金定鸭FSHR基因第1～7外显子的克隆及SNP位点的筛查

动物的繁殖活动主要受内分泌生殖激素的调控,FSHR存在于卵泡颗粒细胞膜上,属于G蛋白偶联受体家族,对动物卵巢细胞的发育、成熟和排卵具有重要的作用。本研究以高产和低产金定鸭基因组为模板,通过PCR扩增、目的基因片段克隆和测序等方法,获取金定鸭FSHR基因1~7外显子序列,并对基因序列进行比对分析。结果显示,序列a包含第1外显子(185bp)的完整序列,第1内含子(145bp)的部分序列;序列b包含第2(75bp)、3外显子(75bp)、第2内含子(463bp)的完整序列,第1(40bp)、3内含子(47bp)的部分序列;序列c包含第4外显子(75bp)的完整序列,第3(180bp)、4内含子(55bp)的部分序列;序列d包含第5外显子(78bp)的完整序列,第4(232bp)、5内含子(56bp)的部分序列;序列e包含第6(69bp)、7外显子(75bp)、第6内含子(117bp)的完整序列,第5(133bp)、7内含子(146bp)的部分序列。根据基因序列特征,对获取的5段金定鸭FSHR基因序列进行扩增序列测序比对。结果发现:在外显子1第50bp处存在A/G突变;在外显子2第30bp处存在A/G突变;在外显子4第33bp处存在C/T突变;在外显子5第45bp处存在A/G突变,第19bp处可能存在A/T突变,33bp处可能存在C/T突变。金定鸭FSHR基因序列的克隆及SNP突变位点的发现可为后续开展FSHR基因的多态性与金定鸭产蛋性能的相关研究奠定一定的基础。     

牦牛GH基因多态性的PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术对天祝白牦牛和青海高原牦牛的生长激素基因(GH基因)5个外显子及部分内含子序列进行遗传变异分析,以探讨牦牛GH基因的遗传特性.结果表明:2个牦牛群体GH基因第1、第2和第4外显子无多态性,第3内含子1694bp处均发生T→C转换,形成A、B2个等位基因,并检测到AA、AB和BB共3种基因型;天祝白牦牛第5外显子2373bp处发生G→T碱基颠换,形成C、D2个等位基因,检测到CC和CD2种基因型,但碱基改变并未引起氨基酸变化,因此这种碱基转换为沉默突变;天祝白牦牛和青海高原牦牛均为低度多态,经Hardy-Weinberg平衡检验2个牦牛群体均处于非平衡状态.     

黑番鸭VIPR-1基因的克隆与多态性分析

VIPR-1基因是研究家禽就巢性状的重要候选基因,VIPR-1基因的克隆和测序能为进一步研究黑番鸭就巢性状的单核苷酸多态性奠定理论基础,为鸭分子遗传育种提供基因素材.本研究以黑番鸭基因组为模板进行PCR扩增,获取黑番鸭VIPR-1基因序列[1 864 bp(序列1)和1 673 bp(序列2)的基因片段],并进行目的基因片段克隆和测序.结果分析表明,序列1包含第5外显子(101 bp)、第5内含子(1 630 bp)及第6外显子(133 bp)的完整序列;序列2包含第12外显子(42 bp)、第12内含子(1 455 bp)的完整序列和第13外显子(176 bp)的部分序列.根据基因序列特征,对获取的2段黑番鸭VIPR-1基因序列分别设计4对引物,进行扩增序列测序比对.结果发现:在序列1第318处、454处存在C/T突变,第547处存在A/G突变,第923处存在A/T突变;序列2第89处、944处存在C/T突变,第662处存在G/A突变,第1 031处存在A/G突变,第1 334处存在A/C突变.黑番鸭VIPR-1基因序列的克隆与单核苷酸多态性SNP突变位点的发现为进一步开展VIPR-1基因的多态性与黑番鸭就巢性状相关研究奠定了基础.     

