烟草中依赖于NAD+的山梨醇脱氢酶基因的克隆及序列分析

以珊西烟(Nicotiana tabacum L.cv Xanthi NN)为材料,通过RT-PCR,首次克隆了烟草中山梨醇脱氢酶基因(NAD+-SDH),该基因全长1119bp,编码372个氨基酸残基,其氨基酸序列与番茄和葡萄的山梨醇脱氢酶同源性分别为92%和87%。     

烟草PGIP基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据Gen Bank数据库报道的林烟草(Nicotiana sylvestris)PGIP基因c DNA序列,设计特异性引物,从普通烟草(Nicotiana tabacum)种植品种小黄金中分离得到了其g DNA序列,分析结果发现烟草PGIP基因没有内含子序列。信号肽分析结果表明,烟草PGIP基因含有一段长28个氨基酸的信号肽。将去除信号肽的烟草PGIP基因片段亚克隆至枯草芽孢杆菌表达载体p HT43中,转化枯草芽孢杆菌菌株WB600并进行IPTG诱导。SDS-PAGE电泳表明,重组菌株可成功表达目的蛋白质,分子质量符合预期大小;琼脂扩散试验结果发现,表达的烟草PGIP蛋白质能够明显抑制辣椒疫霉PGs的活性。     

烟草多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

多酚氧化酶(PPO)在高等植物中广泛存在,其利用分子氧催化氧化酚类物质为醌,对植物的抗虫和抗病起着一定的作用,同时它介导的酶促反应也是烤制中烟草褐变的主要原因。本文采用RT-PCR,成功地从野生烟草(Nicotiana tabacum)叶片中克隆出了PPO c DNA序列。序列分析表明,烟草PPO基因ORF长为1773 bp,编码590个氨基酸,基因登陆号为KC540916,烟草与其他物种PPO的核苷酸序列与氨基酸序列同源性达80%以上,并包含两个高度保守的铜离子结合区域。烟草PPO基因的克隆为烟草的抗性研究和褐化反应的控制研究提供了良好的理论基础。     

烟草PHOT2基因cDNA片段的克隆与RNAi表达载体的构建

采用生物信息学方法,以番茄(Solanum lycopersicum)PHOT2基因序列为探针,比对了烟草(Nicotiana tabacum)EST数据库,并根据获得的同源性较高的EST序列设计引物,PCR扩增了烟草K326PHOT2基因的c DNA片段。结果表明,成功扩增出了PHOT2基因的c DNA片段,并构建了干扰烟草PHOT2基因表达的RNAi表达载体。     

6个植物核糖体失活蛋白新基因片段的克隆及特征分析

通过分析多种不同来源的植物RIPs的氨基酸序列,据其保守区域设计1对植物通用简并引物P1、P2,对基因组进行PCR扩增,分别从海芋Araceae macrorrhiza,烟草Nicotiana tobaccum、剑麻Agavaccae aga-ve、望江南(Cassia occidentalis、那坡指天蕉Musa spp.(BB)、邻水野蕉Musa spp.(AA)中获得1个基因片段.BLAST分析表明:它们推导的氨基酸序列只与多种不同来源的RIPs有相似性.其中,与葫芦科2个代表RIP相应区段的相似性最高,与β-luffin基因的相似性分别为97.2%、98.5%、97.9%、89.4%、97.9%、97.2%,与天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的相似性分别为63.6%、64.5%、64.1%、60.8%、64.8%、和63.6%.多重序列比对发现:6个序列中分别有10、9、11、11、9、10个残基氨基酸与TCS的N-糖苷酶活性位点的残基完全相同,只是残基位置不一致,仅有个别残基发生了变化.所有的N-糖苷酶活性位点都在P1/P2扩增区段内.     

藏猪β-防御素2基因克隆及原核表达载体的构建

为了构建藏猪β-防御素2(pBD-2)成熟肽原核表达载体,从藏猪肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR获取pBD-2目的基因,并与pMD19-T载体连接构建重组质粒,命名为pMD19T-pBD-2;以pMD19T-pBD-2质粒为模板,克隆pBD-2成熟肽c DNA序列并构建成熟肽p ET-32a-pBD-2表达质粒。结果显示,藏猪pBD-2基因全长为298bp,与野猪和家猪的pBD-2基因同源性分别达100.0%和98.9%;藏猪pBD-2基因具有1个完整的开放阅读框,编码69个氨基酸组成的多肽,包含21个氨基酸残基的信号肽、11个氨基酸残基的前导肽和37个氨基酸残基的成熟肽;编码的pBD-2成熟肽稳定性较好,分子量4 085.78,等电点8.89,具有6个半胱氨酸(Cys)残基,7个带正电荷和2个带负电荷的氨基酸残基,为亲脂性和亲水性多肽;从pMD19T-pBD-2质粒中亚克隆得到长度为114 bp藏猪pBD-2成熟肽c DNA序列,菌落PCR、酶切和测序鉴定证明成功构建了成熟肽pET-32a-pBD-2原核表达质粒。     

