不同引物组合对新疆扁桃品种S-基因特异扩增效果比较

[目的]比较供试品种的S-RNase基因不同引物组合扩增效果.[方法]利用已报道的3对蔷薇科通用引物组合,对新疆23个扁桃品种进行自交不亲和S-RNase基因的PCR扩增,比较扩增系数和扩增成功率,评价3对引物组合的扩增效果.[结果]不同的引物组合对供试扁桃品种的扩增系数和扩增成功率差异较大,其中引物组合AS1Ⅱ+ AmyC5R扩增系数和扩增成功率均为最高(84.78;和65.21;),效果最好,其次为PaConsⅡ-F+PaConsⅡ-R引物组合(65.22;和34.78;)和PruC2+ PruC4R引物组合(63.04;和30.43;).[结论]3对蔷薇科S-RNase基因扩增通用引物均可用于扁桃S-RNase的扩增,扩增效果AS1Ⅱ+ AmyC5R最佳,PaConsⅡ-F+PaConsⅡ-R次之,PruC2+ PruC4R最不理想.单一使用某一对引物均不能扩增出供试材料的所有S-RNase基因条带,需多对引物组合使用,必要时需设计扁桃S-RVase扩增专用引物.     

新疆扁桃品种自交不亲和S-Rnases基因型的分析鉴定

[目的]利用特异性PCR扩增、DNA测序和生物信息学方法鉴定新疆扁桃品种的S-Rnases基因型,对新疆扁桃授粉品种配置、人工授粉、遗传改良以及栽培利用都具有重要的理论意义和实践价值.[方法]以新疆24个栽培扁桃品种的叶片为试材,选用目前蔷薇科通用的引物组合对扁桃叶片基因组DNA进行自交不亲和S-RNases基因特异性PCR扩增,克隆测序结果比对分析,综合进行S-Rnases基因型的鉴定.[结果]利用引物组合AmyC5R+AS1Ⅱ对24个新疆栽培扁桃品种的基因组DNA进行S-Rnases基因特异性PCR,共扩增出32条清晰可辨的片段,克隆测序后,通过DNAMAN多重序列比对,发现共包括11个核苷酸序列,大小分别为1 688 bp(Sn1)、1 404 bp(S19)、1 330 bp(S61)、1 222 bp(S24)、1 141 bp(S25)、1 087 bp(S17)、979 bp(S10)、785 bp(S63)、777 bp(S6)、690 bp(S50)、602 bp(S15).[结论]鉴定出了新疆扁桃品种的10个S-Rnases基因型,分别为阿买提(S15S17S63)、红宝石(S15S17)、莎舟(S15S17)、鹰嘴(S10 S24)、矮丰(Sn1S25)、扁石头(Sn1S25)、桃扁桃(S6Sn1)、开心果(S6S61)、双果(S63Sn1)、纸皮(S50S61).     

新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因特异PCR扩增引物的筛选

[目的]筛选鉴定新疆杏自交不亲和相关S-RNase基因的有效引物.[方法]以新疆30个杏品种为试材,选用已报道的蔷薇科李属通用的5对引物组合进行S-RNase基因特异PCR扩增,并依据扩增系数和扩增成功率两个指标对扩增效果进行评价.[结果](1)5对引物组合对30个杏品种均扩出了条带,除了洛浦2号只扩出1条带之外,其余的29个品种都扩增出了两条带;(2)5对引物组合对新疆主栽杏的扩增效果差异较大,其中EM-PC2consFD+EM-PC3consRD的扩增成功率和扩增系数均为最高(86.67;, 95.00;),扩增出两条带的品种有25个;其次,引物组合PaConsⅡ-F+PaConsⅡ-R的扩增成功率达66.67;,扩增系数达83.33;,扩出两条带的品种有20个.[结论]5对引物中EM-PC2consFD+EM-PC3consRD对新疆杏品种S-RNase基因的鉴定效果最好.     