猪APOBEC3F基因外显子8单核苷酸的多态性及其与猪繁殖和呼吸综合征病毒易感性的关联性

为了研究猪载脂蛋白质B mRNA编辑酶催化多肽3F(APOBEC3F)基因的多态性及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)易感性的影响,对猪APOBEC3F基因外显子3、4、8和内含子3序列进行扩增和测序,筛选多态性位点,分析其与PRRSV易感性的相关性。测序结果发现内含子3的16 bp处发生1个A/G突变和外显子8的5 bp处发生1个G/A突变。针对外显子8的5 bp处发生1个G/A突变建立PCR-RFLP方法,检测9个猪种群共193个样本,发现在定远猪和梅山猪中有GG、GA和AA 3种基因型,在二花脸猪中有GG和GA 2种基因型,其他群体均为GG型。AA基因型猪肺泡巨噬细胞中PRRSV拷贝数在接毒后12 h显著高于GG基因型,极显著高于GA基因型。表明APOBEC3F基因外显子8与PRRSV抗性相关,外显子8的5 bp处G等位基因更有利于抵抗PRRSV的感染。     

牦牛MSTN基因第2外显子的遗传变异分析

研究采用PCR-SSCP方法分析了牦牛MSTN基因第2外显子遗传变异特征.结果表明:在第2外显子以及80bp的部分第1内含子和102bp的部分第2内含子,共556bp的区域中存在5处点突变,表现AA、BB、AB、AC 4种基因型,由A、B和C 3个复等位基因控制.各基因型频率分别为0.884 0、0.001 4、0.106 0和0.008 6.序列分析表明等位基因B在位于第2外显子411bp处发生A→G突变,导致编码的第235位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸,其余4处突变位于等位基因C上,即位于第1内含子31bp处的G→A突变和65bp处的核苷酸缺失以及第2内含子529bp处的A→G突变,还有一处是位于第2外显子第121bp处的T→C沉默突变.     

猪生长激素基因座位BspⅠ、HhaⅠ酶切片段多态特征的研究

生长激素 (ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ ,ＧＨ)在多种生理功能中起着重要的作用 ,对调节动物的新陈代谢、加快生长速度、提高饲料报酬以及改善胴体组成等方面均有显著的作用。猪的生长激素基因已定位于 1 2号染色体的Ｐ1 .2 ～Ｐ1 .5区域内[1 ] ,由 5个外显子和 4个内含子组成 ,基因全长 2 2 31ｂｐ[2 ] 。对该基因遗传多态性的研究报道已经表明 ,在猪生长激素基因的编码区和非编码区的核苷酸序列上存在着差异 ,表现出了丰富的多态性 ,有的碱基突变引起了氨基酸的变异[3～ 6] 。因此本研究采用了ＰＣＲ ＲＦＬＰｓ方法检测了 5个品种猪生长…     

滩羊H-FABP基因序列测定及分析

采集2、4、6、9、12、18月龄共计120只滩羊血液标本,PCR扩增H-FABP基因,进行酶切和测序.结果表明:H-FABP基因在滩羊群体中存在多态性,扩增的目的基因序列长度分别为285 bp、258 bp.通过测序发现外显子2在236、241、249处分别发生了A→C、C→T、T→G的单碱基突变.外显子3在103、164处分别发生了T→C、G→A的单碱基突变.     

德保矮马生长激素基因的克隆与序列分析

克隆和分析德保矮马的生长激素(GH)基因全序列.阳性重组质粒测序表明:德保矮马GH基因碱基序列全长1 922 bp(GenBank登录号为EU939447),包含完整的5个外显子和4个内含子.与纯血马比较,有19个碱基位点突变,其中11个位于外显子区域,有义突变4个,第924位碱基C→T致使第70位氨基酸由Thr→Ile,第1 249位碱基C→T使第112位氨基酸Pro→Leu,第1 287位碱基A→T使第125位氨基酸Ser→Cvs,第1 309位碱基A→C使第132位氨基酸Asp→Ala.以GH编码区构建物种的亲缘进化树,GH基因在进化中比较保守.     

麻疯树油体钙蛋白JcCale26.8基因克隆及序列分析

[目的]克隆麻疯树(Jatrapha curcas)油体钙蛋白基因JcCale26.8全长cDNA序列，探究麻疯树油体钙蛋白及其基因的结构与功能。[方法]应用RNA-seq测序和PCR技术，从麻疯树种子中克隆获得1个油体钙蛋白家族基因JcCale26.8,并进行测序和序列分析。[结果]JcCale26.8基因序列含有6个外显子和5个内含子，内含子剪接位点符合真核生物基因的GT-AG法则。JcCale26.8基因mRNA序列的完整开放阅读框长717 bp,推测编码由238个氨基酸组成、相对分子量为26.8 kD的油体钙蛋白JcCale26.8。JcCale26.8蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲结构构成，并具有油体钙蛋白典型结构特征，与来自蓖麻、川桑和异色山黄麻等多个不同物种的Caleosin蛋白具有较高的同源相似性。[结论]该研究可为麻疯树油体钙蛋白基因的表达调控与功能研究奠定基础。     