烟草CSN4基因的原核表达及纯化

以野生型烟草(Nicotiana tabacum)为试验材料,采用RT-PCR克隆获得CSN复合体亚基CSN4c DNA序列,基因登录号为KC866360。序列分析表明,CSN4基因ORF长为1194 bp,编码398个氨基酸,蛋白分子质量为43.78 k Da。将CSN4构建至原核表达载体,获得重组子pET28a-CSN4/BL21(DE3),通过Ni-IDA亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western Blotting检测,结果显示:0.25 mM IPTG,15℃诱导16 h获得浓度为0.476 mg/m L、纯度高达95%的CSN蛋白,为后续CSN4基因功能研究奠定了基础。     

IBV单链抗体的筛选及其互补决定区序列变异分析

【目的】筛选能表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)单链抗体(scFv)的原核阳性克隆,并分析scFv抗原结合位点的氨基酸变化。【方法】采用RT-PCR,从IBV疫苗免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。利用重组链延伸反应(SOE-PCR),将linker与VH和VL基因相连构建鸡scFv基因,并将其克隆到原核表达载体pOPE101-XP中,构建重组质粒并转入大肠杆菌表达,间接ELISA筛选原核表达的抗IBVscFv的阳性克隆,对其测序后进行Clustal.W多序列比较,分析scFv骨架区(FR)和互补决定区(CDR)氨基酸序列差异。【结果】筛选到表达IBVscFv的阳性克隆ZL.10和ZL.80;将它们的氨基酸序列与鸡胚系Gemline进行多序列比较,结果显示,ZL.10、ZL.80在CDR中易变异氨基酸占各区氨基酸的比率均在40%以上,其中VH的CDR3达90%,VL的CDR3达60%。此外,ZL.10、ZL.80在VH的CDR3区分别增加5个和7个氨基酸。FR氨基酸变异率较少,且大多均在12%以下,而FR4未发生突变。【结论】通过体外筛选原核表达产物的方法,获得了表达IBVscFv的阳性克隆ZL.10和ZL.80,其VH、VL氨基酸序列中的变异主要发生在各自的CDR,二者VH的CDR3氨基酸序列差异很大,提示这2个scFv阳性克隆针对的是IBV不同的抗原位点。     

烟草NtPLR1基因克隆与表达分析

维生素B_6(VB_6)在植物体内参与多种生化反应,对植物生长至关重要,吡哆醛还原酶(PLR)是VB_6代谢转换的作用酶,催化吡哆醛(PL)生成吡哆醇(PN),对维持细胞内VB_6的动态平衡发挥重要作用,而PLR在植物中鲜有报道。以拟南芥Arabidopsis thaliana吡哆醛还原酶氨基酸序列At PLR1为模板,在公用数据库通过同源比对获得数条烟草Nicotiana tabacum Nt PLR1基因的片段,结合互补脱氧核糖核酸(c DNA)的末端快速扩增-聚合酶链式反应(RACE-PCR)技术获得了烟草吡哆醛还原酶Nt PLR1基因。该基因全长1 370 bp,编码369个氨基酸残基,预测其编码蛋白的分子量为41 kDa,理论等电点为9.42。氨基酸多序列比对结果表明:Nt PLR1与其他物种的PLR1相似性较高。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析结果表明:外源吡哆醛PL处理时,Nt PLR1表达先升高后降低,在4 d达到顶峰。相应地,高效液相色谱分析结果表明:烟草叶片中PL含量随时间逐渐降低而吡哆醇PN含量逐渐升高,表明Nt PLR1可像酵母PLR一样,催化PL形成PN。此外,定量分析结果表明:Nt PLR1在烟草根、茎和叶片中均有表达,其中在叶片中表达显著高于其他部位(P0.05)。在紫外线、氧化和盐害胁迫下,Nt PLR1的表达与对照相比均显著上调(P0.05),表明Nt PLR1对这3种逆境有响应,可能参与烟草的抗逆过程。将Nt PLR1连入原核表达载体p ET32a,并进行诱导表达,成功表达出目的蛋白。报道的烟草Nt PLR1基因功能为进一步探明植物PLR基因的功能和调控机制以及VB_6的生物合成提供了重要参考。     

溶菌酶基因合成及其原核表达

根据T4噬菌体溶菌酶的氨基酸序列,选用植物偏爱的密码子设计并人工合成了溶菌酶基因,并在N-端加上23个氨基酸残基的α-淀粉酶信号肽序列和信号肽酶切位点HQP;用苷氨酸残基替代C-端的酰胺;新基因全长为576 bp,共编码190个氨基酸.为了检测该基因生物活性,将其克隆到原核表达载体pET28b( )中,导入宿主细菌E. coli BL21(DE3) pLysS,经IPTG诱导后,宿主细菌在2 h内全部被溶菌酶基因的表达产物裂解,说明该溶菌酶基因对细菌具有很强的抗性.     