新疆南疆核桃树腐烂病菌鉴定

[目的]明确新疆南疆核桃腐烂病菌种类.[方法]从南疆3个地方采集核桃腐烂病样10份,采用组织分离法分离获得10个分离物,根据科赫氏法则进行致病性测定,结合形态学观察和18 S rDNA-ITS、β-tubulin两个基因序列分析.[结果]经形态学特征鉴定,菌落形态、分生孢子器、分生孢子与已报道的金黄壳囊孢Cytospora chrysosperma一致;从18 S rDNA-ITS、β-tubulin两个基因序列分析可以得出,18 S rDNA-ITS序列分析结果与C.chrysosperma(登录号:KP114125.1)相似性为99;,β-tubulin序列分析结果与C.chrysosperma(登录号:KP117038.1)相似性达到98;.[结论]新疆南疆核桃树腐烂病菌为金黄壳囊孢C.chrysosperma.     

9个欧洲李品种自交不亲和S-RNase 基因的克隆及序列分析

【目的】鉴定9个欧洲李品种自交不亲和S-RNase基因型，为提高生产效率和高效育种提供理论依据。【方法】利用2对蔷薇科通用引物对9个欧洲李品种的叶片基因组DNA进行特异性PCR扩增，片段回收，将克隆测序的结果在GenBank数据库中进行同源性比对并分析序列。【结果】9个欧洲李品种均扩增出2条带，鉴定出9个样品中的8个欧洲李品种的S基因型，其中理查德早生和斯泰勒的S基因型相同为S1S9,法兰西和Silvia的S基因型相同为S1S5,乌孜干1号、总统、Decbrowice和女神的S基因型分别为S1S11、S6SSJ、S1SSJ、SSAS11,塔城酸梅仅鉴定出具有一条S1-RNase等位基因，未能确定出其S基因型。基因频率分析发现S1-RNase基因出现频率最高，S6-RNase和SSA-RNase基因频率最低。欧洲李SSA、S6、S9、SSJ和S5亲缘关系较近，参试李亚科树种的S-RNase基因不能单独聚成一个亚类，而是彼此交错分布在李亚科各个分支中。【结论】欧洲李的S基因型是由2种不同的S等位基因组成，鉴定的9个样品中，有8个欧洲李品种得到完整的S基因型，其中S1-RNase基因出现频率...     

11个中国杏品种S-RNase基因的检测与序列分析

以11个未知基因型的中国杏品种为试材,根据李属植物S-RNase基因保守区设计2对引物组合检测各品种S-RNase基因,共获得22条等位扩增片段,电泳检测表明所有品种的扩增条带集中在300~1100bp的范围内,且表现出一定的长度多态性。序列分析进一步确定22个S-RNase基因为10个不同的等位基因,其中6个为首次发现,根据Gen-Bank中已登陆的杏S-RNase基因的顺序,分别命名为S19、S20、S23、S24、S25、S26,序列登陆号为:EF185300、EF185301、EU037262、EU037263、EU037264、EU037265。推导氨基酸序列的同源分析表明,杏的S-RNase与李属植物的S-RNase表现较高的同源性,为59.3%~100%;与苹果和梨的S-RNase同源性较低,为19.6%~31.6%。试验确定11个中国杏品种资源的自交不亲和基因型分别为:‘大果杏’S19/S20,‘张公园’S24/S25,‘二红’S9/S11,‘黄口外’S11/S26,‘植丸子’S11/S17,‘宇宙红’、‘大丰’S17/S23,‘超仁’、‘虹桥’S8/S11,‘冀光’、‘中华大杏梅’S8/S9;部分品种的田间杂交授粉座果与花粉管荧光显微镜观察证实了所鉴定基因型的可靠性。     

新疆南疆驴源H3N8亚型EIV NA基因序列分析

[目的]明确新疆南疆驴是否感染EIV,及EIV NA基因特征.[方法]根据GenBank登录的EIV基因序列,设计合成1对引物,针对新疆南疆地区2个驴屠宰点33份驴肺进行EIV NA基因RT-PCR扩增、电泳分析、胶回收、测序及序列分析.[结果]中国新疆南疆驴源EIV A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株NA基因长1 413 bp,编码470个氨基酸.与国内外H3N8亚型EIV参考毒株核苷酸同源性为75.2; ～ 99.6;,与国内外参考毒株氨基酸同源性为80;～100;,与国内毒株、哈萨克斯坦毒株和印度毒株在一个进化分支内.与GenBank数据库中唯一一个驴源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)糖基化位点个数和分布位置完全一致.[结论]新疆南疆存在驴感染EIV,可能为国内疫情的延续或周边国家传入.     