大口黑鲈IGF-I基因内含子1、3和4序列多态性研究

根据大口黑鲈IGF-I基因的cDNA序列设计引物,克隆IGF-I基因内含子核苷酸序列,采用PCR产物直接测序方法,在中国养殖群体和美国野生群体中筛选IGF-I基因内含子上的多态位点.应用RFLP、CRS-RFLP和SSCP技术建立多态位点的检测方法,同时比较分析其中4个多态位点在两个群体中基因频率分布.结果表明:(1)IGF-I基因内含子1、3和4序列长分别为1 317 bp、712 bp和1 941 bp;(2)在3个内含子上共发现7个多态位点,其中在内含子1的208和1070位为G-A突变;内含子3的第40个碱基为一个 "A" 的插入-缺失突变,第307位为C-T突变,683位是G-A突变;内含子4上的696碱基处有一个20 bp的插入-缺失突变,在1 563位为G-A突变,表明大口黑鲈IGF-I基因序列上存在较多的SNPs;(3)内含子1上SNP G1070A的A等位基因能为Hind III限制性内切酶识别,采用RFLP技术分型.根据内含子1上SNP G208A侧翼序列,设计错配引物,使错配碱基和A等位基因共同形成Taq I酶切位点,建立CRS-RFLP检测方法.内含子4上SNP G1563A采用SSCP检测方法,同时对内含子4上的插入-缺失突变进行PAGE电泳分型.试验结果显示,RFLP、CRS-RFLP和SSCP三种SNP检测方法简单易行,适于在水产动物SNP标记研究中推广应用;(4)在中国养殖群体中,只有内含子1上的SNP G1070A具有多态性,其它3个多态位点只在美国野生群体中存在多态,证实中国养殖群体的遗传多样性相对较低.     

白羽王鸽泛素(UB)基因的生物信息学分析

[目的]对白羽王鸽泛素基因的cDNA序列进行相关分析。[方法]运用相关生物信息学软件对该基因eDNA序列进行分析和预测,编码蛋白的理化性质及二级结构。[结果]生物信息学分析结果表明,白羽王鸽泛素基因编码区长度为1037bp,编码的多肽由76个氨基酸残基组成,相对分子质量为34．368kD,理论等电点为6．94,二级结构中α-螺旋占24．6％,无规则卷曲占43．3％。B延伸链占32．1％。[结论]通过白羽王鸽泛素基因相关生物学信息分析,为进一步研究泛素基因在白羽王鸽机体内的作用奠定了基础。     

唐鱼生长激素基因的克隆及序列分析

[目的]为开展唐鱼转自源基因研究提供基本构架。[方法]采用RT-PCR和RACE技术分离唐鱼生长激素基因(GH)全长cD-NA序列,同时利用PCR克隆了唐鱼生长激素基因的基因组(gDNA)序列。[结果]序列分析表明:唐鱼GH cDNA的5非编码区为64bp,3非编码区为448 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,共编码210个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。应用MEGA 3.1软件进行序列同源性比较分析的结果显示,唐鱼GH cDNA所编码的氨基酸序列与近缘鱼种(草鱼、青鱼、鳙鱼、鲤鱼、斑马鱼等)的生长激素氨基酸序列有很高的同源性,其中与草鱼和鳙鱼的同源性高达98%。该研究获得的唐鱼生长激素基因的gDNA序列共有1403 bp,包括4个外显子和3个内含子,外显子大小分别150、117、162、204 bp;3个内含子都以GT开头、AG结尾,符合GT-AG法则。[结论]该研究为下一步构建自源GH基因构件,进行唐鱼的转自源GH基因研究,培育出生长快、体型大的唐鱼新品系奠定了基础。     

Genomic structure and sequence polymorphism of E,E-alpha-farnesene synthase gene in apples (Malus domestica Borkh.)

Primer pairs were designed to amplify the genomic DNA sequence of the alpha-farnesene synthase (AFS) gene by PCR. The PCR products were sequenced, spliced and compared to cDNA sequences in the GenBank (accession No. AY182241). The genomic sequence and intron-exon organization of the AFS gene were thus obtained. The AFS genomic sequence has been registered in the GenBank (accession No. DQ901739). It has 6 introns and 7 exons, encoding a protein of 576 amino acids. The sizes of the 6 introns were 108 bp, 113 bp, > 1000 bp, 125 bp, 220 bp and 88 bp, and their phases were 0, 1, 2, 2, 0, 0, respectively. The sizes of the deduced amino acids of the 7 exons were 57, 89, 127, 73, 48, 83 and 99, respectively. The AFS protein contained three motifs: the RR(X8)W motif encoded by a sequence in exon 1, and the RxR motif and DDxxD motif encoded by two sequences in exon 4. After comparing the AFS genomic sequence (accession No. DQ901739) to the cDNA sequence (accession No. AY523409) in the GenBank, it was found that there were 6 single-nucleotide polymorphisms between the two sequences, four of which caused mutations at the amino acid level. Interestingly, one amino acid mutation (291R → RG) was found in the RxR motif, and further investigation is needed to determine whether the alpha-farnesene synthesis ability and superficial scald susceptibility of apples are influenced by this amino acid mutation and other mutations. __________ Translated from Acta Horticulturae Sinica, 2007, 34(4): 1003–1006[译自: 园艺学报]     

