高产木糖醇酵母菌的筛选与鉴定

为了获得1株高效转化木糖为木糖醇的酵母菌株,利用从土壤中筛选的酵母菌株转化玉米芯水解液生产木糖醇,经HPLC测得木糖醇产量,对筛选的具有产木糖醇能力的酵母菌株DQ11进行形态学的初步鉴定及26S rDNA序列分析,并以序列同源性为基础构建相关属种的系统发育树。结果表明,该菌株发酵48 h后木糖醇产量为3.34 g/L。同源性分析结果表明,分离株DQ11与季也蒙毕赤酵母菌处于同一进化分支中,相似性达99%以上,因此将筛选的高产木糖醇分离株DQ11鉴定为季也蒙毕赤酵母菌。     

传统山西老陈醋增香酵母菌的筛选及其特性研究

为选育山西老陈醋用微生物发酵剂,从传统发酵工艺生产的山西老陈醋中分离筛选到5株增香酵母菌。结合形态学和酵母菌26S rDNA Dl/D2区序列分析,初步鉴定Y1为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),Y26为毕赤酵母(Pichia scaptomyzae),Y30为假丝酵母(Candida humilis),Y68为红酵母(Rhodotorula sp.),Y70为盔形毕赤酵母(Pichia membranifaciens)。采用固相微萃取和气-质联用技术分析这5株酵母发酵液的主要挥发性成分。结果表明,醇类和酯类挥发性成分种类和组成差异较大;对这5株酵母菌进行耐酸性、乙醇耐受性、高温耐受性发酵试验,结果表明毕赤酵母Y26具有优良的耐酸性、乙醇耐受性。综合其具有高产乙酯类、低产高级醇的特性,毕赤酵母Y26有望开发为山西老陈醋的新型发酵剂。     

木糖还原酶基因克隆及重组表达载体的构建

木糖还原酶是木糖醇生物合成的关键酶,催化木糖合成木糖醇。以实验室筛选并经分子生物学鉴定为季也蒙毕赤酵母的木糖还原酶基因为基础,以酵母表达载体pPICZαA成功构建了含有木糖还原酶的重组表达载体pPICZαA-xyl,为进一步研究真核表达木糖还原酶和木糖醇的生产奠定基础。     

响应面法优化木糖发酵产乙醇酵母发酵条件的研究

以诱变筛选的季也蒙毕赤酵母突变菌株C3-10为研究对象,对其发酵培养条件进行研究。采用响应面法研究了木糖发酵产乙醇酵母突变株不同温度、起始pH值、接种量的影响。结果表明,最佳发酵条件为:温度29℃,起始pH值5.6,接种量5%,在此优化条件下乙醇产量达到15.01%。     

重组葡萄糖氧化酶毕赤酵母高产菌株的高通量快速筛选方法

根据葡萄糖氧化酶的反应原理和毕赤酵母诱导表达的机制,本研究建立了葡萄糖氧化酶毕赤酵母表达菌株筛选方法。首先在MM平板中诱导重组子表达葡萄糖氧化酶,然后添加显色液,阳性酵母菌株周围可见显色圈。经过与传统液体培养筛选方法的比较验证,结果表明,该方法灵敏度高,稳定性和重复性好,筛选结果与传统方法一致。当葡萄糖氧化酶活力介于0–0.1 U/ml的范围内,显色圈的绝对面积与酶活力相关系数可达0.63。该平板筛选方法可以从大量毕赤酵母重组子中快速筛选出表达葡萄糖氧化酶的阳性菌株,并可方便地判断出各菌株之间表达水平的差异。同时,该方法也可为筛选其他重组酶毕赤酵母菌株提供参考。     

过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株的构建

本研究构建了带G418抗性的载体pFL61-G418,从酿酒酵母WT303菌株中克隆了真菌抗逆境基因tps1（海藻糖-6-磷酸合成酶基因）,再将tps1基因插入到pFL61-G418载体的NotI位点,构建pFL61-G418-tps1表达载体,并将该表达载体转化进入野生型拮抗酵母膜醭毕赤酵母菌株中。构建过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株,增强拮抗酵母菌的抵抗逆境的生存能力,从而提高其生活力及与病原菌的竞争力。结果表明成功地构建了过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株,说明pFL61穿梭质粒可以用来转化野生型拮抗酵母,G418抗性可以作为转化子筛选的阳性标记。该重组表达载体的成功构建,为野生型拮抗酵母的遗传改良提供了重要的理论依据。     

6株拮抗酵母对梨毛霉菌(Mucor sp.)和青霉菌(Penicillium sp.)防效测定

采用稀释涂布平板法从拉萨市城关区的12种市售水果中分离酵母菌,并采用平板划线法对酵母菌菌株进行纯化;采用病斑法对皿内抑菌效果较强的6株拮抗酵母进行活体防效测定,并采用26S r DNA D1/D2区域序列测定法对酵母菌进行了分子鉴定。结果表明,193和233号两株酵母对梨毛霉菌(Mucor sp.)有明显的抑菌作用,其发酵液防效强于菌悬液;193号菌株对梨青霉菌(Penicillium sp.)有明显防效,其菌悬液抑菌作用大于发酵液。分子鉴定结果显示,6株酵母菌归为5个种,48号菌株为隐球酵母(Cryptococcus adeliensis),77号为葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum),193号为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii),230和235号为禾本红酵母(Rhodotorula graminis),233号为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。     