利用PCR-SacⅡ-RFLP技术检测绵羊IGFBP-3基因多态性的研究

[目的]将IGFBP-3基因作为候选基因,寻找与绵羊羊毛品质等经济性状相关的SNP位点.[方法]利用PCR-SSCP和DNA测序快速筛查SNP位点;在此基础上建立PCR-RFLP检测方法,分析该位点在不同品种绵羊中的基因型和等位基因分布情况;通过多重比较分析不同基因型与中国美利奴羊部分羊毛性状的关联性.[结果]以绵羊基因组DNA为模板扩增得到了249 bp的特异条带,PCR-SSCP及测序分析显示在该序列的140碱基处发生了G/T突变,导致SacⅡ酶切位点消失.经PCR-SacⅡ-RFLP检测,哈萨克羊和中国美利奴羊细毛羊得到三种基因型:TT(249 bp)、GG(139 bp/110 bp)和TG(249 bp/139 bp/110 bp);杜泊羊中出现GG和TG两种基因型;湖羊、小尾寒羊以及萨福克羊中只有GG一种基因型.关联性分析表明不同基因型与部分羊毛性状没有明显的相关性.[结论]在绵羊IGFBP-3基因嫩含子4区发现一个新的SNP位点,玻建立PCR-SacⅡ-RFLP检测方法;该位点不同等位基因和基因型在不同绵羊品种中的分布具有一定规律性;不同基因型与中国美利奴细毛羊部分羊毛性状中间没有明显的相关性.     

鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

[目的]建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持.[方法]根据GenBank已发表NDV的F基因序列(GenBank登录号JX840454)和APV的F基因序列(GeneBank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性.[结果]优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(LaSota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现.二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA.应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致.随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(GenBank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(GenBank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%.[结论]针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持.     

不同扁桃品种花和叶片矿质营养元素含量分析

[目的]为新疆扁桃营养诊断提供参考依据.[方法]以4个新疆主栽的扁桃品种(纸皮、双软、矮丰、晚丰)为试材,测定花和叶片中(N、P、K、Ca、Mg、B、Zn、Fe、Mn、Cu)10种矿质营养元素含量.[结果]不同扁桃品种花和叶片中10种营养元素的含量均存在显著或极显著水平的差异;不同品种花间10种元素的变异系数B最大(0.078 6),Mg最小(0.016 1),其顺序为B＞P＞ Cu ＞Zn＞Mn＞ Ga＞K＞N＞Fe＞ Mg;不同品种叶片间10种元素的变异系数Ca最大(0.089 3),Mg最小(0.029 3),其顺序为Ca ＞Zn ＞Fe ＞Mn＞ Cu ＞P＞K＞B＞N＞ Mg.[结论]新疆扁桃品种间花和叶片矿质营养元素含量总体变异系数较小(0.01 ～0.09),在大面积扁桃园开展花和叶片营养诊断并指导施肥时,可以不考虑具体品种因素的影响.     

中国樱桃S-RNase基因特异PCR扩增技术体系的研究

利用已报道的李属S-RNase基因特异PCR的2对引物,分别对中国樱桃的5个品种进行了S-RNase基因的PCR扩增。用2对引物先优化PCR体系,然后比较扩增效果。结果表明:2对引物对中国樱桃品种的扩增效果不同。其中,引物EM-PC2consFD+EM-PC3consRD扩增效果最好;其次为PaConsⅠ-F+PaConsⅡ-R引物。因此,EM-PC2consFD+EM-PC3consRD及相应的PCR体系适于中国樱桃S-RNase基因的PCR扩增。本结果建立了中国樱桃S-RNase基因扩增的技术体系,为探讨中国樱桃自交亲和分子基础奠定了技术基础。     