芸薹属作物花粉发育相关基因MS1的生物信息学分析

[目的]利用生物信息学分析芸薹属作物MS1基因的结构功能,为作物杂种优势利用提供理论参考.[方法]以拟南芥花粉发育关键基因AtMS1为参考序列,通过BLAST比对获得同源基因序列,运用生物信息学方法对其编码氨基酸序列进行预测分析.[结果]从甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属作物基因组中获得4条同源序列,与AtMS1基因的相似性在88.0%以上,均含有3个外显子,其CDS序列长度均为2004 bp,编码667个氨基酸.4个芸薹属作物MS1蛋白均含有1个植物同源结构域(Plant homeodomain,PHD),属于亲水性不稳定蛋白,定位于细胞核,磷酸化以丝氨酸(Ser)为主,以苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)为辅;二级结构均由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,其中α-螺旋所占比例最高,在40.00%以上,β-转角所占比例最低,仅为10.00%左右;其三级结构大致相同,均为球状的功能结构域.4个芸薹属作物MS1蛋白和AtMS1蛋白序列的相似性为95.69%.4个芸薹属作物MS1蛋白的PHD结构域序列高度保守,仅有3个位点氨基酸残基存在差异.19个不同植物的MS1同源蛋白聚为两大类,其中琴叶拟南芥、亚麻荠、萝卜的MS1蛋白与4个芸薹属作物MS1蛋白及拟南芥AtMS1蛋白聚为一类,均属于十字花科植物,即MS1蛋白的聚类结果与植物系统分类结果相吻合.[结论]芸薹属作物MS1基因属于PHD-finger基因家族,其序列高度保守,参与调控花粉发育成熟过程.     

牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛H-FABP基因进行克隆和序列分析，以期为进一步开展牦牛该基因与其肉质性状的相关分析，进行分子标记辅助选择以及基因定位、表达等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对牦牛H-FABP基因进行PCR扩增并进行T-A克隆和测序，在此基础上使用RepeatMasker、DNAMAN4.0、BioEdit4.8.10、Clustal W1.81等生物信息学软件进行序列分析。【结果】牦牛H-FABP基因(已在NCBI上登录，登录号为DQ026674)由4个外显子和3个内含子组成，CDS序列全长为402 bp，前体氨基酸数为133个。4个外显子大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp；3个内含子大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp；外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。外显子和内含子个数与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种相同。牦牛H-FABP基因序列中，重复序列所占比率为13.07%。内含子Ⅰ含有5个重复元件，包括1个SINE/Artiodactyls元件、1个SINE/MIR3元件、1个SINE/Bov-tA1元件和2个SINE/MIR元件；内含子Ⅱ无重复元件；内含子Ⅲ有3个重复元件，其中SINE/MIR元件、LINE/L2元件、SINE/Artiodactyls元件各1个。SINEs短重复序列所占比率为11.85%，哺乳动物分散性重复序列MIRs比率为6.44%。LINEs所占比率为1.22%，小于SINEs元件。其中，LINE1、BovB/Art2、L3/CR1重复元件以及LTR类反转录元件和DNA转座子元件在牦牛该基因区域中不存在。不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99.8%、97.8%、97.0%、92.8%、88.8%、83.3%、83.1%、76.4%、68.7%；相应的氨基酸序列间同源性大小为100%、96.9%、96.9%、92.4%、88.7%、85.7%、85.7%、77.4%、69.9%。【结论】牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，其中外显子I、外显子Ⅱ、 外显子Ⅲ 和外显子Ⅳ大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp，内含子I、内含子Ⅱ和内含子Ⅲ大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp。牦牛该基因区域含有较为丰富的重复序列元件且外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼9个物种在H-FABP基因编码区核苷酸及氨基酸序列上具有较高的保守性。     

