兔出血症病毒结构蛋白及其降解产物的分析

采用弗里昂１１３抽提结合庶糖梯度密度离心法从人工感染兔出血症病兔肚脏组织中纯化ＲＨＤ病毒，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，ＲＨＤＶ由一种结构蛋白构成，分子量为６０ＫＤ，称为ＶＰ６０。应用抗ＲＨＤＶ单克隆抗体进行免疫印迹试验表明，ＶＰ６０可发生蛋白降解，其产物有３８ＫＤ、２８ＫＤ和２６ＫＤ几种多肽成分。     

牛痘—RHDV重组病毒对兔病毒性出血症的保护作用

为了预防家兔和野兔病毒性出血症ＲＶＨＤ，用牛痘病毒本哈根株构建 了一株重组牛痘ＲＨＤＶ病毒。此重组病毒表达ＲＨＤＶ衣壳蛋白（ＶＰ６０）。对表达产物分析表明，此重组蛋白的大小为６０ＫＤａ，作为抗原，在免疫沉淀和间接免疫荧光试验中可与抗ＲＨＤＶ抗体反应，用重组病毒免疫接种兔，可产生高水平的抗ＲＨＤＶ特异抗体。通过皮内和口服途径接种，可使免疫动物抵抗ＲＨＤＶ强毒的攻击。     

兔出血症病毒提纯和多肽的比较研究

我们采用了甘油－酒石酸钿梯度离心、琼脂糖４Ｂ层析和ＤＥＡＥ３２离子交换层析等三种方法提纯兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）进行比较，其结果发现ＤＥＡＥ３２离子交换层析效果最好，获得的病毒纯度最高，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗ－Ｂｌｏｔ试验表明，ＲＨＤＶ只有一条蛋白多肽分子量为６１ＫＤ，截然不同于以往国内研究报道的ＲＨＤＶ具有３－６条结构多肽等结果，在国内属首次报道。     

杆状病毒表达的兔出血症病毒衣壳蛋白的自我装配,抗原性及免疫原性

用杆状病毒系统表达了兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）衣壳蛋白。表达产物的分析表明，用抗ＲＨＤＶ抗体的ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ试验可证实６０ＫＤ重组蛋白的抗原性。细胞培养上清和纯化蛋白的直接电镜表明，在昆虫细胞表达的衣壳蛋白可自我装配形成空病毒样粒子（ＶＬＰ），其大小和形态与天然病毒类似。这些病毒粒子与抗ＲＨＤＶ的多克隆抗体以及四个识别病毒构象表位的单克隆抗体（ＭＡｂ）均有免疫反应性。表明ＶＬＰ     

应用单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验检测兔出血症病毒

应用建立的单克隆抗体夹心酶联兔疫吸附试验（ＭｃＡｂ－ＥＬＩＳＡ）,检测了人工感染兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）ＤＪＲＫ细胞毒、肝毒的兔以及自然感染ＲＨＤＶ的兔的组织样品。结果表明,感染死亡兔的肝、脾、肾、骨髓样品病毒抗原的检出率为１００％,淋巴结和肌肉的检出率分别为９７．５％和７９．５％。ＭｃＡｂ－ＥＬＩＳＡ能检出肌肉中血凝试验不能检出的ＲＨＤＶ抗原。此外,还用ＭｃＡｂ－ＥＬＩＳＡ检测了肝毒人工感染兔血中ＲＨＤＶ的动态,并对１０份兔出血症脏器灭活苗的效价作了滴定。     

兔出血症病料中病毒核酸成分的分别鉴别

将兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）感染死亡兔肝反复冻融，分别经氯仿抽提，聚乙二醇（ＰＥＧ）沉淀浓缩，蔗糖垫底超速离心，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ柱层析及蔗糖密度梯度离心，得到纯化的ＲＨＤＶ。电镜观察，ＲＨＤＶ粒子无囊膜，大小为３２～３４ｎｍ，核要酸展层法显示，病毒基因组核酸长度约为７．０ｋｂ。用苯酚抽提法从上述病毒悬液中提取的核酸，在琼脂糖凝胶电泳呈现２条主带，当以λＤＮＡ－ＨｉｎｄⅢ消化物为分子量标准时，它     