发酵木糖高产乙醇酵母菌株的选育

筛选获得的季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)为出发菌株,采用紫外线和亚硝基胍(NTG)复合诱变,筛选高产乙醇突变株。结果表明,紫外诱变菌最佳稀释度为1×10-5,最佳照射时间为25 s;NTG诱变菌最佳稀释度为1×10-6,最佳诱变时间为40 min,经3轮紫外和亚硝基胍(NTG)交替诱变,获得高产乙醇突变株C3-10,其乙醇产量最高为13.2%,比原菌乙醇产量增加了8.05%,5次传代表现出较好的遗传稳定性。     

水貂肠道酵母菌的分离鉴定及系统发育分析

了获得水貂专用的有益菌种,以为研究毛皮动物益生菌制剂提供理论基础。从健康水貂的肠道中分离纯化出2株酵母菌,编号为JM1和JM2,进行了形态学观察、生理生化试验以及26S rDNA基因序列分析,并构建了系统发育进化树,同时对其生长情况和安全性等进行了综合鉴定。传统鉴定方法和26SrDNA D1/D2区序列分析结果表明：JM1为弗比恩毕赤酵母,菌株JM2为酿酒酵母;生长情况结果表明：2菌株在14~30 h生长较快,在30~40 h生长趋于平稳;2菌株培养液中糖度12 h时波美度开始急速下降,并且在26 h后有升高趋势;安全性试验显示：2菌株对小鼠均无毒性,且在2.73×107cfu/mL时小鼠生长速度最快。     

6株副猪嗜血杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

对福建省一些猪场临诊疑似副猪嗜血杆菌感染的病例的病例进行细菌分离鉴定,PCR扩增分离菌株的16S rRNA并进行测序分析,对分离菌进行细菌形态和PCR鉴定及序列分析。结果显示,获得6株副猪嗜血杆菌分离株,该6株分离株之间的同源性在99%以上,而与国内外参考菌株序列之间的同源性在84.5%-99.2%。发育进化树分析结果表明,分离菌株与血清4型和5型的关系较近,与其他血清型关系较远。     

杨梅汁中酿酒酵母的分离、鉴定及生长特性的研究

为筛选得到适合发酵杨梅果酒的酵母菌株,从优质自然发酵杨梅汁中分离筛选到一株酵母Y-9,对该酵母菌进行形态学鉴定、生理生化等试验,结果显示,杨梅酒中的酵母菌为郎比可酒香酵母（Brettanomyces lambicus）。该菌在麦芽汁中的最适生长温度为34℃,最低和最高生长温度分别为10℃和39℃;最适生长pH为4.5,最低和最高生长pH分别为2.5和9.0;耐酒精为14%。     

贝达葡萄酒中酵母菌的分离鉴定

为了获得一株葡萄酒发酵后期的主导菌,试验对贝达葡萄酒中的酵母菌进行分离纯化,经菌落形态鉴定,并进行酵母分离株26SrRNA的PCR扩增,进一步通过基因序列分析进行鉴定。结果显示,贝达葡萄酒的酵母菌菌落总数为3.4×10~7CFU/mL,分离的酵母菌菌株Y3,Y5,Y13均为酿酒酵母。因此,贝达葡萄酒发酵后期的优势菌即为酿酒酵母。     

1株产洛伐他汀红曲菌的筛选和鉴定

为筛选产洛伐他汀菌株,从不同来源的12个红曲米样品中,分离得到56株菌。通过薄层层析法初筛,HPLC复筛,得到5株产洛伐他汀菌株。对其中1株洛伐他汀产量最高的菌株MPT13(0.263 mg/mL)进行个体形态、菌落特征和分子生物学方法鉴定,并与GenBank中已有的有关序列进行比较及系统发育分析,结果鉴定菌株MPT13为紫色红曲霉(Monascus purpure)。     

海南海域海洋红酵母的分离鉴定和应用性能评价

从海南海域的海滩、红树林、渔港码头、产盐滩涂、入海河沟分离海洋红酵母,旨在从中筛选与养殖对象共生的优良菌株。从海南海域分离和纯化海洋红酵母,对海洋红酵母进行形态和生理学及分子生物学的鉴定,大量发酵海洋红酵母,提取分离类胡萝卜素并测定其含量,并将海洋红酵母与鱼虾等养殖对象共培养试验。结果表明,共分离了40多株酵母菌,经形态和生理鉴定以及产类胡萝卜素试验,筛选得到一个高产类胡萝卜素的红酵母属（Rhodotorula）菌株。该菌株在葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母提取物0.3%、核黄素2×10^-6 mol/L、pH 4.5的培养基中,于28℃振荡（180 r/min）培养72 h,其细胞生物产量可达87.55 g/L,类胡萝卜素含量可达520 mg/L;可以在13%高盐和pH 1.0强酸中培养生长;经过与鱼共培养试验,结果显示在合适的菌体浓度条件下,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生。该菌株与鱼共生,显示良好的应用前景,将其应用于盐诱导基因启动子的克隆和盐诱导表达外源基因蛋白（如抗菌肽）的海洋红酵母工程菌的构建,可以更好地应用于水产养殖业。     