油桐种子FADX基因的克隆和序列分析

[目的]克隆油桐种子FADX基因全长cDNA。对该基因作生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能提供参考。[方法]以未成熟的油桐种子为材料,利用改良TRIzoL法提取总RNA,并根据GenBank中已经登录的α桐酸合成酶基因FADX的序列,设计特异性引物;采用RTPCR方法,克隆得到FADX基因全长cDNA,应用Antheprot软件和InterProScan对该基因进行了生物信息学分析。[结果]该序列5'端和3'端非编码区序列长度分别为13、47 bp,含有1个开放阅读框(14～1 174 bp),编码386个氨基酸,含有典型的脂肪酸脱氢酶结构域;相对分子量是44 343.0,理论等电点为8.33。二级结构预测表明,该蛋白α螺旋含量占29%,β折叠占32%,转角占6%。[结论]该蛋白属于脂肪酸脱氢酶。     

驴生长激素基因cDNA的克隆及生物信息学分析

[目的]研究驴GH基因的特性与功能。[方法]以驴肝组织为材料,设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术克隆驴GH基因cDNA序列。[结果]测序得到706bp的驴GH基因cDNA序列,此序列包含完整的GH基因的阅读框,编码216个氨基酸,驴GH基因编码的蛋白有7个的疏水区域,存在7个跨膜区和信号肽,二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,三级结构包含第27～215位氨基酸残基。[结论]驴GH基因在进化上非常保守,基于CDS序列构建的系统进化树与比较形态学和比较生理学结果一致。     

Molecular Cloning and Characteristics Analysis of ghrelin Gene in Asian Swamp Eel(Monopterus albus)

Ghrelin is an important signaling molecule linking reproductive and energy metabolism. In this study, ghrelin gene of Monopterus albus was cloned. Its structure and function were analysized preliminarily. By Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE) technique, full-length cDNA and DNA sequences of ghrelin gene were obtained. The full-length ghrelin cDNA(GenBank accession no. JX122807) was 552 bp long, containing a 115 bp 5'-untranslated region, a 324 bp open reading frame and a 113 bp 3'-untranslated region. The full-length ghrelin DNA was 1 323 bp, consisting of three introns and four exons. The exon/intron junction sequences conformed to the GT/AG rule. Three introns were 594, 84 and 93 bp in length, respectively; four exons were229, 78, 112 and 133 bp in length, respectively. The results of amino acid sequence analysis showed that the deduced propreghrelin sequence of M. albus contained a signal peptide(SP) consisting of 22 amino acid residues, a mature peptide(MP)consisting of 19 amino acid residues and a C-terminal amino acid residue. Among them, the third amino acid of MP was serine(Ser~3) as the site for N-acylation and N-deacetylation reactions; the C-terminal amino acid residue sequence might contain a peptide hormone obestatin, which is a physiological antagonist of mature Ghrelin peptide. The homology and phylogenic relationships analyses of amino acid sequences suggested that propreghrelin of M. albus had high similarity to those of several Perciformes fishes; the propreghrelins of M. albus, Perciformes and Heterosomata fishes were clustered into a subgroup. The high conservatism of the gene structure and the amino acid sequences indicated that Ghrelin exerts important physiological functions and plays similar physiological mechanisms in vertebrates.     

山葡萄北冰红VvCOR413-I1基因克隆及生物信息学分析

[目的]从山葡萄北冰红中克隆耐寒基因COR413,并对其功能进行生物信息学分析。[方法]利用RT-PCR法克隆山葡萄北冰红基因COR413,并利用生物信息学对其进行分析。[结果]它包括630 bp完整的开放阅读框,推测编码210个氨基酸,蛋白的分子量(MW)为59.18 k D,等电点(p I)值为10.74。其蛋白结构以α-螺旋、延伸链为主,其次为无规则卷曲,β-转角所占比例最少,含有4个跨膜结构域。多重序列比对表明VvCOR413-I1与其他植物COR413的氨基酸序列相似性为63.00%~68.33%。[结论]该研究为深入了解VvCOR413-I1功能奠定了基础。     

革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

[目的]构建革胡子鲶生长激素基因原核表达体系。[方法]采用PCR方法,扩增得到了革胡子鲶生长激素基因成熟肽的cDNA序列,将该序列克隆至原核表达载体pRSET-A,构建重组质粒pRSET-mGH,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。[结果]革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA序列全长534 bp,编码1个由178个氨基酸残基组成的生长激素成熟肽,分子量为20.28 kDa,等电点为5.93。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的目的融合蛋白分子量为27.41 kDa,主要以非可溶性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。目的融合蛋白的表达量高达细菌沉淀蛋白总量的36.8%。[结论]该研究为革胡子鲶生长激素的产业化开发和应用奠定了基础。