冬瓜枯萎病菌核糖体rDNA ITS区的克隆与序列分析

采用镰刀菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR扩增冬瓜枯萎病菌核糖体基因ITS区,并对产物进行克隆和序列分析;利用Mega 4.1软件对序列及GeneBank中以葫芦科为寄主的镰刀菌不同专化型ITS序列进行聚类。冬瓜枯萎病菌ITS全长1 063 bp,其中包括18S rDNA一部分序列,5.8S rDNA,ITS1和ITS2全部序列及28S rD-NA部分序列。聚类结果将15个菌株ITS序列划分为2个类群,类群I包括4个菌株,分别为2个西瓜枯萎病菌株和2个甜瓜枯萎病菌株;类群II包括11个菌株,其中冬瓜枯萎病菌株就在该类群中,其余为甜瓜枯萎病菌株5个、西瓜枯萎病菌株3个、黄瓜枯萎病菌株、丝瓜枯萎病菌株和葫芦枯萎病菌株各1个。     

柑橘黄龙病菌亚洲种16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区的PCR-RFLP及序列分析

为明确柑橘黄龙病菌的遗传多样性,PCR扩增了6个不同地区黄龙病菌的16SrDNA和16S-23S rDNA间隔区(intergenic spacer regions,ISR),分别通过4种内切酶对其进行了限制性片段长度多态性分析,发现不同分离物的16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区各酶切产物的电泳谱带完全一致,未表现多态性。对16S-23SrDNA ISR进行了克隆和测序,经DNAman和NCBI Blast比对分析发现,6个分离物16S-23SrDNAISR序列之间不存在碱基差异,与数据库中柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)同源性高达99.0%～100%。系统发育分析显示所有的Ca.L.asiaticus归为一个类群,而后与Ca.L.africanus、Ca.L.americanus和Ca.L.psyllaurous组成韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)一个大的类群。结果表明,同一种柑橘黄龙病菌不同分离物16S rDNA和16S-23S rDNAISR无分子变异或变异较小,不存在遗传多样性。     

番茄灰霉病菌拮抗细菌B21的鉴定

对分离于叶片表面能较强抑制番茄灰霉病菌生长的拮抗细菌B21菌株进行了鉴定。通过形态特征、生理生化特征观察,利用PCR技术对菌株B21 16S rDNA序列作全序列分析,序列结果在GeneBank中进行Blast同源序列检索,再用DNAStar软件与Bacillus属的其它种进行同源性分析,结果显示B21与已报道的B. subtilis 16S rDNA序列（登陆号AY172513）有99.93%的相似性,且两者在系统发育树中处于同一个分支。确定B21为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的一个菌株。     

利用Brn1基因分析嘴突脐孢种（Exserohilum rostratum）内变异研究

对形态变异特征较大的嘴突脐孢种Brn1基因核苷酸序列系统发育进行了分析。从系统发育树中可以看出，供试菌株与突脐孢属的其它菌种聚类在同一个分支上，与弯孢属和离蠕孢属的菌种明显区分开，形成了一个独立演化群。利用DNADIST程序计算遗传距离矩阵分析所有供试嘴突脐孢种菌株间的最小遗传距离值和最大遗传距离值分别为0.0078和0.0197，供试嘴突脐孢种菌株间的遗传距离值变化较大，但该种菌株间距离值小于系统树中种内最大遗传距离值0.0242。这一结果表明嘴突脐孢种内不同菌株间的变异属于种内变异。Brn1基因核苷酸序列分析可以用于嘴突脐孢种鉴定。     

高产木糖醇酵母菌的筛选与鉴定

为了获得1株高效转化木糖为木糖醇的酵母菌株,利用从土壤中筛选的酵母菌株转化玉米芯水解液生产木糖醇,经HPLC测得木糖醇产量,对筛选的具有产木糖醇能力的酵母菌株DQ11进行形态学的初步鉴定及26S rDNA序列分析,并以序列同源性为基础构建相关属种的系统发育树。结果表明,该菌株发酵48 h后木糖醇产量为3.34 g/L。同源性分析结果表明,分离株DQ11与季也蒙毕赤酵母菌处于同一进化分支中,相似性达99%以上,因此将筛选的高产木糖醇分离株DQ11鉴定为季也蒙毕赤酵母菌。     

