-44.6℃、八棱海棠-48.5℃。综合各观测指标发现,6种苹果砧木的抗寒性强弱依次为八棱海棠平顶海棠圆叶海棠珠美海棠西府海棠红果海棠。     

超声波辅助农杆菌介导的长春花（Catharanthus roseus）遗传转化

研究以根癌农杆菌介导结合超声波处理和乙酰丁香酮诱导,通过对GUS基因瞬时表达来研究影响长春花转化效率的因素.对转化方法包括超声波处理的功率和时间、乙酰丁香酮(3,5-methoxy-4-hydroxyacetophenone,AS)的浓度、共培养时间进行了系统优化.结果表明:在添加AS 100 p,mol·L-1的1/2 MS培养液中,超声波处理功率80 W,处理时间10 rain,共培养2 d,根癌农杆菌介导的长春花下胚轴遗传转化能获得最佳的GUS基因瞬间表达率.本研究为进一步开展根癌农杆菌介导稳定转化长春花奠定了基础.     

外源基因对八棱海棠株系组培苗生根的影响

以南京农业大学生物技术实验室获得的两个转番茄铁载体蛋白基因八棱海棠株系B4、B5组培苗的茎段为试材,以非转基因八棱海棠为对照,研究转基因对生根情况的影响.结果表明:在相同IBA或者IAA浓度下,转基因八棱海棠生根率明显低于对照植株;而从根长来看,在IBA的条件下,转基因株系明显低于对照,而在IAA的条件下则不明显;在IAA条件下平均根数也少于对照.     

苹果砧木叶片结构对水分胁迫的响应（英文）

[目的]测定丽江山荆子和八棱海棠2份材料在干旱和复水情况下叶片结构的特征指标。[方法]以丽江山荆子(Malus rockii Rehd.)和八棱海棠(Malus robusta(Carr.)Rehd.)为试验材料,利用大棚自然控水-复水进行模拟水分胁迫处理。[结果]丽江山荆子叶片有2层栅栏组织,而八棱海棠叶片栅栏组织由3层柱状细胞构成,且排列紧密。八棱海棠叶片较丽江山荆子厚,栅海比高,气孔密度大,而丽江山荆子叶片气孔对于水分变化较八棱海棠敏感,干旱复水后气孔面积增加幅度是八棱海棠的10倍。干旱复水后,2份材料叶片的SR值提高,栅海比下降,八棱海棠2个指标的变化幅度均大于丽江山荆子。[结论]2份材料叶片在干旱-复水水分胁迫的响应不同,八棱海棠叶片抗旱结构特征较丽江山荆子明显。