兔出血症病料中病毒核酸成分的分析鉴别

将兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）感染死亡兔肝反复冻融，分别经氯仿抽提，聚乙二醇（ＰＥＧ）沉淀浓缩，蔗糖垫底超速离心，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ柱层析及蔗糖密度梯度离心，得到纯化的ＲＨＤＶ。电镜观察，ＲＨＤＶ粒子无囊膜，大小为３２～３４ｎｍ。核酸展层法显示，病毒基因组核酸长度约为７．０ｋｂ。用苯酚抽提法从上述病毒悬液中提取的核酸，在琼脂糖凝胶电泳呈现２条主带；当以λＤＮＡ－ＨｉｎｄⅢ消化物为分子量标准时，它们分别位于相当于２０ｋｂ（Ａ带）和２．０ｋｂ（Ｂ带）的位置。用ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ及Ｓ１核酸酶消化试验分析表明，Ａ带是一种双股ＤＮＡ，而日带为单股ＲＮＡ。在Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中只有Ｂ带可以与德国提供的ＲＨＤＶ－ｃＤＮＡ克隆探针发生杂交反应，而Ａ带不与该探针显示任何反应。此外，用相同方法也可从临床健康兔肝得到在电泳中的表现与Ａ带一致的核酸提取物。本研究表明，在我国流行的ＲＨＤ病料中，出现的约７．０ｋｂ的单股ＲＮＡ是ＲＨＤＶ病原特异的。     

分泌抗兔出血症病毒单抗杂交瘤细胞株的建立

以纯化的兔出血症病毒免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，应用杂交瘤技术获得了分泌抗ＲＨＤＶ单抗杂交瘤细胞１７株，其中有３株杂交瘤细胞分泌单抗的ＥＬＩＳＡ效价为１：４０９６００，１：４０９６；５株单抗具有血凝抑制活性。兔抗ＲＨＤＶ高兔血清对１７株ＭｃＡｂ的ＥＬＩＳＡ抑株为ＩｇＧ２ｂ。各株ＭｃＡｂ与欧洲棕色兔病病毒无抗原交叉反应，也无沉淀反应特性。     

禽白血病／肉瘤病毒群特异性抗原P_（27）~（gag）的分离和纯化

本试验用差束离心和非线性蔗糖密度梯度离心法从感染雏鸡血浆中分离和提纯了禽成髓细胞性白血病病毒（ＡＭＶ）。并以ＳＤＳ法裂解病毒，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＡＭＶ结构蛋白成分，最后选用（ＬＫＢ）水平板式电泳系统，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ比较大量地分离提纯了Ｐｇａｇ２７。用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和琼脂扩散试验检验其抗原活性，并且用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其分子量和纯度。结果表明，提纯的病毒蛋白具有抗原活性，且达到电泳纯。     

减蛋综合征病毒33K蛋白基因克隆及结构分析

纯化的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ水解、０．８％琼脂糖电泳后,回收各ＤＮＡ条带并克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ载体,建立了ＥＤＳＶ基因文库,对３３Ｋ蛋白基因进行了分析。本研究证实,ＥＤＳＶ３３Ｋ蛋白基因含有２个外显子,与羊腺病毒（ＯＡＶ）３３Ｋ蛋白比较,Ｎ端编码产物的同源性为３０．８％,Ｃ端的为６０％。用ＲＴ－ＰＣＲ扩增３３ＫｍＲＮＡ和ｃＤＮＡ克隆及序列分析证实,ＥＤＳＶ３３Ｋ蛋白含有８２碱基（ｎｔ）的内含子,去掉内含子３３Ｋ蛋白基因能形成完整的ＯＲＦ,其编码产物由１７７氨基酸（ａａ）组成,推测分子质量为２．０６×１０４,与人５型腺病毒和ＯＡＶ的同源性分别为２８．１％和４４．７％。     