高产木糖醇酵母菌的筛选与鉴定

为了获得1株高效转化木糖为木糖醇的酵母菌株,利用从土壤中筛选的酵母菌株转化玉米芯水解液生产木糖醇,经HPLC测得木糖醇产量,对筛选的具有产木糖醇能力的酵母菌株DQ11进行形态学的初步鉴定及26S rDNA序列分析,并以序列同源性为基础构建相关属种的系统发育树。结果表明,该菌株发酵48 h后木糖醇产量为3.34 g/L。同源性分析结果表明,分离株DQ11与季也蒙毕赤酵母菌处于同一进化分支中,相似性达99%以上,因此将筛选的高产木糖醇分离株DQ11鉴定为季也蒙毕赤酵母菌。     

葡萄炭疽病菌鉴定及同源性分析

为揭示葡萄炭疽病菌种类和遗传特征,给深入研究该病提供科学理论依据。本研究对不同地区的26株葡萄炭疽病菌通过形态学和r DNA-ITS序列分析进行鉴定及同源性研究。利用真菌通用引物ITS4、ITS5对病菌基因组进行PCR扩增,将测序结果与NCBI数据库上已知序列进行比对,同时利用Clustalx 1.83和MEGA 5.0软件进行聚类分析。结果表明:病菌菌落为白色或灰白色,菌丝呈绒状或絮状,分生孢子为圆柱形或圆筒状,单孢,无色;测得病菌ITS序列为500 bp左右,鉴定病原均为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。不同地区葡萄炭疽菌的r DNA-ITS序列同源性高,亲缘关系比较近,但是各菌株间存在着遗传差异,并且菌株之间差异与地理来源和品种无明显的相关性。     

基于COI及28SrDNA序列分析的扶桑绵粉蚧地理种群的遗传分化研究

扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)为危害棉花等经济作物安全生产的一种重要检疫性害虫。本研究分析了我国扶桑绵粉蚧6个地理种群(江苏、安徽、湖北、浙江、广东、广西)线粒体COI及核基因28S rDNA序列,结合中国海南、印度、巴基斯坦、美国地理种群的数据,分析了其可能的遗传分支。结果表明:扶桑绵粉蚧COI有7个单倍型,地理种群间显示出较小的遗传差异;28S rDNA序列在已测的中国六个地理种群中的结果高度保守,从核基因角度佐证了该种可能尚未出现种间分化。基于网络关系进化图、系统进化树分析得出扶桑绵粉蚧存在两个隐存谱系:((中国+印度+巴基斯坦)+美国加州)支系和美国佛罗里达支系;其中安徽及江苏种群应与入侵印度及巴基斯坦的支系为同一遗传支系。该研究结果可为探寻我国扶桑绵粉蚧的遗传进化和可能入侵途径提供参考。     

黄瓜棒孢叶斑病菌的分子鉴定及rDNA-ITS序列分析

为了分析不同地区黄瓜棒孢叶斑病菌的种内分化,能够准确地鉴定该病菌,以服务于黄瓜抗病育种,对2007-2014年采集的黄瓜棒孢叶斑病菌多主棒孢经单孢纯化获得34个菌株。利用公开发表的特异性引物CCF/CCR对其进行了PCR分子鉴定,结果表明:34个菌株均扩增得到了预期272 bp的特异片段,说明均为多主棒孢菌。应用真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1和ITS4分别扩增各个菌株的r DNA内转录间隔区序列,经测序并比对分析,34个菌株均扩增得到了559 bp的特异片段,其中32个从黄瓜上分离的多主棒孢病菌菌株碱基序列完全一致,2个从番茄上分离的菌株碱基序列完全一致,二者的差异在于2个SNP位点T-C、G-A的突变,二者相似度为99.64%。说明,多主棒孢菌属种间的ITS区序列高度保守,利用ITS序列分析方法可以为多主棒孢菌的分类鉴定及系统发育研究提供依据,可以区分出黄瓜和番茄寄主上的多主棒孢菌。     

链格孢属真菌的分子复核鉴定及系统发育研究

为了验证中国林业微生物保藏管理中心库藏链格孢属(Alternaria Nees)菌种资源分类地位的准确性,探索一种链格孢属真菌的快速复核鉴定方法,本研究采用ITS序列分析、NCBI blast以及系统发育分析等方法,对中国林业微生物保藏管理中心库藏链格孢属的36个种及未定种的375个菌株进行分子复核鉴定以及系统发育关系研究。结果表明：本研究的375个菌株中,有21个菌株的分类地位不准确,其中有9株菌的ITS序列与链格孢属菌种的同源性在92%~96%之间,另外12株菌的ITS序列与链格孢属菌种的同源性在60%~85%之间。基于ITS序列构建的NJ树显示,29个小孢子种的37个生物型形成了一个稳定的分支,而6个大孢子种与外群Ulocladium sp.聚在一个分支。本研究中,ITS序列分析可以用来区分和鉴定形态差别明显的大孢子种,但无法区分亲缘关系较近的29个小孢子种。     