Virus Location and Lymphocyte Apoptosis in Lymph Nodes of Piglets Infected with PCV-2

The present study has been performed to understand the location of the virus, type of apoptotic cells, and their relation to lymph nodes of piglets infected with porcine circovirus type Ⅱ （PCV-2）. Nine 32-day-old conventional piglets free of infection with PCV-2 were used, and distributed into three groups： control group （n = 3）, piglets inoculated with PCV-2 alone （PCV-2, n = 3）, and PCV-2 inoculated and KLH immunostimulated group （PCV-2 ＋ KLH, n = 3）. Superficial inguinal lymph nodes from all piglets were collected for histological examination after 32 days postinoculation, and immunohistochemistry for PCV-2 detection. Location of apoptotic cells was detected with TdT-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and cell cycle, and the apoptotic rates were measured by flow cytometry. The characteristic histopathological lesions of the piglets in PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH were lymphocyte depletions in the cortex and paracortex of the lymph nodes, epithelioid-like macrophage infiltration, and intracytoplasmic inclusion bodies presented in epithelioid-like macrophages. PCV-2 was mainly found in epithelioid-like macrophages by immunohistochemistry. In the lymph nodes, lymphocytes presented higher apoptotic rates in the cortex by TUNEL, special B-cell areas, and similar apoptotic cells were found in this compartment in the control. The apoptotic rates of the lymph nodes were 0.41, 3.34, and 4.88% in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH groups by flow cytometry, respectively. The apoptotic rates of lymph nodes for PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH piglets were significantly higher than those for the control group （P〈0.05 and P〈0.01）. The proliferation index （PI） was 0.17_＋0.01, 0.12_＋0.01 and 0.12_＋0.04 in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH group, the PI of the control group was higher than that of the other groups, but without the statistical difference. PCV-2 can induce lymphocyte depletion in lymph nodes of piglets by blocking cell proliferation and promoting apoptosis. This is one o     

不同温度LED光萎凋对铁观音MEP上游关键基因和香气的影响

【目的】萜类化合物是乌龙茶挥发性芳香物质的重要组分,2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径（MEP）上游关键基因直接参与调控萜类化合物前体物质的合成。而乌龙茶香气的形成与萎凋工序密切相关,光照和温度是影响萎凋的重要因子,探讨LED光与温度在乌龙茶萎凋过程中对香气的影响,为提高乌龙茶萎凋叶香气品质提供参考。【方法】基于转录组数据,根据KEGG筛选出响应光照的MEP上游关键基因（DXS、DXR、HDS、HDR）。对一芽三叶铁观音鲜叶进行LED白光和不同温度（20℃（L20）、25℃（L25）、30℃（L30）、35℃（L35）和40℃（L40））萎凋处理,黑暗下温度（20℃（D20）、25℃（D25）、30℃（D30）、35℃（D35）和40℃（D40））萎凋处理;分别测定铁观音萎凋叶的香气组分和MEP上游关键基因的相对表达量。【结果】L30处理萎凋叶各基因表达量达到最大值,萜类基因（DXS、DXR、HDS、HDR）表达量分别为XY组（对照）的4.31、5.28、11.77、1.59倍,为D30处理的2.24、2.39、1.86和1.60倍。D30组各基因表达量为黑暗处理组最大,依次为XY组的1.92、2.21、6.34和0.99倍。L20处理萎凋叶的α-法呢烯芳樟醇氧化物（I、II）含量最高,较XY依次提高了15.05%、4.92%和15.13%;L30处理萎凋叶的橙花叔醇、芳樟醇和香叶醇含量最高,较XY组依次提高了3.71%、6.14%和15.28%;LED组铁观音萎凋叶主要香气组分含量均高于相对应的温度处理组。通过主成分分析法建立数学模型,对萎凋叶香气组分进行评估,得出L20组萎凋叶得分最高,L30组萎凋叶次之;与香气分析得出结果一致。【结论】铁观音萎凋叶基因表达量与香气含量的变化趋势不存在同步性;L30处理萎凋叶基因表达量、主要萜类香气物质含量和主成分分析得分均较高,这与铁观音生产上的萎凋温度相一致。萎凋温度过高（40℃）不利于萎凋叶萜类关键基因的表达和萜类化合物的形成。     