酵母双杂诱饵表达载体pGBKT7-ufgt的构建与表达

构建葡萄赤霞珠(Vitis vinifera L.cv Cabernet Sauvignon)花色苷合成前体酶——类黄酮葡萄糖基转移酶(UDPG-flavonoid-3-O-glycosyltranferase,Ufgt)诱饵表达载体。通过RT-PCR扩增获得葡萄ufgt基因CDS序列,与p GBKT7酵母诱饵载体连接;经测序和双酶切鉴定后,转化酵母菌株AH109,分析Ufgt蛋白在酵母菌株中的表达情况。成功扩增出ufgt基因CDS全长,并成功构建了p GBKT7-ufgt,重组载体p GBKT7-ufgt成功的转化到AH109酵母菌株中,且无毒和自激活性,能够正确稳定的表达。p GBKT7-ufgt酵母诱饵蛋白表达载体被成功构建,为后续Ufgt蛋白互作筛选奠定基础。     

苹果采后病害拮抗菌的筛选及鉴定

从陕西各主要苹果产区的苹果植株、果实表面及果园土壤中分离得到211株酵母菌和235株细菌,采用in vivo筛选与in vitro筛选相结合的方法发现,菌株A33对于干腐病（Fusarium oxysporum）、早疫病（Alternaria solani）及拓展青霉（Penicillium expartsum）多种苹果采后真菌病害具有显著拮抗效果。根据其形态特征和生理生化特性以及16SrRNA序列的同源性分析,确认该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）。试验证明,该菌株能够在宿主表面实现有效定殖,具有良好的应用开发潜力。     

副猪嗜血杆菌hhdB基因的鉴定和分析

为了明确副猪嗜血杆菌致病菌株的毒力相关因子,从广东省不同地区发病猪场送检病猪中分离到9株细菌(H1~H9),并对其hhdB基因进行了鉴定和分析。结果显示,所分离的9株细菌经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定为副猪嗜血杆菌阳性,并具有卫星现象和不溶血特征。用hhdB基因引物从分离菌株中扩增到了特异性片段,序列分析表明,所获得的hhdB基因序列与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165的hhdB基因同源性为99%,分离菌株hh-dB基因之间序列同源性为97.5%~99.8%,推导的氨基酸序列与少数放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌的溶血素激活蛋白具有一定的相似性。RT-PCR扩增到了hhdB基因的目的条带,表明该基因在分离菌株中得到了相应的表达。这将为副猪嗜血杆菌致病菌株毒力特征基因的鉴定以及副猪嗜血杆菌致病机理的研究奠定基础。     

馒头酵母的分离与筛选

从27种不同馒头发酵剂中分离出了21株酵母菌,经产酒精能力筛选,获得了11株酵母,进一步研究酵母的产气能力以及发酵速度,获得3株较好的菌株Y3,Y12和Y16,对这3株酵母的抗高温能力、耐酸能力以及面团发酵能力进行了研究。     

樟子松根际土壤解磷细菌的筛选、鉴定及解磷能力

以磷酸钙为难溶态磷,从樟子松根际土壤分离筛选高效解磷细菌,采用透明圈法分离解磷细菌,以解磷效率为指标定量筛选高效菌株,通过生理生化指标测定结合16S rRNA序列系统发育树构建鉴定菌株,并利用单因素方法分析研究不同碳源、氮源及 C/N比值对菌株解磷能力的影响。结果表明:分离筛选得到11株解磷细菌,筛选得到2株高效解磷细菌A43和A54,初步鉴定菌株A43和A54均为Pseudomonas koreensis,A43在碳源为葡萄糖,氮源为硫酸铵,A54在碳源为蔗糖,氮源为硝酸钠,C/N比均为20:1条件下,菌株解磷效果最佳。试验筛选的高效解磷细菌为进一步制备樟子松促生微生物菌肥打下良好基础。     

一株琼胶酶产生菌的筛选与鉴定

利用琼胶作唯一碳源,从腐烂的紫菜中分离筛选到1株高酶活力的琼胶降解细菌Z705。对其菌落形态、生理生化性质和酶活进行了初步研究,并克隆其16S rDNA序列,进行分子鉴定。结果表明：该菌株为革兰氏阴性,呈短杆状;与模式菌株嗜麦寡养食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia（AB008509）的同源性为99%;根据表型特征、生理生化特性和分子鉴定将菌株Z705鉴定为寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）。