Genetic diversity of wild and cultivated soybeans growing in China revealed by RAPD analysis

To evaluate the genetic diversity and to clarify the genetic relationships of wild and cultivated soybeans growing in China, 21 wild soybean accessions and 27 cultivated soybean landraces were analysed by using the random amplified polymorphic DNA method. The data show that wild soybean has a higher genetic variation than cultivated soybean, indicating that genetic variation has been reduced by domestication of wild soybean. Based on Nei's genetic similarity coefficient, all the accessions were classified into two major clusters, corresponding to wild and cultivated varieties of soybean. Furthermore, within each species, the accessions tend to form sub‐clusters that are in agreement with their geographical origins, demonstrating that an extensive geographical genetic differentiation exists in both species. For cultivated soybean, the varieties from the same geographical region but with different seasonal types were found to have closer genetic relationships than varieties from different geographical regions but with the same seasonal type. This result indicates that geographical differentiation plays a key role in the genetic differentiation of both wild and cultivated soybeans. Cultivated soybean varieties with different seasonal types in a region might have been established mainly from the local genotypes.     

山核桃子代甲基化分析及其与薄壳山核桃甲基化的比较

为了研究山核桃的遗传,本研究采用MSAP (Methylation sensitive amplification polymorphism)标记分析了山核桃30个半同胞子代群体及薄壳山核桃29个无性系,并在山核桃亲子代间及山核桃与薄壳山核桃间比较了遗传及甲基化水平。研究发现,山核桃半同胞子代群体非甲基化遗传位点(Non-methylation loci,NML)的比例较高,占33.69%,随后依次是内部胞嘧啶甲基化位点(15.18%)、半甲基化位点(9.25%);其遗传多样性(0.110 3±0.028 4)极显著地小于表观遗传多样性(0.568 5±0.112 3)(p<0.000 1);半同胞子代群体间存在显著的遗传与表观遗传分化,且大部分遗传变异和表观遗传变异存在于群体内,说明亲本间存在遗传差异。甲基化水平在山核桃亲子代间无显著差异(p>0.05),说明甲基化存在代际遗传。山核桃中NML的比例远大于薄壳山核桃,两物种表观遗传多样性相当,但薄壳山核桃的遗传多样性要高于山核桃;两物种遗传和表观遗传差异极显著(p<0.000 1),供试个体基于物种的遗传位点可以分别聚类,说明两物种各自个体间有遗传差异。甲基化敏感位点(Methylation-sensitive loci, MSL)及NML在两物种间存在极显著差异,且变异主要存在于物种内,两物种有明显的分化,但从各遗传参数值来讲,两物种又十分相像,正反交基于亲缘关系可行。不同于山核桃,薄壳山核桃遗传位点对甲基化位点影响极显著。     

稻瘟病菌生理小种消长动态及其变异的研究

1981～1990连续10年进行稻瘟病菌生理小种类群及分布的研究,先后对总计435个菌株鉴定为7群12～18个小种。在明确各地区小种分布的同时,确定各地优势小种一直为ZG群,与生产上栽培品种抗性保持相对稳定的情况相一致。用日本单基因品种对多数菌株进行致病力测定,具有Pi—Z~t,Pi—b,Pi—ta,Pi—ta~2,Pi—K~m基因型的品种致病率较低,对其它基因型品种致病率较高。稻瘟病菌变异的研究表明,从不同地区,不同品种的穗颈稻瘟病斑上分离的单孢,接种鉴定所属小种有差异;同一病斑上多次继代分离的单孢,其生理小种差异也很大。由此证明稻瘟病菌生理小种有很大变异性。     

小麦品种小偃9323抗条锈基因的遗传分析和分子作图

小偃9323是小偃6号的同源材料,具有早熟、抗逆性强、适应性广、抗条锈性强等许多优良的生物学特性。为明确其抗条锈性及遗传规律,利用当前流行的中国条锈菌小种CYR32对抗病品种小偃9323与感病品种铭贤169及其杂交后代F₁、F₂、F₃和BC₁代进行苗期抗条锈性遗传分析,并对其抗条锈基因进行SSR分子标记。结果表明,小偃9323对CYR32小种具有良好的抗性,由1对隐性基因所控制。利用F₂代分离群体,筛选到6个与抗病基因连锁的SSR标记,分别是Xwmc807、Xbarc3、Xwmc684、Xwmc201、Xwmc553和Xwmc179;该抗病基因位于小麦6AL染色体上,其最近的标记为Xwmc201和Xwmc553,遗传距离分别是2.6 cM和3.7 cM。分析表明,该基因不同于已知抗条锈基因,暂被命名为YrXY9323。用YrXY9323两侧遗传距离最近的标记Xwmc201和Xwmc553对42个黄淮麦区主栽小麦品种进行分子检测,结果表明有19%的品种具有与YrXY9323相同的标记位点。本结果对YrXY9323在小麦抗条锈病育种中的应用提供了理论依据。     