民勤绿洲荒漠交错带三种沙丘类型的自然植被特征

基于对民勤沙井子地区植被调查数据,研究了固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘3种沙丘类型的自然植被特征.结果表明:从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘,总盖度、灌木盖度下降,草本盖度增加.物种丰富度减小是物种多样性下降的主要原因.从植物的生活型来看,多年生草本和灌木类植物受沙丘类型的影响最大,而一年生草本和半灌木可存活于不同沙丘类型.白刺的生态优势度(重要值)由小到大依次为固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘.植物多样性与白刺的生态优势度呈负相关.不同沙丘类型白刺地上生物量变化明显,半固定沙丘白刺生物量最大.     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

葡萄盆栽技术

葡萄盆栽技术,包括择土选种、露地扦插、田间管理、装盆及整形、肥水管理等内容,对葡萄盆栽爱好者有一定的指导意义。     

Yield and quality of maize stover: Variation among cultivars and effects of N fertilization

Biomass yields and concentrations of crude protein(CP), ether extract(EE), neutral detergent fiber(NDF), acid detergent fiber(ADF), and crude fiber(CF) were analyzed for five cultivars of summer-sown maize(Zea mays L.) stover grown in field trials at three rates of N fertilization, and sampled immediately after grain harvest.The results revealed differences in yields and concentrations of nutrients according to stalk height and hence harvest portion among the cultivars.N application greatly increased biomass yield and CP, especially in upper stalks and to a lesser extent, EE.Concentrations of NDF and ADF decreased as N rate increased.The results show that stovers from all local popular maize cultivars are suitable as animal fodder and that moderate N application improves feed quality of stover.     

丙草胺与4种磺酰脲类除草剂混用对稻苗安全性的影响

室内测定了丙草胺分别与磺酰脲类除草剂甲磺隆、苄嘧磺隆、醚磺隆和吡嘧磺隆混用后，一叶一心期稻苗抑制50％株高的使用浓度(IC50)和抑制10％株高的使用浓度(IC50)，并用共害系数(CHC)对混用组合安全性的联合作用进行了评价．结果表明：所有混配处理的CHC10均小于12．0，表现出强烈的解毒效应；不同混用处理的CHC50值差异很大，丙草胺与甲磺隆混用的CHC50均小于25．0，解毒效应显著．丙草胺与苄嘧磺隆混配的CHC50为26．1—167．8，丙草胺与苄嘧磺隆混用的CHC50为52.2—115.5，丙草胺与醚磺隆混用的CHC50为80．0—110．2．     

不同阶段肉仔鸡能量需要模型的建立

试验研究了0~8周龄肉仔鸡胴体与羽毛蛋白、脂肪的生长曲线及0~3、4~6和7~8周龄3个阶段每日摄入不同水平的能量及蛋白对其体蛋白、体脂肪沉积的影响,旨在确定胴体与羽毛蛋白、脂肪动态的沉积规律及日粮能量沉积为体蛋白及体脂肪的效率。试验1,包括3个饲养试验分别选取体重相近的0、21和42日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡324只,按性别及日粮随机分为18个处理,每处理3个重复,每重复6只鸡。肉仔鸡每日限量饲喂,饲喂水平分别为正常采食量的90%、70%和50%,每日定量供给肉仔鸡高、中、低3个水平的高蛋白质基础日粮及由饲喂水平决定的定量淀粉,进而使肉仔鸡每日采食能蛋质量比(代谢能/粗蛋白)不同的9种日粮;试验2,选取体重相近的0日龄AA肉仔鸡144只,按性别不同随机分为2个处理,每处理4个重复,每重复18只鸡。试验初和试验末分别进行屠宰,以测定肉仔鸡胴体和羽毛蛋白、脂肪和干物质含量。结果显示:1)Gompertz方程能很好的拟合不同性别肉仔鸡蛋白和脂肪的生长,不同性别间蛋白和脂肪极限重量、羽毛蛋白和脂肪的生长速率差异显著(P<0.05),而胴体蛋白和脂肪的生长速率差异不显著(P>0.05)。2)在0~3、4~6和7~8周...     

ICP-OES法同时测定果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡含量

果蔬样品经混酸消化后,控制一定的酸度,定容后应用等离子体发射光谱法(ICP-OES)对果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡六种有害重金属进行测定,研究了分析测定条件,方法简单快速。测定结果表明,五种元素的加标平均回收率在91.0%~107%之间。其RSD均小于3.5%。按该方法进行处理及测定铅、砷、镉、铬、铜、锡,在选择的测定条件下最低检出限分别为0.0006 mg/kg、0.0003 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.00005 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.0006 mg/kg。     

夹竹桃目植物新资料

本文根据国内外模式标本和文献资料,将亚洲、美洲和大洋洲夹竹桃目植物进行了部分整理和研究,对该目夹竹桃科和萝摩科18属37种作了订正,其中有11种分布新记录,17个新异名,建立15个新名称和1个新组合.