鸡病毒性关节炎病毒的提纯结构蛋白及其免疫活性分析

采用差速离心和蔗糖递度超速离心法提纯了鸡病毒性关节为病毒（ＡＶＡＶ）９３０７株，并用ＳＤＳ－ＰＡＧ电泳技术分析其结构蛋白，该病毒主要由８条多肽组成（ＶＰ１～ＶＰ８），它们的分子量分别是１４５，１３０，１１５，７２，７０，６５，４２，３９ＫＤ。用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹技术分析这些多肽的免疫活性，与同源病毒株抗血清出现５条可见的反应带，分别是ＶＰ１，ＶＰ２，ＶＰ４，ＶＰ５和ＶＰ７；与异     

用乙型肝炎表面抗原地衣红染色法检测兔出血症病毒

本研究采用乙型肝炎表面抗原地衣红染色法对３０例实验感洒兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）的兔及１０例健康对照兔的肝脏进行切片染色观察，并与免疫胶体金抗体标记及ＳＡＢ免疫组织化学染色结果相比较。结果表明，在感染兔的细胞核及细胞 内可见到颗粒状暗棕色的地衣红染色阳性物质，阳性物质的分布及着色强度与免疫组织化学染色结果相一致。健康对照兔的肝细胞内未见到地衣红阳性反应物质。结果提示：ＲＨＤＶ可能与人类乙型肝炎病毒在     

猪生殖-呼吸道综合征国内分离毒株的病毒纯化及其结构蛋白分析

本研究主要对猪生殖呼吸道综合征（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ） 国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 进行了病毒纯化及其结构蛋白的分析。选用聚乙二醇（ Ｐ Ｅ Ｇ６０００） 沉淀和差速离心法粗提了经 Ｍａｒｃ１４５ 细胞系增殖的猪生殖呼吸道综合征病毒（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ） 。并采用非线性蔗糖密度梯度离心法纯化了 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ, 经免疫电镜观察纯化病毒, 发现有较多的胶体金颗粒吸附在直径为４２ ～７８ｎｍ 的病毒粒子周围。经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定纯化病毒的滴度可达１ １６００ 以上, 并利用 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 两种方法对国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 与欧洲型（ Ｌｅｌｙｓｔａｄ） 、美洲型（ Ｖ Ｒ２３３２） 等参考毒株的病毒结构蛋白组成和部分抗原特性进行了初步的研究。测得国内分离毒株主要结构蛋白的分子量为１４５ Ｋ Ｄ,１９２ Ｋ Ｄ 和２６３ Ｋ Ｄ, 并均能被 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 的高免血清识别, 这与国外的同类报道很相似。     

兔感染非致病性兔出血症样病毒的血清转化研究

某商业兔场已４年未发生兔病毒性出血症（ＲＨＤ），在对２３８只兔的ＲＨＤＶ抗体普查中发现兔血清转化现象，且其原因是由一株与ＲＨＤＶ抗原性相关、但无致病性的嵌杯病毒所致。３１日龄断奶仔兔的阳性率为３３．３％，断奶后５～７天、１３～１４天、１９～２０天、３２～３３天的阳性率分别为２７．６％、５６．１％、９０．３％、１００％。种兔血清全为阳性。种兔和刚奶仔兔的ＲＨＤＶ抗体主要是ＩｇＧ。然而，在断奶后１３～１４天却主要是ＩｇＭ和ＩｇＡ。大龄育肥兔ＩｇＭ和ＩｇＡ减少，ＩｇＧ增多。血清转化时未出现ＲＨＤ特异症状。由此可知，肉兔在断奶后不久就感染了这种非致病性病毒。     

兔出血症淋巴—网状器官的免疫组织化学动态研究

用免疫金银法（ＩＧＳＳ）对兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）在淋巴－网状器官及其靶细胞中的动态分布进行了观察，发现兔出血症（ＲＨＤ）病兔各淋巴－网状器官均有不同量的胶体金颗粒沉着。肝、脾、骨髓阳性反应较强，淋巴－网状组织阳性反应较弱。在淋巴－网状组织中，髓质阳性反应比皮质强，皮质以淋巴滤泡周围为主；淋巴滤泡内仅有个别淋巴细胞呈阳性反应。同时发现病毒主要定位在胞浆中，后期进入细胞间。     