苹果属S-RNase基因的进化研究

【目的】通过分析苹果属植物自交不亲合性位点S-RNase基因的序列,研究S-RNase基因在苹果属的进化历史,序列分歧特点和遗传多态性。【方法】利用栽培苹果的S-RNase基因序列在GenBank数据库中检索和鉴定所有已知的苹果属植物的S-RNase基因,同时利用S-RNase基因的保守引物获得陇东海棠和变叶海棠的S-RNase基因序列。通过系统发育分析研究S-RNase基因的进化历史,进而计算dN/dS比值揭示S-RNase基因序列分歧的特点,最后估计并比较苹果属不同类群S-RNase基因的遗传多态性及其遗传分化。【结果】苹果属植物的S-RNase基因可以分为16个亚类,同一亚类S-RNase基因的序列分歧较小,亚类之间的分歧很大。S-RNase基因的成对dN/dS比值中有50%的大于1,并且滑动窗分析显示S-RNase基因具有多个dN/dS比值显著大于1的区域。栽培苹果和野生苹果在S-RNase基因的遗传多态性上没有明显差异。在所涉及的苹果属野生类群中,栽培苹果与塞威士苹果在S-RNase基因上的遗传分化最小。【结论】适应性氨基酸替换在苹果属植物S-RNase基因的序列分歧上发挥了重要作用。现有的S-RNase基因数据显示栽培驯化没有导致栽培苹果S-RNase基因遗传多态性的降低,基于S-RNase基因的遗传分化支持栽培苹果是由塞威士苹果驯化而来的观点。     

苎麻线粒体基因CoxⅡ和atpA与细胞质雄性不育相关性分析

 【目的】探讨线粒体CoxⅡ和atpA基因与苎麻CMS的关系。【方法】根据GenBank报道的双子叶植物线粒体CoxⅡ和atpA基因编码区高度保守序列设计简并引物,通过PCR技术从苎麻细胞质雄性不育系、保持系和恢复系(简称“三系”)mtDNA中扩增目的基因片段;采用DNA Walking策略从3′端和5′端扩增基因片段的未知侧翼序列,分离完整的线粒体CoxⅡ、atpA基因;基于全基因序列和基因表达(RT-PCR法)分析这两个基因在苎麻“三系”间的差异。【结果】分离的苎麻CoxⅡ和atpA基因片段与GenBank中一些双子叶植物同类基因的同源性分别高达95%和97%以上,获得的CoxⅡ、atpA全基因包含了完整的开放阅读框。“三系”的CoxⅡ基因在mtDNA水平、转录水平、蛋白质水平上均无明显差异。雄性不育系atpA基因在mtDNA水平、氨基酸序列和蛋白质二级结构上与保持系和恢复系存在比较明显的差异;RT-PCR分析还表明,不育系atpA基因在现蕾期和开花后期的表达量明显低于可育系。【结论】CoxⅡ基因与苎麻CMS可能无关,而不育系atpA基因的序列变异和/或异常表达可能与苎麻CMS关系密切。     

甘、芥种间杂交后代DH株系K0959 PEG干旱

【目的】了解甘、芥种间杂交后代抗旱材料K0959在干旱胁迫处理下相关基因的表达情况。【方法】利用cDNA-AFLP技术,以经25% PEG-6000胁迫处理的K0959植株叶片为材料,比较其与非胁迫处理对照的基因表达差异。【结果】从128个引物组合中筛选出16个引物组合,可获得30余条差异片段;经二次扩增,可获得15个大小为102～384 bp、在胁迫中表达的差异片段。通过对片段的克隆测序、同源性比对,15个差异片段中,有7个片段与拟南芥的mRNA同源性较高,其中4个片段（2B, 2D, 3-2B和14B）为非重复的TDFs;1个片段（3D）与甘蓝的同源性较高,1个片段（2C）与甘蓝型油菜的mRNA同源性较高,而6个大小为102～240 bp的片段（D2-1、6A和9-2C等）在GenBank中与已知基因或序列无任何同源性,可能为尚未发现的新基因。其中6个已知功能的TDFs片段分别参与能量、新陈代谢、细胞运输途径以及细胞周期和DNA加工等过程。【结论】获得的差异表达基因对于了解甘、芥种间杂交后代油菜抗旱性形成的调控机制具有参考价值。     