江浙地区葡萄霜霉病菌的致病性差异研究

为明确江苏、浙江不同地区葡萄霜霉病菌的致病性分化情况,采用单斑分离法和叶盘接种法,对分离得到的不同葡萄霜霉病菌单斑菌株进行致病性测定。结果表明,分离获得的80个葡萄霜霉病菌株都有致病性,且2个省份均有半数以上的菌株的病情指数在40~60之间。致病力聚类分析表明,2个省份的菌株都可以聚类为强、中、弱3种致病力类型,江苏以强致病力菌株为优势菌株,浙江以中等致病力菌株为优势菌株。对同一省份的菌株进行致病力分析发现,江苏树山和浙江永福的菌株致病力明显强于同省其他地区,而江苏新坊和浙江上钱的菌株与同省其他地区相比,致病力最弱。同时,构建菌株的系统发育树,结果显示,同源性相同的菌株间有致病力不同的情况,致病力相同的菌株间也存在rDNA-ITS序列有差异的情况。综上,江苏、浙江的葡萄霜霉病菌都存在致病力分化现象,这种分化现象与菌株的亲缘关系远近没有相关性,但同一省份不同地区间的菌株致病力差异与菌株的地理来源有一定的相关性。     

用可溶性蛋白电泳法鉴定玉米小斑病菌生理小种

分别从玉米小斑病菌T、C、O三个生理小种的菌丝中提取可溶性蛋白,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),经多次比较试验,T、C、O小种的蛋白质图谱主带基本相同,个别带存在一定差异,而同一生理小种不同菌株间差异甚小.建议运用病原菌蛋白电泳的方法,作为小种分类、病害预测的手段之一.     

中国水稻白叶枯病菌系染色体DNA的RFLP谱型的初析

用２个ＤＮＡ探针ｐＪＥＬ１０１和ｐＢＡＳａｖｒＸａ１０对７８个水稻白叶枯病菌系进行ＲＦＬＰ分型，以分析其群体结构和遗传多样性。分别鉴定出１６种ＲＦＬＰ标记带的谱型。以彼此的带位相似率达８５％为界，可分为簇。参试菌系的群体遗传多样性为０．７７（用ｐＪＥＬ１０１），和０．８３ＲＦＬＰ谱型分析表明：我国多数病原型为杂合组群。白叶枯病菌系的分子表现型的变异，远远大于致病型，两个探针都能有效分析我国菌系的群     

栽培三七内生真菌优势种群分离鉴定

栽培三七为五加科人参属多年生草本药用植物,旨在从药用植物栽培三七中分离出能够产生与宿主植株相同或者相似的生物活性物质的内生真菌菌株。以栽培三七为材料,开展栽培三七内生真菌的分离、纯化,依据传统形态特征并结合真菌的ITS序列进行菌株鉴定。初步从栽培三七中共分离得到内生真菌24株,鉴定为12属（种）,栽培三七不同器官组织的内生真菌种类和数量差异较大,根和叶中最多,茎中较少。其中从叶片中分离出11株,6属;茎中分离出1株,1属;根中12株,5属。统计结果表明叶片中分离出的菌株优势种为普通青霉菌(Penicillium commune)、胶孢刺盘孢菌(Colletotrichum gloeosporioides),均占叶片菌株分离的27.28%;须根中分离出的菌株优势种为球毛壳菌(Chaetomidium arxii),占须根菌株分离的72.73%。栽培三七内生真菌具有丰富的生物多样性,实验结果为进一步探讨栽培三七内生真菌与生理活性物质之间的关系提供材料基础和实验参数。     

水稻品种系对稻瘟病菌生理小种抗性谱测定的研究

每年选用天津市有代表性的7群11～15个稻瘟生理小种,先后对768个品种(系)进行抗谱测定,抗菌率达80～100％有34个品种(系),占供试品种(系)4.4％,抗菌率在60～79％属中等抗病的品种(系)有109个,占14.2％,其余625个品种(系)属感病类型。另外用7群10个小种对抗菌力较高的74个品种(系)进行抗病类型划分,抗菌率在90％有4个类型,抗菌率在80％有3个类型。根据各地优势小种分布选择抗源和供生产上品种轮换种植的参考。以上结果说明抗谱测定是相对稳定的,对生产与育种有实用价值。