兔出血症水代谢紊乱的研究

用１２只青紫兰兔人工接种兔出血病病毒（ＲＨＤＶ），并于接种前，高温期及频死期分别进行红细胞数，血红蛋白，红细胞压积，红细胞平均容积（ＭＣＶ），红细胞平均血红蛋白（ＭＣＨ），红细胞平均血红蛋白浓度（ＭＣＨＣ）的测定，结果表明接种ＲＨＤＶ后的病兔呈现明显的高渗性脱水。     

禽腺病毒贵州分离株ＨＳ—１的核酸酶切分析与蛋白抗原鉴定

本研究利用１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗestern-Blotting技术鉴定３株不同的减蛋综合征病毒（贵州株ＨＳ－１、南京分离毒ＧＣ２、国际标准毒ＡＶ－１２７）的蛋白抗原性，结果表明，３株毒的蛋白多肽分子量均在１０６－１２kＤ范围,一各条多肽的组成上略有差异；它们都具有两条相同的免疫原性多肽，分子量分别为１０６和１００ＫＤ。同时，运用ＥcoRⅠ,HindⅢ，ＰｓｔⅠ和ＳmaⅠ等５种限制性内切酶进行了酶切分析，证实３株ＥＤＳ病毒用ＰstⅠ和ＳmsⅠ酶切的片段大小及长度略有不同，而其它３种酶的酶切图谱完全相同。     

ST_1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析

用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１５０凝胶和ＤＥ３２离子交换层析，从重组菌ＰＧＥＭＳＴ２株内分离、纯化ＳＴ１肠毒素融合蛋白，回收的ＳＴ１肠毒素融合蛋白占细菌总蛋白量的３１５％。ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳条件呈一条蛋白带。ＳＴ１肠毒素融合蛋白不溶于甲醇、乳鼠试验阴性。对小鼠皮下注射使用安全，对Ｋ９９强毒菌攻击贩保护率达６０％。ＰＧＥＭＳＴ２菌株可以做为预防仔猪腹泻疫苗的候备菌株     

检测禽白血病／肉瘤病毒ELISA双抗体法的研究

用差速离心和非线性蔗糖密度梯度离心法提纯了感染雏鸡血浆中禽成髓细胞性白血病病毒（ＡＭＶ），并用ＳＤＳＰＡＧＥ法提取了ＡＭＶ的结构蛋白Ｐ２７％ｇａｇ，以纯化的Ｐ２７＾ｇａｇ高免家兔，制备了兔抗Ｐ２７＾ｇａｇ的禽白血病／肉瘤病毒群特异性抗体。选用兔抗Ｐ２７＾ｇａｇＩｇＧ作为包被抗体。该抗体和辣根过氧化物酶的结合物作为酶标抗体，以聚苯乙烯微量板为固相载体，建立了监测禽白血病的ＥＬＩＳＡ双抗体法，经试验柱     

用单抗介导的荧光抗体技术检测鸡尿囊细胞内传染性支气管炎病毒的研究

用传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、ＡＲＫ、澳大利亚Ｔ株、野外分离株ＲＳ、ＲＹ及鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ），鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）、减蛋综合症病毒（ＥＤＳＶ）等分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚，３７℃孵育４８小时后，将其尿囊液离心，沉淀用ＰＢＳ悬浮，涂片，用抗ＩＢＶ单抗ＭＣ作一抗、进行间接荧光抗体检测。结果：Ｈ１２Ｏ、Ｈ５２、Ｍ４１“ＡＲＫ、Ｔ株及ＲＳ、ＲＹ均显阳性，而ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＥＤＳＶ均为阴性。结果表明、用此法检测鸡胚尿囊液中ＩＢＶ．具有快速、敏感、特异的优点。