黄独赤霉素受体基因DbGID1s克隆及生物信息学分析

【目的】克隆黄独赤霉素受体（GID1）基因DbGID1s,并对其进行生物学信息分析,为深入探究DbGID1s蛋白在黄独生长发育中的作用机制提供理论参考。【方法】采用RT-PCR技术克隆DbGID1s基因,利用生物信息学软件对其理化性质、结构域、磷酸化位点及系统发育进化进行预测分析。【结果】克隆获得4个DbGID1s基因序列,命名为DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C,GenBank登录号为MT648372、MT648374、MT648375和MT648373,长度分别为862、1273、1081和1164 bp,编码292、340、289和360个氨基酸残基。4个DbGID1s蛋白的分子量为32079.17~40301.83 Da,理论等电点（pI）为6.05~8.62,为不稳定的外在膜亲水性蛋白,不存在信号肽序列,其磷酸化位点主要以丝氨酸（Ser,S）为主,且4个蛋白的磷酸位点均有重合位点和突变位点,不仅具有α/β折叠水解酶超级家族羧酸脂肪酶水解活性区域,还具有激素脂肪酶（HSL）的保守结构域（HGG和GXSXG）和催化联合位点（S、D和H）。DbGID1s蛋白与其他植物GID1蛋白序列具有较高的氨基酸序列相似性,其中与山药的相似性达90%以上。【结论】DbGID1s基因具有多种植物GID1基因的基本特征,其编码的蛋白具有GID1蛋白典型的结构域,其可能参与赤霉素（GA）信号转导,调节黄独的生长发育。     

家蚕eIF2α全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆家蚕eIF2α全长cDNA,分析家蚕抗BmDNV-Z品系、感性品系eIF2α的点突变。【方法】利用荧光差异显示技术,在易感浓核病毒中国镇江株(BmDNV-Z)的家蚕品系华八中获得感性特异条带G13-1b650,通过电子延伸,设计特异引物验证。【结果】克隆了家蚕eIF2α（BmeIF2α）全长cDNA。其全长为1 100 bp（GenBank登录号：DQ073458）,ORF框为999 bp,编码332个氨基酸。BmeIF2α蛋白与草地贪夜蛾eIF2α蛋白同源性高达94.3%。具有保守的磷酸化位点S（51）R（52）R（52）R（54）R（56）K（60）R（63）。BmeIF2α有推定的3个蛋白激酶C磷酸化、5个酪氨酸激酶磷酸化、9个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、3个依赖cAMP与cGMP蛋白激酶磷酸化位点,2个酪氨酸硫酸盐化位点,1个糖基化位点。【结论】家蚕易感品系的eIF2α在113～127位的"H V A E L L H Y E T S E Q S E"为酪氨酸硫酸盐化位点,而完全抗性品系eIF2α发生C378→T突变,导致Ser126→Leu,缺少了113～127位的酪氨酸硫酸盐化位点。     

苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica B.）中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况。【方法】利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达。【结果】测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因（MdNADP-ME1、MdNADP-ME2 和 MdNADP-ME3; GenBank 登录号为JX971883、JX971884和JX971885）,其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域（motif I-V）,含有2个功能结构域：malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNADP-ME1 和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型。荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显。【结论】MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

【目的】拟利用同源序列法分离小麦抗病基因同源片段。【方法】根据已克隆植物抗病（R）基因NBS-LRR保守区段设计两对引物，采用RT-PCR方法对小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr35 的RNA进行扩增。【结果】 获得了3个通读的小麦抗病基因NBS-LRR类抗病基因同源片段PS13-1、PS13-2和S2A2，长度分别为239bp、289bp和539bp，编码78、84和177个氨基酸。核苷酸比较分析表明，PS13-1和PS13-2与已克隆小麦抗白粉病基因PM3b同源性为91%；S2A2与大麦一个来源于mRNA的同源片段同源性为91%；经BLASTp比较，3个片段均含有NB-ARC保守结构域，与已知抗病基因I2C-1，L6，RPS2等相应区域相一致，具有抗病基因NBS特征结构域（P环、激酶2a等）。Northern杂交分析表明，3个同源片段在小麦叶片中为低丰度组成型表达。【结论】本研究在TcLr35小麦中成功获得了抗病基因同源序列，为最终克隆小麦抗叶锈病基因奠定了基础。